Centre de Documentation Campus Montignies
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Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Helha. Paramédical - Biologie médicale
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Mécanismes de résistance aux aminoglycosides : le rôle du polyphosphate / Margaux Etienne
Titre : Mécanismes de résistance aux aminoglycosides : le rôle du polyphosphate Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Margaux Etienne, Auteur ; Jenny Pouyez, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2022 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La découverte, bien qu’accidentelle, de la pénicilline fut une vraie révolution dans la médecine moderne en offrant une amélioration considérable du confort de vie. Dans la seconde moitié du 20ème siècle, de nombreux antibiotiques ont également pu être identifiés jusque dans les années 80 où ces découvertes s’arrêtent. Cependant, l’utilisation abusive et non appropriée de ces médicaments a causé une pression de sélection telle que cela a permis à des bactéries résistantes de se propager. À ce jour, l’antibiorésistance est un problème de santé publique et est devenue une cause contre laquelle les pouvoirs publics doivent se battre. C’est pourquoi de divers sujets d’études voient le jour pour trouver une solution contre la résistance aux antibiotiques et c’est dans ce projet que s’inscrit l’étude du polyphosphate. Le polyphosphate est un polymère de phosphate inorganique découvert fin du 19ème siècle et qui a été une nouvelle fois décrit à la fin du 20ème siècle. Attribué à de multiples fonctions dans tous les organismes vivants, il a notamment été associé à des mécanismes de résistances aux stress comme les antibiotiques chez les bactéries, par exemple. L’objectif de ce stage est donc de comprendre l’implication du polyphosphate dans les mécanismes de résistances aux antibiotiques, et plus particulièrement dans la résistance aux aminoglycosides chez Escherichia coli. Les aminoglycosides sont des antibiotiques agissant contre la synthèses des protéines. Les précédents résultats obtenus par François Beaufay montrent une sensibilité accrue aux aminoglycosides des mutants d’Escherichia coli dépourvu de polyphosphate par rapport à des souches sauvages. Note de contenu : Table des matières
Remerciements ..................................................................................................................................................
Table des matières .............................................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ........................................................................................................................... 1
Introduction générale ...................................................................................................................................... 2
Partie théorique ............................................................................................................................................... 3
1. Le polyphosphate ................................................................................................................................ 3
1.1. Synthèse et dégradation du polyphosphate ................................................................................ 3
1.2. Le principal rôle du polyphosphate chez les procaryotes : chaperonne ....................................... 4
1.3. Le polyphosphate chez les eucaryotes ........................................................................................ 5
1.4. Polyphosphate kinase, candidat antibiotique.............................................................................. 6
2. La traduction ....................................................................................................................................... 6
2.1. Le ribosome ............................................................................................................................... 7
2.2. Traduction ................................................................................................................................. 8
2.2.1. Initiation de la traduction .................................................................................................. 8
2.2.2. Élongation de la traduction ............................................................................................. 10
2.2.3. Terminaison de la traduction........................................................................................... 11
2.3. Fidélité de la traduction ........................................................................................................... 12
2.4. Le polyphosphate et la traduction ............................................................................................ 13
3. Les antibiotiques ............................................................................................................................... 13
3.1. Le point historique ................................................................................................................... 13
3.2. Généralités .............................................................................................................................. 14
3.3. Aminoglycosides ...................................................................................................................... 16
3.3.1. Mode d’action ................................................................................................................ 16
Objectifs et stratégies .................................................................................................................................... 18
Partie pratique ............................................................................................................................................... 21
1. Matériels et modes opératoires ......................................................................................................... 21
1.1. Milieu LB.................................................................................................................................. 21
1.2. Milieu MOPS Glucose ............................................................................................................... 21
1.3. Milieu M9 ................................................................................................................................ 21
1.4. Extraction plasmidique............................................................................................................. 21
1.5. Préparation de bactéries compétentes ..................................................................................... 22
1.6. Electroporation ........................................................................................................................ 22
1.7. Protocole test ß-galactosidase.................................................................................................. 23
1.8. Transformation TSS ................................................................................................................. 24
1.9. Recombinaison selon la méthode lambda red........................................................................... 25
1.10. Test de survie........................................................................................................................... 29
2. Résultats ........................................................................................................................................... 30
2.1. La création de mutant .............................................................................................................. 30
2.1.1. L’obtention du mutant .................................................................................................... 30
2.2. Corrélation entre le niveau de polyP et le taux d’erreur lors de la traduction ............................ 35
2.3. Identification de candidats complémentant les défauts d’un mutant Δppk ............................... 37
2.3.1. Le séquençage ................................................................................................................ 43
3. Discussion ......................................................................................................................................... 45
Conclusion générale et perspective ................................................................................................................ 48
Abréviations................................................................................................................................................... 50
Liste des figures.............................................................................................................................................. 51
Liste des tableaux........................................................................................................................................... 53
Références ..................................................................................................................................................... 54
Annexes ........................................................................................................................................................Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105770 Mécanismes de résistance aux aminoglycosides : le rôle du polyphosphate [TFE / Mémoire] / Margaux Etienne, Auteur ; Jenny Pouyez, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2022.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur
Langues : Français (fre)
Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La découverte, bien qu’accidentelle, de la pénicilline fut une vraie révolution dans la médecine moderne en offrant une amélioration considérable du confort de vie. Dans la seconde moitié du 20ème siècle, de nombreux antibiotiques ont également pu être identifiés jusque dans les années 80 où ces découvertes s’arrêtent. Cependant, l’utilisation abusive et non appropriée de ces médicaments a causé une pression de sélection telle que cela a permis à des bactéries résistantes de se propager. À ce jour, l’antibiorésistance est un problème de santé publique et est devenue une cause contre laquelle les pouvoirs publics doivent se battre. C’est pourquoi de divers sujets d’études voient le jour pour trouver une solution contre la résistance aux antibiotiques et c’est dans ce projet que s’inscrit l’étude du polyphosphate. Le polyphosphate est un polymère de phosphate inorganique découvert fin du 19ème siècle et qui a été une nouvelle fois décrit à la fin du 20ème siècle. Attribué à de multiples fonctions dans tous les organismes vivants, il a notamment été associé à des mécanismes de résistances aux stress comme les antibiotiques chez les bactéries, par exemple. L’objectif de ce stage est donc de comprendre l’implication du polyphosphate dans les mécanismes de résistances aux antibiotiques, et plus particulièrement dans la résistance aux aminoglycosides chez Escherichia coli. Les aminoglycosides sont des antibiotiques agissant contre la synthèses des protéines. Les précédents résultats obtenus par François Beaufay montrent une sensibilité accrue aux aminoglycosides des mutants d’Escherichia coli dépourvu de polyphosphate par rapport à des souches sauvages. Note de contenu : Table des matières
Remerciements ..................................................................................................................................................
