Centre de Documentation Campus Montignies
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Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Helha. Paramédical - Biologie médicale
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Etude des effets de miels sur l’autophagie des macrophages / Julie George
Titre : Etude des effets de miels sur l’autophagie des macrophages Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Julie George, Auteur ; Gaëtane Maernoudt, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les propriétés curatives du miel sont connues depuis l’Antiquité et sont démontrées par des études contemporaines. En effet, le miel est connu depuis des décennies comme étant un remède naturel. Ses effets anti-inflammatoire, antibactériens et immunomodulatrices ne sont plus à prouver tant le nombre de recherches est important. Une recherche précédente a permis de mettre en évidence l’effet du miel artisanal d’été, des miels dont les propriétés curatives sont connues le Manuka et le Revamil sur l’abondance de protéines autophagiques des macrophages. En effet, les résultats ont montré une augmentation des protéines LC3-II et p62 en leur présence ainsi qu’une phosphorylation du complexe mTOR. L’autophagie désigne le mécanisme par lequel la cellule est capable de dégrader ses propres éléments cytoplasmiques n’étant plus nécessaire pour produire de nouvelles protéines. Ceci se réalise par l’intermédiaire de ses autophagosomes et lysosomes. L’objectif de ce travail de fin d’étude sera de confirmer l’augmentation de l’abondance des protéines autophagiques p62 dans les cellules RAW264.7 en présence du miel d’été, du Manuka et du Revamil. Il s’agira également de confirmer la diminution de l’abondance de la protéine TFEB qui est un marqueur majeur de l’autophagie dans ces 3 miels. L’objectif sera aussi de connaitre par quels mécanismes moléculaires et cellulaires ainsi que de quelle façon ces phénomènes se produisent et régulent l’autophagie. Dans le cadre de mon TFE, l’objectif principal est de connaitre et comprendre l’effet des différents miels sur les mécanismes d’autophagie des cellules macrophages. Pour se faire, on va s’intéresser principalement sur le facteur de transcription TFEB. Cette comparaison, des effets de différents miels a, dans un premier temps, été réalisée par analyse d’abondance protéique des marqueurs de l’autophagie et de kinases/enzymes clés de sa régulation. Cette recherche a permis de montrer une différence de l’augmentation de l’abondance des protéines p62 et TFEB en fonction du miel utilisé. La composition ainsi que la période de récolte du miel influenceraient cet effet. Deux miels artisanaux ont montré des profils complétement différents et les miels médicaux alors que le Revamil et le Manuka montrent des effets relativement similaires. En effet, Les résultats montrent une augmentation de l’abondance de la protéine p62 pour les conditions Revamil, Manuka et miel d’été par rapport à la condition « Sugar Mix » contrairement au miel de printemps qui se comporte comme la condition « Sugar Mix ». Ceci pourrait être expliqué par deux hypothèses. En effet, soit il pourrait s’agir d’une stimulation de l’initiation de l’autophagie et donc une accumulation d’autophagosomes, soit il pourrait s’agir d’une diminution de flux d’autophagie, c’est-à-dire l’étape de fusion de l’autophagosome avec le lysosome. Cette inhibition empêcherait ainsi la dégradation des autophagosomes, entrainant leur accumulation, ce qui expliquerait pourquoi p62 voit son abondance augmenter. Les résultats montrent également une diminution de l’abondance totale de TFEB ainsi qu’une translocation de TFEB dans les miels d’été, le Manuka et le Revamil. Une étude des gènes cibles de TFEB n’a pu affirmer que son activité est plus exprimée dans les miels d’été, Manuka et Revamil malgré sa translocation. Ces résultats montrent également que la composition du miel ainsi que la période de récolte influencent les effets de ce dernier sur l’abondance des protéines p62 et TFEB. Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage ..........................................................................................................................7
Introduction .....................................................................................................................................................8
Le miel........................................................................................................................................................11
Composition du miel..............................................................................................................................11
Propriétés du miel .................................................................................................................................15
L’autophagie ..............................................................................................................................................21
Mécanismes impliqués dans l’autophagie et formation de l’autophagosome .....................................23
Régulation de l’autophagie....................................................................................................................26
Objectif de l’étude .........................................................................................................................................32
Matériel et méthodes ....................................................................................................................................34
Matériels....................................................................................................................................................35
Miels.......................................................................................................................................................35
Cellules RAW 264.7................................................................................................................................37
Méthodes...................................................................................................................................................38
Workflow des manipulations.................................................................................................................38
Dosage protéique par la méthode de Bradford ....................................................................................38
Lysats cellulaires ....................................................................................................................................39
Fractionnement cellulaire......................................................................................................................40
Western blot ..........................................................................................................................................40
Dosage de deux enzymes lysosomales ..................................................................................................44
Immunofluorescence.............................................................................................................................46
Résultats et discussion...................................................................................................................................48
Résultats préliminaires ..............................................................................................................................49
Etude des nouveaux miels .........................................................................................................................49
Micrographie..........................................................................................................................................50
Etude des effets des miels sur l’abondance de p62 ..................................................................................52
Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de p62 par western blot .......................52
Immunofluorescence et observation de l’abondance et de la localisation de p62 au microscope
confocal..................................................................................................................................................54
Etude du facteur de transcription EB ........................................................................................................57
Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de TFEB par des analyses en western blot
...............................................................................................................................................................57
Immunofluorescence et observation au confocal.................................................................................59
Fractionnement .....................................................................................................................................61
Dosage enzymatique .............................................................................................................................63
Conclusions et perspectives ..........................................................................................................................64
Liste des abréviations ................................................................................................................................68
Liste des figures .........................................................................................................................................70
Références bibliographiques .........................................................................................................................72
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100365 Etude des effets de miels sur l’autophagie des macrophages [TFE / Mémoire] / Julie George, Auteur ; Gaëtane Maernoudt, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur
Langues : Français (fre)
Mots-clés : UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les propriétés curatives du miel sont connues depuis l’Antiquité et sont démontrées par des études contemporaines. En effet, le miel est connu depuis des décennies comme étant un remède naturel. Ses effets anti-inflammatoire, antibactériens et immunomodulatrices ne sont plus à prouver tant le nombre de recherches est important. Une recherche précédente a permis de mettre en évidence l’effet du miel artisanal d’été, des miels dont les propriétés curatives sont connues le Manuka et le Revamil sur l’abondance de protéines autophagiques des macrophages. En effet, les résultats ont montré une augmentation des protéines LC3-II et p62 en leur présence ainsi qu’une phosphorylation du complexe mTOR. L’autophagie désigne le mécanisme par lequel la cellule est capable de dégrader ses propres éléments cytoplasmiques n’étant plus nécessaire pour produire de nouvelles protéines. Ceci se réalise par l’intermédiaire de ses autophagosomes et lysosomes. L’objectif de ce travail de fin d’étude sera de confirmer l’augmentation de l’abondance des protéines autophagiques p62 dans les cellules RAW264.7 en présence du miel d’été, du Manuka et du Revamil. Il s’agira également de confirmer la diminution de l’abondance de la protéine TFEB qui est un marqueur majeur de l’autophagie dans ces 3 miels. L’objectif sera aussi de connaitre par quels mécanismes moléculaires et cellulaires ainsi que de quelle façon ces phénomènes se produisent et régulent l’autophagie. Dans le cadre de mon TFE, l’objectif principal est de connaitre et comprendre l’effet des différents miels sur les mécanismes d’autophagie des cellules macrophages. Pour se faire, on va s’intéresser principalement sur le facteur de transcription TFEB. Cette comparaison, des effets de différents miels a, dans un premier temps, été réalisée par analyse d’abondance protéique des marqueurs de l’autophagie et de kinases/enzymes clés de sa régulation. Cette recherche a permis de montrer une différence de l’augmentation de l’abondance des protéines p62 et TFEB en fonction du miel utilisé. La composition ainsi que la période de récolte du miel influenceraient cet effet. Deux miels artisanaux ont montré des profils complétement différents et les miels médicaux alors que le Revamil et le Manuka montrent des effets relativement similaires. En effet, Les résultats montrent une augmentation de l’abondance de la protéine p62 pour les conditions Revamil, Manuka et miel d’été par rapport à la condition « Sugar Mix » contrairement au miel de printemps qui se comporte comme la condition « Sugar Mix ». Ceci pourrait être expliqué par deux hypothèses. En effet, soit il pourrait s’agir d’une stimulation de l’initiation de l’autophagie et donc une accumulation d’autophagosomes, soit il pourrait s’agir d’une diminution de flux d’autophagie, c’est-à-dire l’étape de fusion de l’autophagosome avec le lysosome. Cette inhibition empêcherait ainsi la dégradation des autophagosomes, entrainant leur accumulation, ce qui expliquerait pourquoi p62 voit son abondance augmenter. Les résultats montrent également une diminution de l’abondance totale de TFEB ainsi qu’une translocation de TFEB dans les miels d’été, le Manuka et le Revamil. Une étude des gènes cibles de TFEB n’a pu affirmer que son activité est plus exprimée dans les miels d’été, Manuka et Revamil malgré sa translocation. Ces résultats montrent également que la composition du miel ainsi que la période de récolte influencent les effets de ce dernier sur l’abondance des protéines p62 et TFEB. Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage ..........................................................................................................................7
Introduction .....................................................................................................................................................8
Le miel........................................................................................................................................................11
Composition du miel..............................................................................................................................11
Propriétés du miel .................................................................................................................................15
L’autophagie ..............................................................................................................................................21
Mécanismes impliqués dans l’autophagie et formation de l’autophagosome .....................................23
Régulation de l’autophagie....................................................................................................................26
Objectif de l’étude .........................................................................................................................................32
Matériel et méthodes ....................................................................................................................................34
Matériels....................................................................................................................................................35
Miels.......................................................................................................................................................35
Cellules RAW 264.7................................................................................................................................37
Méthodes...................................................................................................................................................38
Workflow des manipulations.................................................................................................................38
Dosage protéique par la méthode de Bradford ....................................................................................38
Lysats cellulaires ....................................................................................................................................39
Fractionnement cellulaire......................................................................................................................40
Western blot ..........................................................................................................................................40
Dosage de deux enzymes lysosomales ..................................................................................................44
Immunofluorescence.............................................................................................................................46
Résultats et discussion...................................................................................................................................48
Résultats préliminaires ..............................................................................................................................49
Etude des nouveaux miels .........................................................................................................................49
Micrographie..........................................................................................................................................50
Etude des effets des miels sur l’abondance de p62 ..................................................................................52
Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de p62 par western blot .......................52
Immunofluorescence et observation de l’abondance et de la localisation de p62 au microscope
confocal..................................................................................................................................................54
Etude du facteur de transcription EB ........................................................................................................57
Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de TFEB par des analyses en western blot
...............................................................................................................................................................57
Immunofluorescence et observation au confocal.................................................................................59
Fractionnement .....................................................................................................................................61
Dosage enzymatique .............................................................................................................................63
Conclusions et perspectives ..........................................................................................................................64
Liste des abréviations ................................................................................................................................68
Liste des figures .........................................................................................................................................70
Références bibliographiques .........................................................................................................................72
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100365 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Étude de la fonction de C1qBP dans les cellules musculaires saines et FSHD / Anelise Juhasz
Titre : Étude de la fonction de C1qBP dans les cellules musculaires saines et FSHD Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Anelise Juhasz, Auteur ; Frédérick COPPEE, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2020 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La dystrophie facio-scapulo-humérale (FSHD) est une des plus fréquentes myopathies héréditaires au niveau mondial. Cette maladie se caractérise par une atrophie asymétrique des muscles du visage, de l’épaule et des membres supérieurs, touchés en priorité. Le gène considéré comme causal de la maladie est DUX4, lorsqu’il est anormalement exprimé dans le muscle squelettique et que son ARNm est stabilisé. La protéine DUX4 est un facteur de transcription, normalement non-exprimé dans les cellules musculaires. DUX4 est donc toxique pour les cellules musculaires et produit l’atrophie des muscles par un ou des mécanismes moléculaires non encore élucidés. Il existe une protéine homologue à DUX4, appelée DUX4c, qui ne cause pas la maladie et qui est exprimée normalement dans les muscles squelettiques. Son expression est augmentée dans les muscles FSHD.
Des partenaires protéiques de DUX4 et DUX4c ont été préalablement identifiés par notre laboratoire d’accueil, dont C1qBP. De plus, notre laboratoire a récemment déterminé que C1qBP était le partenaire principal de DUX4/4c. Pour étudier le rôle de la protéine C1qBP dans la FSHD, l’expression et la localisation de celle-ci ont été étudiés en plus de l’étude de ses partenaires protéiques potentiels.
Premièrement, les analyses bio-informatiques, réalisées à partir de liste de protéines, préalablement acquises et identifiées par spectrométrie de masse, ont révélé 105 partenaires protéiques potentiels de C1qBP dans les complexes purifiés DUX4 et DUX4c. De plus, lors de la comparaison de protéines présentes dans ces complexes, des partenaires protéiques propre à DUX4 ou DUX4c ont été identifiés. Parmi ceux-ci, DUX4c est retrouvé en complexe avec de nombreuses protéines mitochondriales liées aux fonctions de C1qBP, ce qui n’est pas ou peu le cas pour DUX4.
Deuxièmement, les techniques du Western blot et de l’immunofluorescence, nous avons mis en évidence que les cellules musculaires contrôles et FSHD présentent des niveaux similaires de C1qBP mais sa localisation intracellulaire est perturbée, suggérant une inhibition de ses fonctions mitochondriale. De plus, la quantité de C1qBP est environ 3x plus importante dans les cellules musculaires différenciées. Ceci est en accord avec une augmentation du réseau mitochondrial au cours de la différenciation, nécessitant une fonction énergétique plus importante, assurée entre autres par C1qBP. Nous avons également déterminé, par immunofluorescence, que la quantité de mitochondrie (totale et active) diminuait dans les cellules FSHD.
Notre étude suggère donc que (1) DUX4c, normalement exprimé dans les cellules musculaires, participerait par sa liaison à C1qBP aux fonctions mitochondriales de ce dernier, particulièrement actives en cours de différenciation ; (2) la protéine DUX4, induisant l’atrophie musculaire, aurait un impact négatif sur la localisation et les fonctions mitochondriales de C1qBP. Bien qu’étant un facteur de transcription, l’interaction de DUX4 avec C1qBP altèrerait des fonctions non associées à la régulation directe de l’expression de gènes.