Table des matières .............................................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ........................................................................................................................... 1
Introduction générale ...................................................................................................................................... 2
Partie théorique ............................................................................................................................................... 3
1. Le polyphosphate ................................................................................................................................ 3
1.1. Synthèse et dégradation du polyphosphate ................................................................................ 3
1.2. Le principal rôle du polyphosphate chez les procaryotes : chaperonne ....................................... 4
1.3. Le polyphosphate chez les eucaryotes ........................................................................................ 5
1.4. Polyphosphate kinase, candidat antibiotique.............................................................................. 6
2. La traduction ....................................................................................................................................... 6
2.1. Le ribosome ............................................................................................................................... 7
2.2. Traduction ................................................................................................................................. 8
2.2.1. Initiation de la traduction .................................................................................................. 8
2.2.2. Élongation de la traduction ............................................................................................. 10
2.2.3. Terminaison de la traduction........................................................................................... 11
2.3. Fidélité de la traduction ........................................................................................................... 12
2.4. Le polyphosphate et la traduction ............................................................................................ 13
3. Les antibiotiques ............................................................................................................................... 13
3.1. Le point historique ................................................................................................................... 13
3.2. Généralités .............................................................................................................................. 14
3.3. Aminoglycosides ...................................................................................................................... 16
3.3.1. Mode d’action ................................................................................................................ 16
Objectifs et stratégies .................................................................................................................................... 18
Partie pratique ............................................................................................................................................... 21
1. Matériels et modes opératoires ......................................................................................................... 21
1.1. Milieu LB.................................................................................................................................. 21
1.2. Milieu MOPS Glucose ............................................................................................................... 21
1.3. Milieu M9 ................................................................................................................................ 21
1.4. Extraction plasmidique............................................................................................................. 21
1.5. Préparation de bactéries compétentes ..................................................................................... 22
1.6. Electroporation ........................................................................................................................ 22
1.7. Protocole test ß-galactosidase.................................................................................................. 23
1.8. Transformation TSS ................................................................................................................. 24
1.9. Recombinaison selon la méthode lambda red........................................................................... 25
1.10. Test de survie........................................................................................................................... 29
2. Résultats ........................................................................................................................................... 30
2.1. La création de mutant .............................................................................................................. 30
2.1.1. L’obtention du mutant .................................................................................................... 30
2.2. Corrélation entre le niveau de polyP et le taux d’erreur lors de la traduction ............................ 35
2.3. Identification de candidats complémentant les défauts d’un mutant Δppk ............................... 37
2.3.1. Le séquençage ................................................................................................................ 43
3. Discussion ......................................................................................................................................... 45
Conclusion générale et perspective ................................................................................................................ 48
Abréviations................................................................................................................................................... 50
Liste des figures.............................................................................................................................................. 51
Liste des tableaux........................................................................................................................................... 53
Références ..................................................................................................................................................... 54
Annexes ........................................................................................................................................................Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105770 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Mécanismes de résistance aux aminoglycosides : le rôle du polyphosphate / Myriam Belmahi
Titre : Mécanismes de résistance aux aminoglycosides : le rôle du polyphosphate Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Myriam Belmahi, Auteur ; Nicolas Kesteman, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : aminoglycosides polyphosphate laboratoire génétique et physiologie bactérienne institut de biologie et médecine molécule IBMM Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le développement et l’utilisation d’antibiotique à la moitié du 20e siècle constituèrent une réelle révolution, contribuant à l’augmentation de l’espérance de vie humaine. Cependant, alors la découverte d’antibiotique connu un déclin à partir des années 80, des souches de bactéries résistantes aux antibiotiques commencèrent à se répandre. Ces résistances ont rapidement constitué un problème de santé publique préoccupant la communauté scientifique et les pouvoirs publics qui investissent dans l’exploration de solutions. Cette recherche de solutions contre les bactéries résistantes est très diversifiée et comprend notamment la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, pour le traitement des maladies infectieuses, où l’étude du métabolisme du polyphosphate trouve tout son intérêt. Le polyphosphate est un polymère de phosphate inorganique dont l’étude débuta à la fin du 20e siècle. Il s’agit d’une molécule ubiquitaire liée aux origines de la vie qui a été retrouvée à la fois chez les procaryotes, les eucaryotes et les archées (bien qu’elle ait majoritairement été étudiée chez les procaryotes).
Ce polymère intervient dans un très grand nombre de mécanismes cellulaires mais a surtout souvent été associé aux mécanismes de résistance aux stress. Sa présence chez les bactéries a notamment été associée à une meilleure résistance aux antibiotiques. C’est la raison pour laquelle la synthèse du polyphosphate fait aujourd’hui l’objet d’un grand intérêt en tant que potentielle cible dans la lutte contre les infections bactériennes.
Ce projet de stage a pour but de découvrir le rôle que joue le polyphosphate dans la résistance aux aminoglycosides chez Escherichia coli. En effet, au cours de précédentes recherches, François Beaufay a découvert que l’absence de polyphosphate sensibilisait des souches d’E. coli (K-12 MG1655) à la présence de certains antibiotiques, dont les aminoglycosides (agissantcontre la fidélité de la traduction protéique) mais pas à l’exposition à d’autres antibiotiques agissant sur le blocage de la traduction (tel que le chloramphénicol). Ces observations ont alors suggéré que le polyphosphate pourrait être impliqué dans la fidélité de la traduction des
protéines. De plus, des résultats obtenus par Sarah Willems au cours de son stage à l’IBMM ont montré que les souches d’E. coli incapables de synthétiser le polyphosphate étaient plus sensibles à une exposition à la D-cyclosérine, alors qu’elles ne l’étaient pas à d’autres antibiotiques ciblant la paroi bactérienne (tels que les β-lactamines). Ces observations ont suggéré que la D-cyclosérine pourrait dès lors avoir une cible secondaire, autre que la paroi bactérienne, au niveau de laquelle le polyphosphate pourrait intervenir. Ainsi, le second objectif de ce projet est de tenter de déterminer si cette potentielle cible secondaire de la D-
cyclosérine serait la traduction protéique.Note de contenu : Table des matières
Remerciements...................................................................................................................................0
Table des matières..............................................................................................................................1
Présentation du lieu de stage..............................................................................................................4
Introduction générale .........................................................................................................................5
Partie théorique :................................................................................................................................7