Ce travail a permis de compléter les connaissances relatives à la fonction de C1qBP dans les muscles squelettiques humains sains et FSHD, et pourrait permettre de définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la FSHD.Note de contenu : Présentation du lieu de stage
Introduction .........................................................................................................................10
Contexte biologique .............................................................................................................13
1 Muscles striés-squelettiques ......................................................................................14
1.1 Structure du muscle ............................................................................................14
1.2 Régénération musculaire ....................................................................................15
2 FSHD ..........................................................................................................................18
2.1 Signes cliniques ...................................................................................................18
2.2 Caractéristiques histologiques des muscles squelettiques FSHD .........................19
2.3 Traitement ..........................................................................................................20
2.4 Causes génétiques et épigénétiques ...................................................................21
3 DUX4/DUX4c..............................................................................................................23
3.1 Le gène complet DUX4 et l’ARNm .......................................................................23
3.2 Protéine DUX4 ....................................................................................................23
3.3 DUX4c .................................................................................................................27
4 Protéines partenaires de DUX4 et DUX4c ...................................................................28
5 C1qBP ........................................................................................................................30
5.1 Rôle dans la membrane cellulaire et matrice extracellulaire ...............................31
5.2 Rôle dans le noyau ..............................................................................................32
5.3 Rôle dans la mitochondrie ..................................................................................33
5.4 Rôle dans le cytoplasme ......................................................................................34
Objectif et stratégie ..............................................................................................................35
Matériels et méthodes .........................................................................................................37
1 Introduction ...............................................................................................................38
2 Analyse bio-informatique ...........................................................................................39
2.1 Principe de l’analyse bio-informatique : STRING .................................................39
2.2 Analyses des partenaires de C1qBP .....................................................................39
3 Culture cellulaire ........................................................................................................39
3.1 Principe de la culture cellulaire ...........................................................................39
3.2 Méthodes ...........................................................................................................40
4 Western blot ..............................................................................................................43
4.1 Principe du Western blot ....................................................................................43
5 Immunofluorescence .................................................................................................46
5.1 Principe de l’immunofluorescence ......................................................................46
5.2 Protocole de l’immunofluorescence....................................................................46
5.3 Analyses des images ...........................................................................................48
Résultats...............................................................................................................................49
1 Analyse in silico des partenaires de C1qBP .................................................................50
1.1 Identification des partenaires protéiques de C1qBP ............................................52
1.2 Fonctions et localisation intracellulaire des partenaires protéiques de C1qBP ....54
1.3 Comparaison entre les partenaires protéiques identifiés lors de la surexpression de DUX4 ou de DUX4c ...................................................................................................55
2 Expression et localisation de C1qBP dans les myoblastes et myotubes ......................58
2.1 Niveau d’expression de C1qBP ............................................................................59
2.2 Localisation de C1qBP et des mitochondries « actives » dans les myoblastes sains et FSHD .........................................................................................................................60
2.3 Localisation de C1qBP et des mitochondries « actives » les myotubes sains et FSHD 64
2.4 Localisation de C1qBP et de TOMM20 dans les myoblastes sains et FSHD ..........65
3 Localisation de YBX1, un partenaire protéique de C1qBP, dans les myoblastes ..........68
3.1 Localisation de YBX1 dans les myoblastes sains et FSHD .....................................68
Discussion.............................................................................................................................71
1 Analyse in silico des partenaires de C1qBP .................................................................72
1.1 Identification des partenaires protéiques de C1qBP ............................................72
1.2 Fonctions et localisation intracellulaire des partenaires protéiques de C1qBP ....72
1.3 Comparaison entre les partenaires protéiques identifiés lors de la surexpression de DUX4 ou de DUX4c ...................................................................................................73
2 Expression et localisation de C1qBP dans les myoblastes et myotubes ......................74
2.1 Niveau d’expression de C1qBP ............................................................................74
2.2 Comparaison entre les différents anticorps utilisé pour visualiser C1qBP dans les cellules saines et FSHD ..................................................................................................74
2.3 Localisation de C1qBP en présence de marqueurs des mitochondries dans les myoblastes et myotubes sains et FSHD .........................................................................75
3 Localisation d’un partenaire protéique, YBX1, de C1qBP dans les myoblastes sains et FSHD .................................................................................................................................76
Conclusion ............................................................................................................................77
Lexique .................................................................................................................................80
Liste des figures ....................................................................................................................84
Bibliographie ........................................................................................................................87
Annexes ................................................................................................................................94Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89125 Étude de la fonction de C1qBP dans les cellules musculaires saines et FSHD [TFE / Mémoire] / Anelise Juhasz, Auteur ; Frédérick COPPEE, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2020.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La dystrophie facio-scapulo-humérale (FSHD) est une des plus fréquentes myopathies héréditaires au niveau mondial. Cette maladie se caractérise par une atrophie asymétrique des muscles du visage, de l’épaule et des membres supérieurs, touchés en priorité. Le gène considéré comme causal de la maladie est DUX4, lorsqu’il est anormalement exprimé dans le muscle squelettique et que son ARNm est stabilisé. La protéine DUX4 est un facteur de transcription, normalement non-exprimé dans les cellules musculaires. DUX4 est donc toxique pour les cellules musculaires et produit l’atrophie des muscles par un ou des mécanismes moléculaires non encore élucidés. Il existe une protéine homologue à DUX4, appelée DUX4c, qui ne cause pas la maladie et qui est exprimée normalement dans les muscles squelettiques. Son expression est augmentée dans les muscles FSHD.
Des partenaires protéiques de DUX4 et DUX4c ont été préalablement identifiés par notre laboratoire d’accueil, dont C1qBP. De plus, notre laboratoire a récemment déterminé que C1qBP était le partenaire principal de DUX4/4c. Pour étudier le rôle de la protéine C1qBP dans la FSHD, l’expression et la localisation de celle-ci ont été étudiés en plus de l’étude de ses partenaires protéiques potentiels.
Premièrement, les analyses bio-informatiques, réalisées à partir de liste de protéines, préalablement acquises et identifiées par spectrométrie de masse, ont révélé 105 partenaires protéiques potentiels de C1qBP dans les complexes purifiés DUX4 et DUX4c. De plus, lors de la comparaison de protéines présentes dans ces complexes, des partenaires protéiques propre à DUX4 ou DUX4c ont été identifiés. Parmi ceux-ci, DUX4c est retrouvé en complexe avec de nombreuses protéines mitochondriales liées aux fonctions de C1qBP, ce qui n’est pas ou peu le cas pour DUX4.
Deuxièmement, les techniques du Western blot et de l’immunofluorescence, nous avons mis en évidence que les cellules musculaires contrôles et FSHD présentent des niveaux similaires de C1qBP mais sa localisation intracellulaire est perturbée, suggérant une inhibition de ses fonctions mitochondriale. De plus, la quantité de C1qBP est environ 3x plus importante dans les cellules musculaires différenciées. Ceci est en accord avec une augmentation du réseau mitochondrial au cours de la différenciation, nécessitant une fonction énergétique plus importante, assurée entre autres par C1qBP. Nous avons également déterminé, par immunofluorescence, que la quantité de mitochondrie (totale et active) diminuait dans les cellules FSHD.
Notre étude suggère donc que (1) DUX4c, normalement exprimé dans les cellules musculaires, participerait par sa liaison à C1qBP aux fonctions mitochondriales de ce dernier, particulièrement actives en cours de différenciation ; (2) la protéine DUX4, induisant l’atrophie musculaire, aurait un impact négatif sur la localisation et les fonctions mitochondriales de C1qBP. Bien qu’étant un facteur de transcription, l’interaction de DUX4 avec C1qBP altèrerait des fonctions non associées à la régulation directe de l’expression de gènes.
Ce travail a permis de compléter les connaissances relatives à la fonction de C1qBP dans les muscles squelettiques humains sains et FSHD, et pourrait permettre de définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la FSHD.Note de contenu : Présentation du lieu de stage
Introduction .........................................................................................................................10
Contexte biologique .............................................................................................................13
1 Muscles striés-squelettiques ......................................................................................14
1.1 Structure du muscle ............................................................................................14
1.2 Régénération musculaire ....................................................................................15
2 FSHD ..........................................................................................................................18
2.1 Signes cliniques ...................................................................................................18
2.2 Caractéristiques histologiques des muscles squelettiques FSHD .........................19
2.3 Traitement ..........................................................................................................20
2.4 Causes génétiques et épigénétiques ...................................................................21
3 DUX4/DUX4c..............................................................................................................23
3.1 Le gène complet DUX4 et l’ARNm .......................................................................23
3.2 Protéine DUX4 ....................................................................................................23
3.3 DUX4c .................................................................................................................27
4 Protéines partenaires de DUX4 et DUX4c ...................................................................28
5 C1qBP ........................................................................................................................30
5.1 Rôle dans la membrane cellulaire et matrice extracellulaire ...............................31
5.2 Rôle dans le noyau ..............................................................................................32
5.3 Rôle dans la mitochondrie ..................................................................................33
5.4 Rôle dans le cytoplasme ......................................................................................34
Objectif et stratégie ..............................................................................................................35
Matériels et méthodes .........................................................................................................37
1 Introduction ...............................................................................................................38
2 Analyse bio-informatique ...........................................................................................39
2.1 Principe de l’analyse bio-informatique : STRING .................................................39
2.2 Analyses des partenaires de C1qBP .....................................................................39
3 Culture cellulaire ........................................................................................................39
3.1 Principe de la culture cellulaire ...........................................................................39
3.2 Méthodes ...........................................................................................................40
4 Western blot ..............................................................................................................43
4.1 Principe du Western blot ....................................................................................43
5 Immunofluorescence .................................................................................................46
5.1 Principe de l’immunofluorescence ......................................................................46
5.2 Protocole de l’immunofluorescence....................................................................46
5.3 Analyses des images ...........................................................................................48
Résultats...............................................................................................................................49
1 Analyse in silico des partenaires de C1qBP .................................................................50
1.1 Identification des partenaires protéiques de C1qBP ............................................52
1.2 Fonctions et localisation intracellulaire des partenaires protéiques de C1qBP ....54
1.3 Comparaison entre les partenaires protéiques identifiés lors de la surexpression de DUX4 ou de DUX4c ...................................................................................................55
2 Expression et localisation de C1qBP dans les myoblastes et myotubes ......................58
2.1 Niveau d’expression de C1qBP ............................................................................59
2.2 Localisation de C1qBP et des mitochondries « actives » dans les myoblastes sains et FSHD .........................................................................................................................60
2.3 Localisation de C1qBP et des mitochondries « actives » les myotubes sains et FSHD 64
2.4 Localisation de C1qBP et de TOMM20 dans les myoblastes sains et FSHD ..........65
3 Localisation de YBX1, un partenaire protéique de C1qBP, dans les myoblastes ..........68
3.1 Localisation de YBX1 dans les myoblastes sains et FSHD .....................................68
Discussion.............................................................................................................................71
1 Analyse in silico des partenaires de C1qBP .................................................................72
1.1 Identification des partenaires protéiques de C1qBP ............................................72
1.2 Fonctions et localisation intracellulaire des partenaires protéiques de C1qBP ....72
1.3 Comparaison entre les partenaires protéiques identifiés lors de la surexpression de DUX4 ou de DUX4c ...................................................................................................73
2 Expression et localisation de C1qBP dans les myoblastes et myotubes ......................74
2.1 Niveau d’expression de C1qBP ............................................................................74
2.2 Comparaison entre les différents anticorps utilisé pour visualiser C1qBP dans les cellules saines et FSHD ..................................................................................................74
2.3 Localisation de C1qBP en présence de marqueurs des mitochondries dans les myoblastes et myotubes sains et FSHD .........................................................................75
3 Localisation d’un partenaire protéique, YBX1, de C1qBP dans les myoblastes sains et FSHD .................................................................................................................................76
Conclusion ............................................................................................................................77
Lexique .................................................................................................................................80
Liste des figures ....................................................................................................................84
Bibliographie ........................................................................................................................87
Annexes ................................................................................................................................94Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89125 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Étude de la fonction du polyphosphate dans la résistance à la D-cyclosérine / Sarah Willems
Titre : Étude de la fonction du polyphosphate dans la résistance à la D-cyclosérine Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Sarah Willems, Auteur ; François Beaufay, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2020 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le polyphosphate, un biopolymère composé d’une chaîne allant jusqu’à 1000 résidus de phosphates inorganiques, est retrouvé chez tous les organismes étudiés. Il est considéré comme une molécule ancestrale ayant contribué à l’émergence de la vie sur terre. Ce polyanion remplit un nombre surprenant de fonctions cellulaires très diversifiées permettant aux organismes de résister aux conditions de stress les plus extrêmes. Chez les eucaryotes multicellulaires complexes, le polyphosphate a notamment été associé à l’hémostase et l’amylogenèse. Chez les procaryotes, ce polymère est impliqué, entre autres, dans la chélation des métaux, la virulence et le métabolisme énergétique. Deux des fonctions du polyphosphate récemment découvertes ont une importance particulière dans ce travail ; sa capacité à agir en tant que chaperonne et sa fonction dans la régulation de la mobilité des éléments génétiques mobiles.
Connaissant l’importance de cette molécule dans la réponse au stress, il n’est pas étonnant qu’un mutant dépourvu de l’enzyme de synthèse du polyphosphate soit considérablement plus sensible à diverses conditions telles que la chaleur, le manque de ressources nutritives et le stress oxydatif. Lors de travaux précédents, mon maître de stage a pu observer chez une souche mutante d’Escherichia coli incapable de synthétiser le polyphosphate, une sensibilité exacerbée pour la D-cyclosérine (antibiotique ciblant la synthèse du peptidoglycane) en comparaison à une souche de phénotype sauvage.
L’objectif de ce travail consiste à reproduire cet effet et à déterminer ensuite s’il est spécifique à la D-cyclosérine ou général et applicable à d’autres antibiotiques. Il s’agit également de déterminer s’il est associé à une famille d’antibiotique, à une cible, ou à un mécanisme particulier. Pour finir, il consiste à définir précisément le rôle du polyphosphate dans la résistance contre ces antibiotiques.
Pour ce faire, nous avons entrepris une étude de la sensibilité de mutants d’Escherichia coli possédant divers taux intracellulaires de polyphosphate après contact avec des concentrations croissantes de différents antibiotiques testés. Les molécules ont été sélectionnées afin de couvrir un large spectre de mécanismes d’action et de cibles.
Il s’agirait désormais de quantifier précisément le degré de sensibilité d’une souche dépourvue en polyphosphate par une détermination des concentrations minimales inhibitrices et bactéricides. Il faudrait également évaluer si le stress causé par les antibiotiques induit une accumulation de polyphosphate en quantifiant son taux cellulaire. Aussi, il serait intéressant de déterminer si la protection du polyphosphate est liée à sa fonction chaperonne par analyse de l’expression génique par RT-qPCR et par quantification de l’agrégation protéique. Et finalement une analyse globale de la fonction des gènes par tn-seq sera entreprise.Note de contenu : Table des matières
Remerciements ............................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 9
Introduction générale...................................................................................................................
Contexte général ...................................................................................................................... 13
Le polyphosphate ................................................................................................................. 13
Le polyphosphate, une molécule universellement conservée ......................................... 13
La biosynthèse du polyphosphate .................................................................................... 14
Le polyphosphate, un polymère multifonctionnel ........................................................... 15
Le polyphosphate est une chaperonne majeure .............................................................. 20
Un nouveau rôle pour le polyphosphate .......................................................................... 22
Les antibiotiques ................................................................................................................... 24
Mécanismes d’action des antibiotiques ........................................................................... 25
Les antibiotiques agissant sur la synthèse du peptidoglycane ..................................... 26
Le peptidoglycane ...................................................................................................... 26
Structure du peptidoglycane ................................................................................. 26
Synthèse du peptidoglycane .................................................................................. 27
L’ampicilline et la céphalexine ................................................................................... 28
La fosfomycine ........................................................................................................... 29
Les antibiotiques agissant sur la synthèse et/ou le fonctionnement de l’ADN ............ 29
L’ofloxacine ................................................................................................................ 29
La rifampicine ............................................................................................................ 29
Les antibiotiques inhibant la synthèse protéique ......................................................... 29
La streptomycine, la kanamycine et la gentamicine ................................................. 29
L‘érythromycine ......................................................................................................... 29
Le chloramphénicol ................................................................................................... 30
La tétracycline ............................................................................................................ 30
La D-cyclosérine ............................................................................................................. 30
Mécanismes d’action et de résistance à la D-cyclosérine ......................................... 30
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 32
Matériel et méthodes .............................................................................................................. 34
Tests de survie ...................................................................................................................... 34
Matériel biologique ........................................................................................................... 34
Solutions d’antibiotiques .................................................................................................. 34
Milieux de culture ............................................................................................................. 35
Méthode des tests de survie ............................................................................................. 35
Construction génétique du plasmide pKOV exprimant le gène ppk et transformation de souches Δppk ........................................................................................................................ 36
Le plasmide pKOV ............................................................................................................. 36
Préparation rapide d’ADN plasmidique (miniprep) .......................................................... 37
Polymerase chain reaction (PCR) ...................................................................................... 37
Électrophorèse sur gel d’agarose...................................................................................... 38
Digestion d’ADN par enzyme de restriction ..................................................................... 38
Déphosphorylation de pKOV ............................................................................................ 39
Ligation de pKOV et du produit PCR ppk .......................................................................... 39
Préparation des bactéries compétentes ........................................................................... 39
Transformation des bactéries compétentes et sélection des transformants .................. 39
Résultats et discussion ............................................................................................................. 40
L’absence de polyphosphate augmente la sensibilité à la D-cyclosérine ............................ 40
Le polyphosphate n’intervient pas dans la synthèse du peptidoglycane ............................ 42
Le manque de polyphosphate ne diminue pas la perméabilité d’Escherichia coli .............. 45
Le polyphosphate semble impliqué dans la synthèse des protéines ................................... 47
Discussion ............................................................................................................................. 56
Perspectives.............................................................................................................................. 59
Détermination des CMI et CMB en milieu liquide ................................................................ 59
Quantification de la concentration intra-bactérienne en polyphosphate ........................... 60
Analyse de l’expression génique par RT-qPCR ..................................................................... 60
Extraits protéiques ................................................................................................................ 61
Séquençage d’insertion de transposon ................................................................................ 61
Conclusion générale .....................................................................................................................