Contexte général.............................................................................................................................7
1. Les antibiotiques : contexte historique ................................................................................7
2. Les antibiotiques : le revers de la médaille...........................................................................7
3. Le polyphosphate ................................................................................................................9
3.1. Origines du polyphosphate ..........................................................................................9
3.2. Rôles et fonctions biologiques du polyphosphate.......................................................10
3.2.1. Synthèse et dégradation du polyphosphate........................................................10
3.2.2. Chaperonne .......................................................................................................11
3.2.3. Rôle dans la réponse au stress............................................................................12
3.2.4. Rôle dans le manque en ressource nutritive .......................................................13
3.2.5. Rôle du polyphosphate dans la traduction bactérienne ......................................14
4. Le peptidoglycane .............................................................................................................14
4.1. Structure du peptidoglycane ......................................................................................15
4.2. Synthèse du peptidoglycane ......................................................................................16
4.2.1. Étapes cytoplasmiques de la synthèse du peptidoglycane ..................................16
4.2.2. Étapes membranaire de la synthèse du peptidoglycane .....................................16
4.2.3. Étapes périplasmique de la synthèse du peptidoglycane ....................................17
5. Antibiotiques agissant sur la synthèse de la paroi bactérienne...........................................18
5.1. Les β-lactamines ........................................................................................................18
5.2. La D-cyclosérine.........................................................................................................18
6. La synthèse protéique chez les bactéries ...........................................................................19
6.1. La traduction bactérienne ..........................................................................................19
6.2. Déroulement de la traduction bactérienne ................................................................19
6.2.1. L’initiation de la traduction chez les procaryotes ................................................19
6.2.2. L’élongation de la traduction chez les procaryotes .............................................20
6.2.3. La terminaison de la traduction chez les procaryotes..........................................21
6.3. Les principaux acteurs de la traduction bactérienne...................................................22
6.3.1. Le ribosome .......................................................................................................22
2
7. La fidélité de la traduction .................................................................................................23
8. Les erreurs de lecture ........................................................................................................24
9. Antibiotiques agissant sur la synthèse protéique ...............................................................24
9.1. Les aminoglycosides...................................................................................................25
9.2. Mutations liées à la résistance aux aminoglycosides ..................................................26
Objectifs et stratégies ...................................................................................................................27
1. Point de départ du stage....................................................................................................27
2. Objectifs du stage ..............................................................................................................28
3. Stratégies mises en place...................................................................................................28
Partie pratique..................................................................................................................................30
Matériels et méthodes..................................................................................................................30
1. Milieux et antibiotiques utilisés .........................................................................................30
1.1. Le milieu LB................................................................................................................30
1.2. Le milieu MOPS glucose .............................................................................................30
1.3. Antibiotiques .............................................................................................................30
2. Les conditions testées........................................................................................................30
3. Protocoles utilisés pour la construction des conditions testées ..........................................31
2.1. Protocole de miniprep ...............................................................................................31
2.2. Prépapration de bactéries compétentes ....................................................................32
2.3. Protocole d’électroporation .......................................................................................33
4. Le test β-galactosidase ......................................................................................................33
3.1. Protocole initial du test β-galactosidase (réalisé en tube de 2 ml) ..............................33
3.2. Protocole finale (utilisé pour les tests en plaques 96 puits) ........................................34
Résultats et discussion ..................................................................................................................35
1. Le test β-galactosidase ......................................................................................................35
1.1. Principe du test β-galactosidase.................................................................................35
1.2. Mise au point du test β-galactosidase ........................................................................35
1.2.1. Bruit de fond trop élevé .....................................................................................35
1.2.2. Problème de reproductibilité des résultats .........................................................37
2. Analyse des résultats des tests β-galactosidase..................................................................39
2.1. Démarche d’analyses des résultats : illustrée à l’aide du pSG 34-11 ...........................39
2.1.1. Calcul de l’activité β-galactosidase (en M.U.)......................................................39
2.1.2. Calcul du taux d’erreur commise lors de la traduction ........................................42
2.2. Analyse des taux d’erreur de lectures des deux autres conditions tests......................43
2.2.1. Taux d’erreur des souches contenant le pSG 627................................................43
2.2.2. Taux d’erreur de lecture des souches avec pSG 12-6 ..........................................44
3
3. Test de la D-cyclosérine .....................................................................................................45
3.1. Création du milieu isotonique ....................................................................................45
3.2. Test β-galactosidase sur les souches exposées à la D-cyclosérine ...............................48
4. Discussions des résultats obtenus......................................................................................50
Conclusions générales et perspectives ..............................................................................................51
Liste des figures ................................................................................................................................53
Bibliographie ....................................................................................................................................56
Annexes..............................................................................................................................................0
Annexe 1.........................................................................................................................................0
Annexe 2.........................................................................................................................................0
Résumé...............................................................................................................................................0
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100295 Mécanismes de résistance aux aminoglycosides : le rôle du polyphosphate [TFE / Mémoire] / Myriam Belmahi, Auteur ; Nicolas Kesteman, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur
Langues : Français (fre)
Mots-clés : aminoglycosides polyphosphate laboratoire génétique et physiologie bactérienne institut de biologie et médecine molécule IBMM Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le développement et l’utilisation d’antibiotique à la moitié du 20e siècle constituèrent une réelle révolution, contribuant à l’augmentation de l’espérance de vie humaine. Cependant, alors la découverte d’antibiotique connu un déclin à partir des années 80, des souches de bactéries résistantes aux antibiotiques commencèrent à se répandre. Ces résistances ont rapidement constitué un problème de santé publique préoccupant la communauté scientifique et les pouvoirs publics qui investissent dans l’exploration de solutions. Cette recherche de solutions contre les bactéries résistantes est très diversifiée et comprend notamment la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, pour le traitement des maladies infectieuses, où l’étude du métabolisme du polyphosphate trouve tout son intérêt. Le polyphosphate est un polymère de phosphate inorganique dont l’étude débuta à la fin du 20e siècle. Il s’agit d’une molécule ubiquitaire liée aux origines de la vie qui a été retrouvée à la fois chez les procaryotes, les eucaryotes et les archées (bien qu’elle ait majoritairement été étudiée chez les procaryotes).
Ce polymère intervient dans un très grand nombre de mécanismes cellulaires mais a surtout souvent été associé aux mécanismes de résistance aux stress. Sa présence chez les bactéries a notamment été associée à une meilleure résistance aux antibiotiques. C’est la raison pour laquelle la synthèse du polyphosphate fait aujourd’hui l’objet d’un grand intérêt en tant que potentielle cible dans la lutte contre les infections bactériennes.