Liste des figures ........................................................................................................................ 65
Liste des abréviations ............................................................................................................... 67
Bibliographie ................................................................................................................................
Annexes ........................................................................................................................................Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89148 Étude de la fonction du polyphosphate dans la résistance à la D-cyclosérine [TFE / Mémoire] / Sarah Willems, Auteur ; François Beaufay, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2020.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le polyphosphate, un biopolymère composé d’une chaîne allant jusqu’à 1000 résidus de phosphates inorganiques, est retrouvé chez tous les organismes étudiés. Il est considéré comme une molécule ancestrale ayant contribué à l’émergence de la vie sur terre. Ce polyanion remplit un nombre surprenant de fonctions cellulaires très diversifiées permettant aux organismes de résister aux conditions de stress les plus extrêmes. Chez les eucaryotes multicellulaires complexes, le polyphosphate a notamment été associé à l’hémostase et l’amylogenèse. Chez les procaryotes, ce polymère est impliqué, entre autres, dans la chélation des métaux, la virulence et le métabolisme énergétique. Deux des fonctions du polyphosphate récemment découvertes ont une importance particulière dans ce travail ; sa capacité à agir en tant que chaperonne et sa fonction dans la régulation de la mobilité des éléments génétiques mobiles.
Connaissant l’importance de cette molécule dans la réponse au stress, il n’est pas étonnant qu’un mutant dépourvu de l’enzyme de synthèse du polyphosphate soit considérablement plus sensible à diverses conditions telles que la chaleur, le manque de ressources nutritives et le stress oxydatif. Lors de travaux précédents, mon maître de stage a pu observer chez une souche mutante d’Escherichia coli incapable de synthétiser le polyphosphate, une sensibilité exacerbée pour la D-cyclosérine (antibiotique ciblant la synthèse du peptidoglycane) en comparaison à une souche de phénotype sauvage.
L’objectif de ce travail consiste à reproduire cet effet et à déterminer ensuite s’il est spécifique à la D-cyclosérine ou général et applicable à d’autres antibiotiques. Il s’agit également de déterminer s’il est associé à une famille d’antibiotique, à une cible, ou à un mécanisme particulier. Pour finir, il consiste à définir précisément le rôle du polyphosphate dans la résistance contre ces antibiotiques.
Pour ce faire, nous avons entrepris une étude de la sensibilité de mutants d’Escherichia coli possédant divers taux intracellulaires de polyphosphate après contact avec des concentrations croissantes de différents antibiotiques testés. Les molécules ont été sélectionnées afin de couvrir un large spectre de mécanismes d’action et de cibles.
Il s’agirait désormais de quantifier précisément le degré de sensibilité d’une souche dépourvue en polyphosphate par une détermination des concentrations minimales inhibitrices et bactéricides. Il faudrait également évaluer si le stress causé par les antibiotiques induit une accumulation de polyphosphate en quantifiant son taux cellulaire. Aussi, il serait intéressant de déterminer si la protection du polyphosphate est liée à sa fonction chaperonne par analyse de l’expression génique par RT-qPCR et par quantification de l’agrégation protéique. Et finalement une analyse globale de la fonction des gènes par tn-seq sera entreprise.Note de contenu : Table des matières
Remerciements ............................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 9
Introduction générale...................................................................................................................
Contexte général ...................................................................................................................... 13
Le polyphosphate ................................................................................................................. 13
Le polyphosphate, une molécule universellement conservée ......................................... 13
La biosynthèse du polyphosphate .................................................................................... 14
Le polyphosphate, un polymère multifonctionnel ........................................................... 15
Le polyphosphate est une chaperonne majeure .............................................................. 20
Un nouveau rôle pour le polyphosphate .......................................................................... 22
Les antibiotiques ................................................................................................................... 24
Mécanismes d’action des antibiotiques ........................................................................... 25
Les antibiotiques agissant sur la synthèse du peptidoglycane ..................................... 26
Le peptidoglycane ...................................................................................................... 26
Structure du peptidoglycane ................................................................................. 26
Synthèse du peptidoglycane .................................................................................. 27
L’ampicilline et la céphalexine ................................................................................... 28
La fosfomycine ........................................................................................................... 29
Les antibiotiques agissant sur la synthèse et/ou le fonctionnement de l’ADN ............ 29
L’ofloxacine ................................................................................................................ 29
La rifampicine ............................................................................................................ 29
Les antibiotiques inhibant la synthèse protéique ......................................................... 29
La streptomycine, la kanamycine et la gentamicine ................................................. 29
L‘érythromycine ......................................................................................................... 29
Le chloramphénicol ................................................................................................... 30
La tétracycline ............................................................................................................ 30
La D-cyclosérine ............................................................................................................. 30
Mécanismes d’action et de résistance à la D-cyclosérine ......................................... 30
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 32
Matériel et méthodes .............................................................................................................. 34
Tests de survie ...................................................................................................................... 34
Matériel biologique ........................................................................................................... 34
Solutions d’antibiotiques .................................................................................................. 34
Milieux de culture ............................................................................................................. 35
Méthode des tests de survie ............................................................................................. 35
Construction génétique du plasmide pKOV exprimant le gène ppk et transformation de souches Δppk ........................................................................................................................ 36
Le plasmide pKOV ............................................................................................................. 36
Préparation rapide d’ADN plasmidique (miniprep) .......................................................... 37
Polymerase chain reaction (PCR) ...................................................................................... 37
Électrophorèse sur gel d’agarose...................................................................................... 38
Digestion d’ADN par enzyme de restriction ..................................................................... 38
Déphosphorylation de pKOV ............................................................................................ 39
Ligation de pKOV et du produit PCR ppk .......................................................................... 39
Préparation des bactéries compétentes ........................................................................... 39
Transformation des bactéries compétentes et sélection des transformants .................. 39
Résultats et discussion ............................................................................................................. 40
L’absence de polyphosphate augmente la sensibilité à la D-cyclosérine ............................ 40
Le polyphosphate n’intervient pas dans la synthèse du peptidoglycane ............................ 42
Le manque de polyphosphate ne diminue pas la perméabilité d’Escherichia coli .............. 45
Le polyphosphate semble impliqué dans la synthèse des protéines ................................... 47
Discussion ............................................................................................................................. 56
Perspectives.............................................................................................................................. 59
Détermination des CMI et CMB en milieu liquide ................................................................ 59
Quantification de la concentration intra-bactérienne en polyphosphate ........................... 60
Analyse de l’expression génique par RT-qPCR ..................................................................... 60
Extraits protéiques ................................................................................................................ 61
Séquençage d’insertion de transposon ................................................................................ 61
Conclusion générale .....................................................................................................................
Liste des figures ........................................................................................................................ 65
Liste des abréviations ............................................................................................................... 67
Bibliographie ................................................................................................................................
Annexes ........................................................................................................................................Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89148 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Étude de l’impact des étapes pré analytiques et analytiques sur l’agrégation, les caractéristiques et la numération plaquettaire. / Sultan Kasikci
Titre : Étude de l’impact des étapes pré analytiques et analytiques sur l’agrégation, les caractéristiques et la numération plaquettaire. Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Sultan Kasikci, Auteur ; Gaël Gilbert, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale CHU Dinant Godinne Mont Godinne Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Ce travail de fin d’études aborde l’impact des étapes pré-analytiques et analytiques telles que le type d’anticoagulant, l’homogénéisation du prélèvement, le délai et le diluant sur l’agrégation plaquettaire, les caractéristiques plaquettaires (volume plaquettaire moyen, fraction immature des plaquettes) et sur la numération plaquettaire.
Depuis peu, une nouvelle alternative a été mise au point pour mesurer l’agrégation plaquettaire. Elle vise à substituer le tube hirudine par le tube citrate à condition d’utiliser le chlorure de calcium en échange du chlorure de sodium afin d’obtenir une agrégation plaquettaire identique entre le sang récolté sur tube hirudine et le sang récolté sur tube citrate en utilisant toujours les mêmes inducteurs. Afin de vérifier l’impact du calcium sur l’agrégation plaquettaire, une autre série d’agrégation plaquettaire sera réalisée à partir de sang récolté sur tube citrate dilué au chlorure de sodium.
En parallèle, le Sysmex XN 9000 a effectué la numération plaquettaire par impédance, fluorescence et par méthode optique ainsi que le MPV et l’IPF sur tubes citrate, hirudine et EDTA. De plus, des frottis ont été tirés et colorés avec ces mêmes tubes afin de justifier les éventuelles variations de la numération plaquettaire.
La numération plaquettaire, les paramètres caractérisant les plaquettes, l’agrégation, ainsi que les frottis de sang seront effectués au cours des délais suivants : 5, 30, 60, 120 et 180 minutes.
Afin de mener à bien cette étude, vingt personnes ont fait don de leur sang.
Cette étude a démontré qu’il était préférable de réaliser les agrégations plaquettaires sur tube hirudine dilué au NaCl entre 30 et 120 minutes avec le Multiplate et que la numération plaquettaire au Sysmex doit s’effectuer sur EDTA entre 5 et 120 minutes. De plus, la fraction immature plaquettaire peut être mesurée sur EDTA entre 5 et 180 minutes ou sur citrate entre 30 et 180 minutes. Finalement, il est préférable de mesurer le volume plaquettaire moyen sur citrate entre 30 et 180 minutes sachant que cette variable est moins stable que l’IPF.
En conclusion, les étapes pré-analytiques et analytiques telles que le type d’anticoagulant, l’homogénéisation du prélèvement, le délai et le diluant doivent être standardisés car ils influencent l’agrégation plaquettaire, les caractéristiques (volume plaquettaire moyen et fraction immature des plaquettes) et la numération plaquettaire.Note de contenu : Présentation du lieu de stage ................................................................................................................... 5
Introduction générale ............................................................................................................................... 6
1. Contexte théorique .............................................................................................................................. 7
1.1 L’hémostase ................................................................................................................................... 7
1.2 L’hémostase primaire .................................................................................................................... 7
1.2.1 La paroi vasculaire ...................................................................................................................... 7
1.2.2 Le facteur Von Willebrand .......................................................................................................... 8
1.3 Les plaquettes................................................................................................................................ 8
1.3.1 L’origine plaquettaire ............................................................................................................. 8
1.3.2 La structure plaquettaire ....................................................................................................... 8
1.3.3 Les fonctions plaquettaires .................................................................................................. 10
1.4 Les étapes menant à l’agrégation plaquettaire .......................................................................... 10
1.4.1 L’adhésion plaquettaire ............................................................................................................ 10
1.4.2 L’activation plaquettaire ........................................................................................................... 11
1.4.3 L’agrégation plaquettaire ......................................................................................................... 12
1.4.3.1 L’adénosine diphosphate ................................................................................................... 12
1.4.3.2 Le collagène ....................................................................................................................... 13
1.4.3.3 Le peptide activant le récepteur de la thrombine ............................................................. 13
1.4.3.4 Les valeurs de référence .................................................................................................... 14
1.5 Application clinique de l’agrégation plaquettaire ....................................................................... 14
1.5.1 L’intérêt clinique de l’étude de la fonction plaquettaire ......................................................... 14
1.5.2 Les tests d’agrégation plaquettaire .......................................................................................... 15
1.5.3 Le système Multiplate .............................................................................................................. 16
1.5.3.1 Principe du Multiplate ....................................................................................................... 16
1.5.3.2 Appareillage du Multiplate ................................................................................................ 17
1.6 La numération et les caractéristiques plaquettaires avec le Sysmex XN 9000 ........................... 18
1.6.1 La numération plaquettaire par impédancemétrie .................................................................. 19
1.6.2 La numération plaquettaire par méthode optique .................................................................. 19
1.6.3 La numération plaquettaire par fluorescence .......................................................................... 21
1.6.4 La mesure des caractéristiques plaquettaires avec le Sysmex XN 9000 .................................. 22
1.6.4.1 Le volume plaquettaire moyen .......................................................................................... 22
1.6.4.2 La fraction immature plaquettaire .................................................................................... 23
1.7 Le frottis sanguin ......................................................................................................................... 24
1.8 L’impact des étapes pré-analytiques et analytiques ....................................................................... 24
1.8.1 Avant le prélèvement ............................................................................................................... 25
1.8.1.1 Le choix des anticoagulants ............................................................................................... 25
1.8.2 Pendant le prélèvement ........................................................................................................... 27
1.8.3 Après le prélèvement ............................................................................................................... 27
2. Objectifs et stratégie ......................................................................................................................... 28
2.1 Les objectifs ..................................................................................................................................... 28
2.2 La stratégie ....................................................................................................................................... 28
3. Matériel et méthode.......................................................................................................................... 29
3.1 Matériel ....................................................................................................................................... 29
3.1.1 Matériel pour le comptage des agrégats plaquettaires au microscope .................................. 29
3.1.2 Matériel pour l’agrégation plaquettaire ................................................................................... 29
3.1.3 Matériel pour la numération plaquettaire au Sysmex XN9000 ............................................... 30
3.1.4 Matériel pour la réalisation des frottis sanguins ...................................................................... 30
3.2 Méthode ...................................................................................................................................... 30
4. Résultats et discussions ..................................................................................................................... 34
4.1 Résultats de l’agrégation plaquettaire ............................................................................................ 34
4.2 Discussion concernant l’agrégation plaquettaire ............................................................................ 38
4.3 Résultats de la numération plaquettaire ......................................................................................... 40
4.4 Discussion concernant la numération plaquettaire ........................................................................ 45
4.5 Résultats du pourcentage d’agrégats plaquettaires ....................................................................... 47
4.6 Discussion concernant le pourcentage d’agrégats plaquettaires ................................................... 48
4.7 Résultats des caractéristiques plaquettaires ................................................................................... 49
4.8 Discussion concernant les caractéristiques plaquettaires .............................................................. 52
5. Conclusion générale........................................................................................................................... 54
Liste des figures ....................................................................................................................................... 55
Liste des tableaux .................................................................................................................................... 56
Abréviations ............................................................................................................................................ 57
Bibliographie ........................................................................................................................................... 58
Annexes ................................................................................................................................................... 61Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79992 Étude de l’impact des étapes pré analytiques et analytiques sur l’agrégation, les caractéristiques et la numération plaquettaire. [TFE / Mémoire] / Sultan Kasikci, Auteur ; Gaël Gilbert, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale CHU Dinant Godinne Mont Godinne Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Ce travail de fin d’études aborde l’impact des étapes pré-analytiques et analytiques telles que le type d’anticoagulant, l’homogénéisation du prélèvement, le délai et le diluant sur l’agrégation plaquettaire, les caractéristiques plaquettaires (volume plaquettaire moyen, fraction immature des plaquettes) et sur la numération plaquettaire.
Depuis peu, une nouvelle alternative a été mise au point pour mesurer l’agrégation plaquettaire. Elle vise à substituer le tube hirudine par le tube citrate à condition d’utiliser le chlorure de calcium en échange du chlorure de sodium afin d’obtenir une agrégation plaquettaire identique entre le sang récolté sur tube hirudine et le sang récolté sur tube citrate en utilisant toujours les mêmes inducteurs. Afin de vérifier l’impact du calcium sur l’agrégation plaquettaire, une autre série d’agrégation plaquettaire sera réalisée à partir de sang récolté sur tube citrate dilué au chlorure de sodium.