Ce projet de stage a pour but de découvrir le rôle que joue le polyphosphate dans la résistance aux aminoglycosides chez Escherichia coli. En effet, au cours de précédentes recherches, François Beaufay a découvert que l’absence de polyphosphate sensibilisait des souches d’E. coli (K-12 MG1655) à la présence de certains antibiotiques, dont les aminoglycosides (agissantcontre la fidélité de la traduction protéique) mais pas à l’exposition à d’autres antibiotiques agissant sur le blocage de la traduction (tel que le chloramphénicol). Ces observations ont alors suggéré que le polyphosphate pourrait être impliqué dans la fidélité de la traduction des
protéines. De plus, des résultats obtenus par Sarah Willems au cours de son stage à l’IBMM ont montré que les souches d’E. coli incapables de synthétiser le polyphosphate étaient plus sensibles à une exposition à la D-cyclosérine, alors qu’elles ne l’étaient pas à d’autres antibiotiques ciblant la paroi bactérienne (tels que les β-lactamines). Ces observations ont suggéré que la D-cyclosérine pourrait dès lors avoir une cible secondaire, autre que la paroi bactérienne, au niveau de laquelle le polyphosphate pourrait intervenir. Ainsi, le second objectif de ce projet est de tenter de déterminer si cette potentielle cible secondaire de la D-
cyclosérine serait la traduction protéique.Note de contenu : Table des matières
Remerciements...................................................................................................................................0
Table des matières..............................................................................................................................1
Présentation du lieu de stage..............................................................................................................4
Introduction générale .........................................................................................................................5
Partie théorique :................................................................................................................................7
Contexte général.............................................................................................................................7
1. Les antibiotiques : contexte historique ................................................................................7
2. Les antibiotiques : le revers de la médaille...........................................................................7
3. Le polyphosphate ................................................................................................................9
3.1. Origines du polyphosphate ..........................................................................................9
3.2. Rôles et fonctions biologiques du polyphosphate.......................................................10
3.2.1. Synthèse et dégradation du polyphosphate........................................................10
3.2.2. Chaperonne .......................................................................................................11
3.2.3. Rôle dans la réponse au stress............................................................................12
3.2.4. Rôle dans le manque en ressource nutritive .......................................................13
3.2.5. Rôle du polyphosphate dans la traduction bactérienne ......................................14
4. Le peptidoglycane .............................................................................................................14
4.1. Structure du peptidoglycane ......................................................................................15
4.2. Synthèse du peptidoglycane ......................................................................................16
4.2.1. Étapes cytoplasmiques de la synthèse du peptidoglycane ..................................16
4.2.2. Étapes membranaire de la synthèse du peptidoglycane .....................................16
4.2.3. Étapes périplasmique de la synthèse du peptidoglycane ....................................17
5. Antibiotiques agissant sur la synthèse de la paroi bactérienne...........................................18
5.1. Les β-lactamines ........................................................................................................18
5.2. La D-cyclosérine.........................................................................................................18
6. La synthèse protéique chez les bactéries ...........................................................................19
6.1. La traduction bactérienne ..........................................................................................19
6.2. Déroulement de la traduction bactérienne ................................................................19
6.2.1. L’initiation de la traduction chez les procaryotes ................................................19
6.2.2. L’élongation de la traduction chez les procaryotes .............................................20
6.2.3. La terminaison de la traduction chez les procaryotes..........................................21
6.3. Les principaux acteurs de la traduction bactérienne...................................................22
6.3.1. Le ribosome .......................................................................................................22
2
7. La fidélité de la traduction .................................................................................................23
8. Les erreurs de lecture ........................................................................................................24
9. Antibiotiques agissant sur la synthèse protéique ...............................................................24
9.1. Les aminoglycosides...................................................................................................25
9.2. Mutations liées à la résistance aux aminoglycosides ..................................................26
Objectifs et stratégies ...................................................................................................................27
1. Point de départ du stage....................................................................................................27
2. Objectifs du stage ..............................................................................................................28
3. Stratégies mises en place...................................................................................................28
Partie pratique..................................................................................................................................30
Matériels et méthodes..................................................................................................................30
1. Milieux et antibiotiques utilisés .........................................................................................30
1.1. Le milieu LB................................................................................................................30
1.2. Le milieu MOPS glucose .............................................................................................30
1.3. Antibiotiques .............................................................................................................30
2. Les conditions testées........................................................................................................30
3. Protocoles utilisés pour la construction des conditions testées ..........................................31
2.1. Protocole de miniprep ...............................................................................................31
2.2. Prépapration de bactéries compétentes ....................................................................32
2.3. Protocole d’électroporation .......................................................................................33
4. Le test β-galactosidase ......................................................................................................33
3.1. Protocole initial du test β-galactosidase (réalisé en tube de 2 ml) ..............................33
3.2. Protocole finale (utilisé pour les tests en plaques 96 puits) ........................................34
Résultats et discussion ..................................................................................................................35
1. Le test β-galactosidase ......................................................................................................35
1.1. Principe du test β-galactosidase.................................................................................35
1.2. Mise au point du test β-galactosidase ........................................................................35
1.2.1. Bruit de fond trop élevé .....................................................................................35
1.2.2. Problème de reproductibilité des résultats .........................................................37
2. Analyse des résultats des tests β-galactosidase..................................................................39
2.1. Démarche d’analyses des résultats : illustrée à l’aide du pSG 34-11 ...........................39
2.1.1. Calcul de l’activité β-galactosidase (en M.U.)......................................................39
2.1.2. Calcul du taux d’erreur commise lors de la traduction ........................................42
2.2. Analyse des taux d’erreur de lectures des deux autres conditions tests......................43
2.2.1. Taux d’erreur des souches contenant le pSG 627................................................43
2.2.2. Taux d’erreur de lecture des souches avec pSG 12-6 ..........................................44
3
3. Test de la D-cyclosérine .....................................................................................................45
3.1. Création du milieu isotonique ....................................................................................45
3.2. Test β-galactosidase sur les souches exposées à la D-cyclosérine ...............................48
4. Discussions des résultats obtenus......................................................................................50
Conclusions générales et perspectives ..............................................................................................51
Liste des figures ................................................................................................................................53
Bibliographie ....................................................................................................................................56
Annexes..............................................................................................................................................0
Annexe 1.........................................................................................................................................0
Annexe 2.........................................................................................................................................0
Résumé...............................................................................................................................................0
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100295 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Microbiologie revisitée : quels avantages des panels multiplex pour le diagnostic des entéropathogènes ? / Wythney Fostier
Titre : Microbiologie revisitée : quels avantages des panels multiplex pour le diagnostic des entéropathogènes ? Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Wythney Fostier, Auteur ; Julie Schmitz, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale CNDG Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Remerciements
Présentation du lieu de stage
Introduction ................................................................................................................................................... 7
1. Contexte général ................................................................................................................................... 8
1.1. La gastro-entérite ................................................................................................................................ 8
1.2. La flore gastro-intestinale .................................................................................................................... 9
1.3. Les entéropathogènes ........................................................................................................................ 10
1.3.1. Les bactéries responsables de gastro-entérites ............................................................................ 10
1.3.2. Les virus responsables de gastro-entérites ................................................................................... 19
1.3.3. Les parasites responsables de gastro-entérites ............................................................................ 21
1.4. Principe de recherche d’entéropathogènes ....................................................................................... 25
1.4.1. Description de la PCR .................................................................................................................... 25
1.4.2. Description de la PCR en temps réel ............................................................................................. 26
2. Objectifs et stratégie ........................................................................................................................... 27
3. Matériel et méthodes .......................................................................................................................... 28
3.1. Les méthodes conventionnelles ......................................................................................................... 28
3.1.1. La recherche de bactéries ............................................................................................................. 28
3.1.2. La recherche de virus .................................................................................................................... 31
3.1.3. La recherche de parasites ............................................................................................................. 31
3.2. Application sur les automates de biologie moléculaire ..................................................................... 32
3.2.1. Description du BD MAXTM ............................................................................................................. 32
3.2.2. Description de l’ELITe InGeniusÒ ................................................................................................. 35
3.2.3. Comparaison entre le BD MAXTM et l’ELITe InGeniusÒ ................................................................ 38
4. Résultats et discussions ....................................................................................................................... 39
4.1. Étude sur le BD MAXTM ....................................................................................................................... 39
4.1.1. Population ..................................................................................................................................... 39
4.1.2. Résultats et discussion .................................................................................................................. 42
4.2. Étude de l’ELITe InGeniusÒ ................................................................................................................ 48
4.2.1. Population ..................................................................................................................................... 48
4.2.2. Résultats et discussions ................................................................................................................ 50
Conclusion ................................................................................................................................................... 53
Abréviations ................................................................................................................................................. 54
Liste des figures ............................................................................................................................................ 55
Liste des tableaux ......................................................................................................................................... 56
Bibliographie ................................................................................................................................................ 57
Annexes
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79989 Microbiologie revisitée : quels avantages des panels multiplex pour le diagnostic des entéropathogènes ? [TFE / Mémoire] / Wythney Fostier, Auteur ; Julie Schmitz, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale CNDG Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Remerciements
Présentation du lieu de stage
Introduction ................................................................................................................................................... 7
1. Contexte général ................................................................................................................................... 8
1.1. La gastro-entérite ................................................................................................................................ 8
1.2. La flore gastro-intestinale .................................................................................................................... 9
1.3. Les entéropathogènes ........................................................................................................................ 10
1.3.1. Les bactéries responsables de gastro-entérites ............................................................................ 10
1.3.2. Les virus responsables de gastro-entérites ................................................................................... 19
1.3.3. Les parasites responsables de gastro-entérites ............................................................................ 21
1.4. Principe de recherche d’entéropathogènes ....................................................................................... 25
1.4.1. Description de la PCR .................................................................................................................... 25
1.4.2. Description de la PCR en temps réel ............................................................................................. 26
2. Objectifs et stratégie ........................................................................................................................... 27
3. Matériel et méthodes .......................................................................................................................... 28
3.1. Les méthodes conventionnelles ......................................................................................................... 28
3.1.1. La recherche de bactéries ............................................................................................................. 28
3.1.2. La recherche de virus .................................................................................................................... 31
3.1.3. La recherche de parasites ............................................................................................................. 31
3.2. Application sur les automates de biologie moléculaire ..................................................................... 32
3.2.1. Description du BD MAXTM ............................................................................................................. 32
3.2.2. Description de l’ELITe InGeniusÒ ................................................................................................. 35
3.2.3. Comparaison entre le BD MAXTM et l’ELITe InGeniusÒ ................................................................ 38
4. Résultats et discussions ....................................................................................................................... 39
4.1. Étude sur le BD MAXTM ....................................................................................................................... 39
4.1.1. Population ..................................................................................................................................... 39
4.1.2. Résultats et discussion .................................................................................................................. 42
4.2. Étude de l’ELITe InGeniusÒ ................................................................................................................ 48
4.2.1. Population ..................................................................................................................................... 48
4.2.2. Résultats et discussions ................................................................................................................ 50
Conclusion ................................................................................................................................................... 53
Abréviations ................................................................................................................................................. 54
Liste des figures ............................................................................................................................................ 55
Liste des tableaux ......................................................................................................................................... 56
Bibliographie ................................................................................................................................................ 57
Annexes
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79989 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Mise au point du dosage du cortisol libre urinaire par UHPLC et détection de masse / Quentin Dhesse
Titre : Mise au point du dosage du cortisol libre urinaire par UHPLC et détection de masse Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Quentin Dhesse, Auteur ; Luc Blockx, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : CHU UCL Namur Mont Godinne Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Ce travail de fin d’études consiste à la mise au point du dosage de cortisol urinaire par UHPLC et par détection de masse. Actuellement, le laboratoire n’effectue pas le dosage du cortisol urinaire au sein de ses installations. Les échantillons à analyser sont envoyés à un autre laboratoire. Afin d’éviter cet envoi et étant donné que le laboratoire dispose du matériel nécessaire à ce type d’analyse, il a été décidé de mettre au point une méthode de dosage du cortisol. Le choix de l’utilisation de l’UHPLC par rapport à l’HPLC se base sur le fait qu’il consomme moins de phase mobile et qu’il permet des temps d’analyses plus courts. Le détecteur employé est le QDa qui permet de détecter les molécules d’intérêts en fonction de leur masse permettant d’éliminer de nombreux pics interférents. Pour la mise en place de ce dosage, un protocole de base a été choisi à partir de la littérature existante. Les conditions chromatographiques ont d’abord été mises au point et optimisées par l’analyse de solutions pures. Dans ce protocole, il a fallu mettre en place une extraction et optimiser celles-ci : pH de l’échantillon, nature du solvant d’élution et les conditions de l’évaporation du solvant d’élution. Les résultats de la mise au point sont l’obtention de chromatogrammes où les pics d’intérêts sont isolés et quantifiables. La méthode doit être validée pour pouvoir être mise en routine au sein du laboratoire et pour cela, la limite de détection, la limite de quantification, la linéarité, la répétabilité, la reproductibilité, la robustesse, la contamination, la récupération et la corrélation ont été analysées. Tous les paramètres ont été validés sauf la corrélation par manque d’analyse. La suite de ce travail de fin d’études est la validation de la corrélation afin de compléter la validation de la méthode de dosage qui permettra de réaliser celui-ci au sein du laboratoire. Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage.................................................................................................................................... 7
Introduction :............................................................................................................................................................. 8
Partie théorique......................................................................................................................................................... 9
1. Le cortisol ...................................................................................................................................................... 9
2. Dosage du cortisol urinaire.......................................................................................................................... 10
2.1. Indication............................................................................................................................................. 10
2.2. Méthode de dosage............................................................................................................................. 10
2.3. Valeurs de références.......................................................................................................................... 11
3. Syndrome de Cushing.................................................................................................................................. 11
3.1. Signes cliniques.................................................................................................................................... 11
3.2. Cause du syndrome de Cushing........................................................................................................... 12
3.3. Tests de diagnostic .............................................................................................................................. 12
3.4. Le traitement ....................................................................................................................................... 14
4. Fonctionnement de l’HPLC ET UHPLC ......................................................................................................... 14
4.1. Théorie de la chromatographie ........................................................................................................... 14
4.2. Comparaison de l’HPLC ET l’UHPLC ..................................................................................................... 14
4.3. Appareillage......................................................................................................................................... 15
5. Développement de méthode ...................................................................................................................... 19
5.1. Conditions chromatographiques ......................................................................................................... 19