En parallèle, le Sysmex XN 9000 a effectué la numération plaquettaire par impédance, fluorescence et par méthode optique ainsi que le MPV et l’IPF sur tubes citrate, hirudine et EDTA. De plus, des frottis ont été tirés et colorés avec ces mêmes tubes afin de justifier les éventuelles variations de la numération plaquettaire.
La numération plaquettaire, les paramètres caractérisant les plaquettes, l’agrégation, ainsi que les frottis de sang seront effectués au cours des délais suivants : 5, 30, 60, 120 et 180 minutes.
Afin de mener à bien cette étude, vingt personnes ont fait don de leur sang.
Cette étude a démontré qu’il était préférable de réaliser les agrégations plaquettaires sur tube hirudine dilué au NaCl entre 30 et 120 minutes avec le Multiplate et que la numération plaquettaire au Sysmex doit s’effectuer sur EDTA entre 5 et 120 minutes. De plus, la fraction immature plaquettaire peut être mesurée sur EDTA entre 5 et 180 minutes ou sur citrate entre 30 et 180 minutes. Finalement, il est préférable de mesurer le volume plaquettaire moyen sur citrate entre 30 et 180 minutes sachant que cette variable est moins stable que l’IPF.
En conclusion, les étapes pré-analytiques et analytiques telles que le type d’anticoagulant, l’homogénéisation du prélèvement, le délai et le diluant doivent être standardisés car ils influencent l’agrégation plaquettaire, les caractéristiques (volume plaquettaire moyen et fraction immature des plaquettes) et la numération plaquettaire.Note de contenu : Présentation du lieu de stage ................................................................................................................... 5
Introduction générale ............................................................................................................................... 6
1. Contexte théorique .............................................................................................................................. 7
1.1 L’hémostase ................................................................................................................................... 7
1.2 L’hémostase primaire .................................................................................................................... 7
1.2.1 La paroi vasculaire ...................................................................................................................... 7
1.2.2 Le facteur Von Willebrand .......................................................................................................... 8
1.3 Les plaquettes................................................................................................................................ 8
1.3.1 L’origine plaquettaire ............................................................................................................. 8
1.3.2 La structure plaquettaire ....................................................................................................... 8
1.3.3 Les fonctions plaquettaires .................................................................................................. 10
1.4 Les étapes menant à l’agrégation plaquettaire .......................................................................... 10
1.4.1 L’adhésion plaquettaire ............................................................................................................ 10
1.4.2 L’activation plaquettaire ........................................................................................................... 11
1.4.3 L’agrégation plaquettaire ......................................................................................................... 12
1.4.3.1 L’adénosine diphosphate ................................................................................................... 12
1.4.3.2 Le collagène ....................................................................................................................... 13
1.4.3.3 Le peptide activant le récepteur de la thrombine ............................................................. 13
1.4.3.4 Les valeurs de référence .................................................................................................... 14
1.5 Application clinique de l’agrégation plaquettaire ....................................................................... 14
1.5.1 L’intérêt clinique de l’étude de la fonction plaquettaire ......................................................... 14
1.5.2 Les tests d’agrégation plaquettaire .......................................................................................... 15
1.5.3 Le système Multiplate .............................................................................................................. 16
1.5.3.1 Principe du Multiplate ....................................................................................................... 16
1.5.3.2 Appareillage du Multiplate ................................................................................................ 17
1.6 La numération et les caractéristiques plaquettaires avec le Sysmex XN 9000 ........................... 18
1.6.1 La numération plaquettaire par impédancemétrie .................................................................. 19
1.6.2 La numération plaquettaire par méthode optique .................................................................. 19
1.6.3 La numération plaquettaire par fluorescence .......................................................................... 21
1.6.4 La mesure des caractéristiques plaquettaires avec le Sysmex XN 9000 .................................. 22
1.6.4.1 Le volume plaquettaire moyen .......................................................................................... 22
1.6.4.2 La fraction immature plaquettaire .................................................................................... 23
1.7 Le frottis sanguin ......................................................................................................................... 24
1.8 L’impact des étapes pré-analytiques et analytiques ....................................................................... 24
1.8.1 Avant le prélèvement ............................................................................................................... 25
1.8.1.1 Le choix des anticoagulants ............................................................................................... 25
1.8.2 Pendant le prélèvement ........................................................................................................... 27
1.8.3 Après le prélèvement ............................................................................................................... 27
2. Objectifs et stratégie ......................................................................................................................... 28
2.1 Les objectifs ..................................................................................................................................... 28
2.2 La stratégie ....................................................................................................................................... 28
3. Matériel et méthode.......................................................................................................................... 29
3.1 Matériel ....................................................................................................................................... 29
3.1.1 Matériel pour le comptage des agrégats plaquettaires au microscope .................................. 29
3.1.2 Matériel pour l’agrégation plaquettaire ................................................................................... 29
3.1.3 Matériel pour la numération plaquettaire au Sysmex XN9000 ............................................... 30
3.1.4 Matériel pour la réalisation des frottis sanguins ...................................................................... 30
3.2 Méthode ...................................................................................................................................... 30
4. Résultats et discussions ..................................................................................................................... 34
4.1 Résultats de l’agrégation plaquettaire ............................................................................................ 34
4.2 Discussion concernant l’agrégation plaquettaire ............................................................................ 38
4.3 Résultats de la numération plaquettaire ......................................................................................... 40
4.4 Discussion concernant la numération plaquettaire ........................................................................ 45
4.5 Résultats du pourcentage d’agrégats plaquettaires ....................................................................... 47
4.6 Discussion concernant le pourcentage d’agrégats plaquettaires ................................................... 48
4.7 Résultats des caractéristiques plaquettaires ................................................................................... 49
4.8 Discussion concernant les caractéristiques plaquettaires .............................................................. 52
5. Conclusion générale........................................................................................................................... 54
Liste des figures ....................................................................................................................................... 55
Liste des tableaux .................................................................................................................................... 56
Abréviations ............................................................................................................................................ 57
Bibliographie ........................................................................................................................................... 58
Annexes ................................................................................................................................................... 61Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79992 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etude des mécanismes moléculaires contrôlant la réponse chimiotactique de la bactérie Caulobacter crescentus face au cuivre / Vincent Paquet
Titre : Etude des mécanismes moléculaires contrôlant la réponse chimiotactique de la bactérie Caulobacter crescentus face au cuivre Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Vincent Paquet, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Notre environnement est constamment soumis à des variations de température, de concentration en CO2 dans l’air, ou encore à la présence de produits toxiques dans les mers ou les océans. L’augmentation de la concentration en cuivre (Cu) dans les eaux provoquant des stress oxydatifs pour les bactéries qui y sont exposées en est un exemple. Pour éviter des troubles métaboliques, les bactéries développent divers mécanismes de réponses adaptatifs. Caulobacter crescentus est un exemple de ces bactéries qui possède un mécanisme spécifique mis en oeuvre pour résister à ces variations extérieures. En effet, cet organisme aquatique possède un cycle cellulaire assez particulier. Son cycle cellulaire donne naissance à deux
cellules filles totalement différentes que ce soit morphologiquement ou fonctionnellement. Ces deux cellules sont appelées stalked et swarmer. Ces deux cellules réagissent différemment dans un milieu ou la concentration en Cu est stressante. D’un côté, la cellule stalked possède
un système appelé PcoAB qui lui permet de réguler sa concentration intracellulaire en Cu et de l’autre côté, la cellule swarmer peut à l’aide de son flagelle s’éloigner de cet environnement présentant le stress dû au Cu. Ce mécanisme est d’ailleurs appelé le chimiotactisme.