5.2. Extraction de l’analyte......................................................................................................................... 21
6. Validation de méthode ................................................................................................................................ 23
6.1. La limite de détection .......................................................................................................................... 23
6.2. La limite de quantification................................................................................................................... 24
6.3. La linéarité ........................................................................................................................................... 24
6.4. La répétabilité...................................................................................................................................... 25
6.5. La reproductibilité ............................................................................................................................... 25
6.6. La robustesse ....................................................................................................................................... 26
6.7. La contamination................................................................................................................................. 26
6.8. La récupération.................................................................................................................................... 27
6.9. La corrélation....................................................................................................................................... 28
Partie pratique......................................................................................................................................................... 29
1. Objectif et stratégie..................................................................................................................................... 29
2. Matériel et méthode ................................................................................................................................... 30
2.1. Matériel ............................................................................................................................................... 30
2.2. Méthode .............................................................................................................................................. 31
3. Résultats et discussion ................................................................................................................................ 33
3.1. Développement de la méthode chromatographique.......................................................................... 33
3.2. Validation de la méthode chromatographique ................................................................................... 43
Conclusion ............................................................................................................................................................... 54
Bibliographie............................................................................................................................................................ 55
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100363 Mise au point du dosage du cortisol libre urinaire par UHPLC et détection de masse [TFE / Mémoire] / Quentin Dhesse, Auteur ; Luc Blockx, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : CHU UCL Namur Mont Godinne Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Ce travail de fin d’études consiste à la mise au point du dosage de cortisol urinaire par UHPLC et par détection de masse. Actuellement, le laboratoire n’effectue pas le dosage du cortisol urinaire au sein de ses installations. Les échantillons à analyser sont envoyés à un autre laboratoire. Afin d’éviter cet envoi et étant donné que le laboratoire dispose du matériel nécessaire à ce type d’analyse, il a été décidé de mettre au point une méthode de dosage du cortisol. Le choix de l’utilisation de l’UHPLC par rapport à l’HPLC se base sur le fait qu’il consomme moins de phase mobile et qu’il permet des temps d’analyses plus courts. Le détecteur employé est le QDa qui permet de détecter les molécules d’intérêts en fonction de leur masse permettant d’éliminer de nombreux pics interférents. Pour la mise en place de ce dosage, un protocole de base a été choisi à partir de la littérature existante. Les conditions chromatographiques ont d’abord été mises au point et optimisées par l’analyse de solutions pures. Dans ce protocole, il a fallu mettre en place une extraction et optimiser celles-ci : pH de l’échantillon, nature du solvant d’élution et les conditions de l’évaporation du solvant d’élution. Les résultats de la mise au point sont l’obtention de chromatogrammes où les pics d’intérêts sont isolés et quantifiables. La méthode doit être validée pour pouvoir être mise en routine au sein du laboratoire et pour cela, la limite de détection, la limite de quantification, la linéarité, la répétabilité, la reproductibilité, la robustesse, la contamination, la récupération et la corrélation ont été analysées. Tous les paramètres ont été validés sauf la corrélation par manque d’analyse. La suite de ce travail de fin d’études est la validation de la corrélation afin de compléter la validation de la méthode de dosage qui permettra de réaliser celui-ci au sein du laboratoire. Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage.................................................................................................................................... 7
Introduction :............................................................................................................................................................. 8
Partie théorique......................................................................................................................................................... 9
1. Le cortisol ...................................................................................................................................................... 9
2. Dosage du cortisol urinaire.......................................................................................................................... 10
2.1. Indication............................................................................................................................................. 10
2.2. Méthode de dosage............................................................................................................................. 10
2.3. Valeurs de références.......................................................................................................................... 11
3. Syndrome de Cushing.................................................................................................................................. 11
3.1. Signes cliniques.................................................................................................................................... 11
3.2. Cause du syndrome de Cushing........................................................................................................... 12
3.3. Tests de diagnostic .............................................................................................................................. 12
3.4. Le traitement ....................................................................................................................................... 14
4. Fonctionnement de l’HPLC ET UHPLC ......................................................................................................... 14
4.1. Théorie de la chromatographie ........................................................................................................... 14
4.2. Comparaison de l’HPLC ET l’UHPLC ..................................................................................................... 14
4.3. Appareillage......................................................................................................................................... 15
5. Développement de méthode ...................................................................................................................... 19
5.1. Conditions chromatographiques ......................................................................................................... 19
5.2. Extraction de l’analyte......................................................................................................................... 21
6. Validation de méthode ................................................................................................................................ 23
6.1. La limite de détection .......................................................................................................................... 23
6.2. La limite de quantification................................................................................................................... 24
6.3. La linéarité ........................................................................................................................................... 24
6.4. La répétabilité...................................................................................................................................... 25
6.5. La reproductibilité ............................................................................................................................... 25
6.6. La robustesse ....................................................................................................................................... 26
6.7. La contamination................................................................................................................................. 26
6.8. La récupération.................................................................................................................................... 27
6.9. La corrélation....................................................................................................................................... 28
Partie pratique......................................................................................................................................................... 29
1. Objectif et stratégie..................................................................................................................................... 29
2. Matériel et méthode ................................................................................................................................... 30
2.1. Matériel ............................................................................................................................................... 30
2.2. Méthode .............................................................................................................................................. 31
3. Résultats et discussion ................................................................................................................................ 33
3.1. Développement de la méthode chromatographique.......................................................................... 33
3.2. Validation de la méthode chromatographique ................................................................................... 43
Conclusion ............................................................................................................................................................... 54
Bibliographie............................................................................................................................................................ 55
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100363 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Mise au point d’une méthode de confirmation des drogues urinaires par LC-MS/MS / Hermann Wouantou Djoumatchou
Titre : Mise au point d’une méthode de confirmation des drogues urinaires par LC-MS/MS Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Hermann Wouantou Djoumatchou, Auteur Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : aboratoire LHUB-ULB Laboratoire Hospitalier Universitaire de Bruxelles Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les intoxications aux abus de drogues deviennent de plus en plus un problème réel dans notre quotidien dans la mesure où ces substances ont des effets indésirables pouvant nuire à notre société. Ces substances sont également capables de dégrader la santé des individus qui en consomme. Les procédures d’accompagnements, d’urgences et de justices font recourt aux laboratoires de toxicologie pour faire diminuer les cas d’intoxications aux abus de drogues. Au laboratoire, plusieurs échantillons peuvent être recueillit. Cependant, l’urine reste le milieu le plus usuel dans le dépistage de drogues car elle offre un grand volume. Les méthodes d’analyses sont généralement, dans un premier temps, de type immunologique c’est-à-dire basée sur la reconnaissance d’un anticorps et d’un antigène. Dans second temps, et surtout dans le but de confirmer les résultats, ces méthodes sont de type chromatographique. Les méthodes chromatographiques sont basées sur la séparation de composés entre deux phases non miscibles. Couplée à un spectromètre de masse, ces méthodes offrent une meilleure spécificité comparée aux méthodes immunologiques. Nous avons travaillé sur un système de type HPLC 1260, modèle « Infinity » couplé à unsystème LCMS-MS 6490 de la firme Agilent Technologies.
L’utilisation d’une librairie « forensic drugs » du logiciel Masshunter (Agilent Technologies) a permis de créer cinq méthodes en mode MRM (méthode AMPHE, méthode BARBI/THC, méthode BENZO, méthode MTD/COCA, Méthode OPI) pour chaque famille de drogues. La préparation des échantillons se résume en une simple dilution de l’urine. Nous avons utilisé un ‘Mix’ de la firme Chromsysems nommé: MassTox® Drugs of abuse testing urine Screening Standard Set (référence ; 96033) afin de créer et de tester les méthodes. Une fois les méthodes optimisées, celles-ci ont été évaluées à partir d’échantillons urinaires issus de la routine du laboratoire.Note de contenu : TABLE DES MATIERES
REMERCIEMENTS .................................................................................................................. 4
PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE. ................................................................................ 5
INTRODUCTION...................................................................................................................... 8
1 CONTEXTE THEORIQUE................................................................................................ 9
1.1 Définition..................................................................................................................... 9
1.2 Mécanisme d’action................................................................................................... 10
1.3 Classification ............................................................................................................. 12
1.4 Milieux d’analyse des drogues .................................................................................. 14
1.4.1 L’urine ................................................................................................................ 14
1.4.2 Le sang ............................................................................................................... 14
1.4.3 La salive ............................................................................................................. 14
1.4.4 Autres milieux (cheveux) ................................................................................... 15
1.5 Méthodes analytiques ................................................................................................ 15
1.5.1 Méthodes immunochimiques ............................................................................. 15
1.5.2 Méthodes chromatographiques .......................................................................... 16
2 OBJECTIF ........................................................................................................................ 18
3 MATERIEL ET METHODES.......................................................................................... 19
3.1 Matériel commercial de référence ............................................................................. 19
3.1.1 Kit commercial pour l’analyse des drogues urinaires sur Cobas ....................... 19
3.1.2 Mix pour l’analyse des drogues urinaires par LC-MS/MS ................................ 19
3.1.3 Librairie de transitions pour la détection des drogues par LC-MS-MS ............. 19
3.2 Appareillages ............................................................................................................. 20
3.2.1 Cobas .................................................................................................................. 20
3.2.2 HPLC.................................................................................................................. 20
3.2.3 Spectromètre de masse ....................................................................................... 21
3.3 Paramètres analytiques .............................................................................................. 24
3.3.1 Chromatographie liquide (pour l’ensemble des méthodes)................................ 24
3.3.2 Spectrométrie de masse ...................................................................................... 25
3.4 Echantillon................................................................................................................. 26
4 RESULTATS ET DISCUSSION ..................................................................................... 27
4.1 Méthode de confirmation de la firme Agilent Technologies..................................... 27
4.1.1 Test de la méthode unitaire avec le mix de la firme Chromsystems.................. 27
4.2 Création de 5 méthodes de confirmation en mode MRM ......................................... 28
4.2.1 But ...................................................................................................................... 28
4.2.2 Méthodologie : utilisation de la bibliothèque « forensic drugs »....................... 28
4.2.3 Méthode AMPHE............................................................................................... 29
4.2.4 Méthode BARBI/THC ....................................................................................... 30
4.2.5 Méthode BENZO ............................................................................................... 30
4.2.6 Méthode MTD/COCA........................................................................................ 31
4.2.7 Méthode OPI ...................................................................................................... 32
4.3 Optimisation des méthodes........................................................................................ 32
4.3.1 Dwell Time......................................................................................................... 32
4.3.2 Volume d’injection et dilution de l’échantillon ................................................. 35
4.3.3 Mode « Time Segment » .................................................................................... 37
4.4 Évaluation des différentes méthodes à partir d’échantillons urinaires issus de la
routine du laboratoire............................................................................................................ 38
4.4.1 Méthode AMPHE............................................................................................... 38
4.4.2 Méthode BARBI/THC ....................................................................................... 40
4.4.3 Méthode BENZO ............................................................................................... 40
4.4.4 Méthode MTD/COCA........................................................................................ 43
4.4.5 Méthode OPI ...................................................................................................... 44
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ..................................................................................... 46
Table d’abréviations ................................................................................................................. 47
TABLE DES FIGURES.......................................................................................................... 49
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................... 51
ANNEXES ............................................................................................................................... 54
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100373 Mise au point d’une méthode de confirmation des drogues urinaires par LC-MS/MS [TFE / Mémoire] / Hermann Wouantou Djoumatchou, Auteur . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur
Langues : Français (fre)
Mots-clés : aboratoire LHUB-ULB Laboratoire Hospitalier Universitaire de Bruxelles Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les intoxications aux abus de drogues deviennent de plus en plus un problème réel dans notre quotidien dans la mesure où ces substances ont des effets indésirables pouvant nuire à notre société. Ces substances sont également capables de dégrader la santé des individus qui en consomme. Les procédures d’accompagnements, d’urgences et de justices font recourt aux laboratoires de toxicologie pour faire diminuer les cas d’intoxications aux abus de drogues. Au laboratoire, plusieurs échantillons peuvent être recueillit. Cependant, l’urine reste le milieu le plus usuel dans le dépistage de drogues car elle offre un grand volume. Les méthodes d’analyses sont généralement, dans un premier temps, de type immunologique c’est-à-dire basée sur la reconnaissance d’un anticorps et d’un antigène. Dans second temps, et surtout dans le but de confirmer les résultats, ces méthodes sont de type chromatographique. Les méthodes chromatographiques sont basées sur la séparation de composés entre deux phases non miscibles. Couplée à un spectromètre de masse, ces méthodes offrent une meilleure spécificité comparée aux méthodes immunologiques. Nous avons travaillé sur un système de type HPLC 1260, modèle « Infinity » couplé à unsystème LCMS-MS 6490 de la firme Agilent Technologies.