En ce moment, une étude visant à caractériser le chimiotactisme de C. crescentus est menée dans le laboratoire de l’URBM. Ce travail de fin d’étude s’inscrit dans le cadre de cette recherche. L’objectif premier de ce travail est de mettre au point deux protocoles simples et
rapides qui permettent une mise en évidence directe d’un mouvement dû à ce chimiotactisme. Ces deux expériences se basent sur des principes différents, l’une se base sur des gouttières de nage et l’autre se base sur une plaque 96 puits. Ces deux expérimentations
seront adaptées depuis un protocole standard existant afin de trouver les conditions optimales pour visualiser significativement un mouvement chimiotactique.
L’autre axe de ce travail vise à caractériser une protéine reconnue comme un acteur potentiellement important dans ce processus chimiotactique. Pour ce faire, un protocole de surexpression optimale de cette protéine sera mis au point sur base d’un procédé existant et utilisé pour la surexpression d’autres protéines. Pour caractériser cette protéine après surexpression, elle sera purifiée et cristallisée pour en étudier sa structure tridimensionnelle.Note de contenu : Présentation du lieu de stage ................................................................................................ 9
Introduction générale ............................................................................................................11
1. Contexte théorique ........................................................................................................13
1.1 Caulobacter crescentus ..........................................................................................13
1.2 Chimiotactisme .......................................................................................................15
1.3 Methyl-accepting Chemotaxis Protein (MCP) .........................................................17
2. Contexte de la recherche et objectifs .............................................................................19
3. Matériel et méthode .......................................................................................................21
3.1 Test gouttière : Protocole standard .........................................................................21
3.1.1 1ere mise au point.............................................................................................22
3.1.2 2e mise au point...............................................................................................22
3.1.3 3e mise au point...............................................................................................23
3.2 Test de chimiotactisme en plaque 96 puits : protocole standard .............................24
3.2.1 1ere mise au point.............................................................................................25
3.2.2 2e mise au point...............................................................................................26
3.2.3 3e mise au point...............................................................................................27
3.3 Production de souche BL21-pET28a-mcpP ............................................................28
3.3.1 Construction souche BL21-pET28a-mcpP .......................................................28
3.4 Surexpression de BL21-pET28A-mcpP ..................................................................32
3.4.1 Cultures LB-Kan en petit volume de BL21-pET28a-mcpP ...............................32
3.4.2 Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction à l’IPTG en petit volume ...........33
4. Résultats et discussion ..................................................................................................35
4.1 Gouttières ..............................................................................................................35
4.1.1 1ere mise au point .............................................................................................35
4.1.2 2e mise au point...............................................................................................36
4.1.3 3e mise au point...............................................................................................38
4.2 Test de chimiotactisme en Plaque 96 puits ............................................................40
4.2.1 1ere mise au point.............................................................................................40
4.2.2 2e mise au point...............................................................................................41
4.2.3 3e mise au point...............................................................................................42
4.3 Surexpression de McpP .........................................................................................43
4.3.1 Construction de la souche BL21-pET28a-mcpP ..............................................43
4.3.2 Vérification de la surexpression de BL21-pET28a-mcpP .................................45
Conclusion ...........................................................................................................................47
Bibliographie ........................................................................................................................49
Liste des figures ...................................................................................................................50
Liste des tableaux ................................................................................................................50
AnnexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79997 Etude des mécanismes moléculaires contrôlant la réponse chimiotactique de la bactérie Caulobacter crescentus face au cuivre [TFE / Mémoire] / Vincent Paquet, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Notre environnement est constamment soumis à des variations de température, de concentration en CO2 dans l’air, ou encore à la présence de produits toxiques dans les mers ou les océans. L’augmentation de la concentration en cuivre (Cu) dans les eaux provoquant des stress oxydatifs pour les bactéries qui y sont exposées en est un exemple. Pour éviter des troubles métaboliques, les bactéries développent divers mécanismes de réponses adaptatifs. Caulobacter crescentus est un exemple de ces bactéries qui possède un mécanisme spécifique mis en oeuvre pour résister à ces variations extérieures. En effet, cet organisme aquatique possède un cycle cellulaire assez particulier. Son cycle cellulaire donne naissance à deux
cellules filles totalement différentes que ce soit morphologiquement ou fonctionnellement. Ces deux cellules sont appelées stalked et swarmer. Ces deux cellules réagissent différemment dans un milieu ou la concentration en Cu est stressante. D’un côté, la cellule stalked possède
un système appelé PcoAB qui lui permet de réguler sa concentration intracellulaire en Cu et de l’autre côté, la cellule swarmer peut à l’aide de son flagelle s’éloigner de cet environnement présentant le stress dû au Cu. Ce mécanisme est d’ailleurs appelé le chimiotactisme.
En ce moment, une étude visant à caractériser le chimiotactisme de C. crescentus est menée dans le laboratoire de l’URBM. Ce travail de fin d’étude s’inscrit dans le cadre de cette recherche. L’objectif premier de ce travail est de mettre au point deux protocoles simples et
rapides qui permettent une mise en évidence directe d’un mouvement dû à ce chimiotactisme. Ces deux expériences se basent sur des principes différents, l’une se base sur des gouttières de nage et l’autre se base sur une plaque 96 puits. Ces deux expérimentations
seront adaptées depuis un protocole standard existant afin de trouver les conditions optimales pour visualiser significativement un mouvement chimiotactique.
L’autre axe de ce travail vise à caractériser une protéine reconnue comme un acteur potentiellement important dans ce processus chimiotactique. Pour ce faire, un protocole de surexpression optimale de cette protéine sera mis au point sur base d’un procédé existant et utilisé pour la surexpression d’autres protéines. Pour caractériser cette protéine après surexpression, elle sera purifiée et cristallisée pour en étudier sa structure tridimensionnelle.Note de contenu : Présentation du lieu de stage ................................................................................................ 9
Introduction générale ............................................................................................................11
1. Contexte théorique ........................................................................................................13
1.1 Caulobacter crescentus ..........................................................................................13
1.2 Chimiotactisme .......................................................................................................15
1.3 Methyl-accepting Chemotaxis Protein (MCP) .........................................................17
2. Contexte de la recherche et objectifs .............................................................................19
3. Matériel et méthode .......................................................................................................21
3.1 Test gouttière : Protocole standard .........................................................................21
3.1.1 1ere mise au point.............................................................................................22
3.1.2 2e mise au point...............................................................................................22
3.1.3 3e mise au point...............................................................................................23
3.2 Test de chimiotactisme en plaque 96 puits : protocole standard .............................24
3.2.1 1ere mise au point.............................................................................................25
3.2.2 2e mise au point...............................................................................................26
3.2.3 3e mise au point...............................................................................................27
3.3 Production de souche BL21-pET28a-mcpP ............................................................28
3.3.1 Construction souche BL21-pET28a-mcpP .......................................................28
3.4 Surexpression de BL21-pET28A-mcpP ..................................................................32
3.4.1 Cultures LB-Kan en petit volume de BL21-pET28a-mcpP ...............................32
3.4.2 Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction à l’IPTG en petit volume ...........33
4. Résultats et discussion ..................................................................................................35
4.1 Gouttières ..............................................................................................................35
4.1.1 1ere mise au point .............................................................................................35
4.1.2 2e mise au point...............................................................................................36
4.1.3 3e mise au point...............................................................................................38
4.2 Test de chimiotactisme en Plaque 96 puits ............................................................40
4.2.1 1ere mise au point.............................................................................................40
4.2.2 2e mise au point...............................................................................................41
4.2.3 3e mise au point...............................................................................................42
4.3 Surexpression de McpP .........................................................................................43
4.3.1 Construction de la souche BL21-pET28a-mcpP ..............................................43
4.3.2 Vérification de la surexpression de BL21-pET28a-mcpP .................................45
Conclusion ...........................................................................................................................47
Bibliographie ........................................................................................................................49
Liste des figures ...................................................................................................................50
Liste des tableaux ................................................................................................................50
AnnexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79997 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Étude de la phosphosérine phosphatase de Mycobacterium marinum : Production, purification et détermination de paramètres enzymatiques. / Adrien Lesne
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PermalinkEvaluation comparative de l’antibiogramme rapide de l’EUCAST (RAST) avec les méthodes standards / Vanessa Siani Yanken
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