L’utilisation d’une librairie « forensic drugs » du logiciel Masshunter (Agilent Technologies) a permis de créer cinq méthodes en mode MRM (méthode AMPHE, méthode BARBI/THC, méthode BENZO, méthode MTD/COCA, Méthode OPI) pour chaque famille de drogues. La préparation des échantillons se résume en une simple dilution de l’urine. Nous avons utilisé un ‘Mix’ de la firme Chromsysems nommé: MassTox® Drugs of abuse testing urine Screening Standard Set (référence ; 96033) afin de créer et de tester les méthodes. Une fois les méthodes optimisées, celles-ci ont été évaluées à partir d’échantillons urinaires issus de la routine du laboratoire.Note de contenu : TABLE DES MATIERES
REMERCIEMENTS .................................................................................................................. 4
PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE. ................................................................................ 5
INTRODUCTION...................................................................................................................... 8
1 CONTEXTE THEORIQUE................................................................................................ 9
1.1 Définition..................................................................................................................... 9
1.2 Mécanisme d’action................................................................................................... 10
1.3 Classification ............................................................................................................. 12
1.4 Milieux d’analyse des drogues .................................................................................. 14
1.4.1 L’urine ................................................................................................................ 14
1.4.2 Le sang ............................................................................................................... 14
1.4.3 La salive ............................................................................................................. 14
1.4.4 Autres milieux (cheveux) ................................................................................... 15
1.5 Méthodes analytiques ................................................................................................ 15
1.5.1 Méthodes immunochimiques ............................................................................. 15
1.5.2 Méthodes chromatographiques .......................................................................... 16
2 OBJECTIF ........................................................................................................................ 18
3 MATERIEL ET METHODES.......................................................................................... 19
3.1 Matériel commercial de référence ............................................................................. 19
3.1.1 Kit commercial pour l’analyse des drogues urinaires sur Cobas ....................... 19
3.1.2 Mix pour l’analyse des drogues urinaires par LC-MS/MS ................................ 19
3.1.3 Librairie de transitions pour la détection des drogues par LC-MS-MS ............. 19
3.2 Appareillages ............................................................................................................. 20
3.2.1 Cobas .................................................................................................................. 20
3.2.2 HPLC.................................................................................................................. 20
3.2.3 Spectromètre de masse ....................................................................................... 21
3.3 Paramètres analytiques .............................................................................................. 24
3.3.1 Chromatographie liquide (pour l’ensemble des méthodes)................................ 24
3.3.2 Spectrométrie de masse ...................................................................................... 25
3.4 Echantillon................................................................................................................. 26
4 RESULTATS ET DISCUSSION ..................................................................................... 27
4.1 Méthode de confirmation de la firme Agilent Technologies..................................... 27
4.1.1 Test de la méthode unitaire avec le mix de la firme Chromsystems.................. 27
4.2 Création de 5 méthodes de confirmation en mode MRM ......................................... 28
4.2.1 But ...................................................................................................................... 28
4.2.2 Méthodologie : utilisation de la bibliothèque « forensic drugs »....................... 28
4.2.3 Méthode AMPHE............................................................................................... 29
4.2.4 Méthode BARBI/THC ....................................................................................... 30
4.2.5 Méthode BENZO ............................................................................................... 30
4.2.6 Méthode MTD/COCA........................................................................................ 31
4.2.7 Méthode OPI ...................................................................................................... 32
4.3 Optimisation des méthodes........................................................................................ 32
4.3.1 Dwell Time......................................................................................................... 32
4.3.2 Volume d’injection et dilution de l’échantillon ................................................. 35
4.3.3 Mode « Time Segment » .................................................................................... 37
4.4 Évaluation des différentes méthodes à partir d’échantillons urinaires issus de la
routine du laboratoire............................................................................................................ 38
4.4.1 Méthode AMPHE............................................................................................... 38
4.4.2 Méthode BARBI/THC ....................................................................................... 40
4.4.3 Méthode BENZO ............................................................................................... 40
4.4.4 Méthode MTD/COCA........................................................................................ 43
4.4.5 Méthode OPI ...................................................................................................... 44
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ..................................................................................... 46
Table d’abréviations ................................................................................................................. 47
TABLE DES FIGURES.......................................................................................................... 49
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................... 51
ANNEXES ............................................................................................................................... 54
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100373 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Mise au point de RT-qPCR ciblant les transcrits de fusion BCR-ABL1 pour le diagnostic et le suivi thérapeutique des leucémies myéloïdes chroniques / Sarah Verardo
PermalinkMise au point d’une technique d’identification des dermatophytes par MALDI-TOF et étude des modifications du protéome après passage sur un épiderme / Louanne Nihoul
PermalinkMise au point du test ENA Symphony réalisé sur le Phadia 250 / Chloé Troch
PermalinkMise en routine d’une nouvelle technique dans un laboratoire de biologie moléculaire : le dépistage prénatal non invasif (DPNI) / Tamara Ramlot
PermalinkOptimisation d’une méthode de titrage viral par standardisation de la concentration cellulaire / Aaron Niaz
PermalinkLa procalcitonine, un marqueur incontournable en 2019 ? Le point de vue d’un hôpital périphérique / Lucie Cariaux
PermalinkLa QF-PCR et le SWGS comme alternative à la méthode de CGH+SNP pour les analyses de produits de fausse couche / Florian Chavée
PermalinkQualification d’un kit ELISA commercial de dosage de la protéine A / Marie Léonard
PermalinkRecherche de cellules néoplasiques dans les liquides de ponction par cytométrie en flux / Fanny Watrin
PermalinkRecherche de la fonction de la maspardine, une protéine déficiente dans la paraplégie spastique 21 / Anaïs Dupuis
PermalinkRecherche de nouveaux inhibiteurs de la phosphosérine phosphatase (SerB2) - étude des interactions de petites molécules sur l’activité et l’inhibition de SerB2 par DSF et tests enzymatiques / Simon Cheval
PermalinkRégulation distale de la compétence chez Streptococcus salivarius / François Caussin
PermalinkRôle du récepteur CD27 dans la régulation de la réponse inflammatoire associée à l’obésité / Marie Vanhollebeke
PermalinkLe Shallow Sequencing comme alternative à la technique de CGH dans le cadre du diagnostic prénatal / Gaelle Benini
PermalinkSuivi à 3 et 6 mois des anomalies des analyses de l’hémostase de patients hospitalisés aux soins intensifs à cause de la COVID-19 / Loïc Gillard
PermalinkSurexpression et purification de la 2-Oxoglutarate/Fe(II)- dépendante chez Caulobacter crescentus / Grégoire Vanhaelen
PermalinkThe impact of global warming on Aedes aegypti’s worldwide spread / Lison Guillaume
PermalinkValidation du contrôle de la préanalytique du STAR Max 3 de Stago / Mélanie Baran
PermalinkValidation du dosage des catécholamines et substances apparentées par chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem Présenté / Marine Freniere
PermalinkValidation du dosage des IgE totales sur le Phadia 250 par immunofluorescence / Luca Hutsenband
PermalinkValidation d’une méthode de dosage antigénique du SARS-CoV-2 dans le sérum / Nathan Hanot
PermalinkValidation technique de I’identification d’espèces de dermatophytes et autres champignons filamenteux par spectrométrie de masse (technique du Maldi-Tof) / Aleandro Forgione
PermalinkValidation du temps de conservation des germes pour le monitoring des fluides. / Nanouchka Sioli
PermalinkValidation du test à la mépacrine sur FACS lyric / Vincent Cauchie
PermalinkVérification de méthode pour l’analyse des liquides de ponction sur l’IQ200 / Antoine Verriez
PermalinkVérification des performances analytiques de 2 kits commerciaux pour le dosage des vitamines A/E et du bêta-carotène par chromatographie liquide (HPLC-UV) / Cemile Develi
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