Centre de Documentation Campus Montignies
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Lundi : 8h-18h30
Mardi : 8h-18h30
Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Auteur François Beaufay |
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Étude de la fonction du polyphosphate dans la résistance à la D-cyclosérine / Sarah Willems
Titre : Étude de la fonction du polyphosphate dans la résistance à la D-cyclosérine Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Sarah Willems, Auteur ; François Beaufay, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2020 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le polyphosphate, un biopolymère composé d’une chaîne allant jusqu’à 1000 résidus de phosphates inorganiques, est retrouvé chez tous les organismes étudiés. Il est considéré comme une molécule ancestrale ayant contribué à l’émergence de la vie sur terre. Ce polyanion remplit un nombre surprenant de fonctions cellulaires très diversifiées permettant aux organismes de résister aux conditions de stress les plus extrêmes. Chez les eucaryotes multicellulaires complexes, le polyphosphate a notamment été associé à l’hémostase et l’amylogenèse. Chez les procaryotes, ce polymère est impliqué, entre autres, dans la chélation des métaux, la virulence et le métabolisme énergétique. Deux des fonctions du polyphosphate récemment découvertes ont une importance particulière dans ce travail ; sa capacité à agir en tant que chaperonne et sa fonction dans la régulation de la mobilité des éléments génétiques mobiles.
Connaissant l’importance de cette molécule dans la réponse au stress, il n’est pas étonnant qu’un mutant dépourvu de l’enzyme de synthèse du polyphosphate soit considérablement plus sensible à diverses conditions telles que la chaleur, le manque de ressources nutritives et le stress oxydatif. Lors de travaux précédents, mon maître de stage a pu observer chez une souche mutante d’Escherichia coli incapable de synthétiser le polyphosphate, une sensibilité exacerbée pour la D-cyclosérine (antibiotique ciblant la synthèse du peptidoglycane) en comparaison à une souche de phénotype sauvage.
L’objectif de ce travail consiste à reproduire cet effet et à déterminer ensuite s’il est spécifique à la D-cyclosérine ou général et applicable à d’autres antibiotiques. Il s’agit également de déterminer s’il est associé à une famille d’antibiotique, à une cible, ou à un mécanisme particulier. Pour finir, il consiste à définir précisément le rôle du polyphosphate dans la résistance contre ces antibiotiques.
Pour ce faire, nous avons entrepris une étude de la sensibilité de mutants d’Escherichia coli possédant divers taux intracellulaires de polyphosphate après contact avec des concentrations croissantes de différents antibiotiques testés. Les molécules ont été sélectionnées afin de couvrir un large spectre de mécanismes d’action et de cibles.
Il s’agirait désormais de quantifier précisément le degré de sensibilité d’une souche dépourvue en polyphosphate par une détermination des concentrations minimales inhibitrices et bactéricides. Il faudrait également évaluer si le stress causé par les antibiotiques induit une accumulation de polyphosphate en quantifiant son taux cellulaire. Aussi, il serait intéressant de déterminer si la protection du polyphosphate est liée à sa fonction chaperonne par analyse de l’expression génique par RT-qPCR et par quantification de l’agrégation protéique. Et finalement une analyse globale de la fonction des gènes par tn-seq sera entreprise.Note de contenu : Table des matières
Remerciements ............................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 9
Introduction générale...................................................................................................................
Contexte général ...................................................................................................................... 13
Le polyphosphate ................................................................................................................. 13
Le polyphosphate, une molécule universellement conservée ......................................... 13
La biosynthèse du polyphosphate .................................................................................... 14
Le polyphosphate, un polymère multifonctionnel ........................................................... 15
Le polyphosphate est une chaperonne majeure .............................................................. 20
Un nouveau rôle pour le polyphosphate .......................................................................... 22
Les antibiotiques ................................................................................................................... 24
Mécanismes d’action des antibiotiques ........................................................................... 25
Les antibiotiques agissant sur la synthèse du peptidoglycane ..................................... 26
Le peptidoglycane ...................................................................................................... 26
Structure du peptidoglycane ................................................................................. 26
Synthèse du peptidoglycane .................................................................................. 27
L’ampicilline et la céphalexine ................................................................................... 28
La fosfomycine ........................................................................................................... 29
Les antibiotiques agissant sur la synthèse et/ou le fonctionnement de l’ADN ............ 29
L’ofloxacine ................................................................................................................ 29
La rifampicine ............................................................................................................ 29
Les antibiotiques inhibant la synthèse protéique ......................................................... 29
La streptomycine, la kanamycine et la gentamicine ................................................. 29
L‘érythromycine ......................................................................................................... 29
Le chloramphénicol ................................................................................................... 30
La tétracycline ............................................................................................................ 30
La D-cyclosérine ............................................................................................................. 30
Mécanismes d’action et de résistance à la D-cyclosérine ......................................... 30
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 32
Matériel et méthodes .............................................................................................................. 34
Tests de survie ...................................................................................................................... 34
Matériel biologique ........................................................................................................... 34
Solutions d’antibiotiques .................................................................................................. 34
Milieux de culture ............................................................................................................. 35
Méthode des tests de survie ............................................................................................. 35
Construction génétique du plasmide pKOV exprimant le gène ppk et transformation de souches Δppk ........................................................................................................................ 36
Le plasmide pKOV ............................................................................................................. 36
Préparation rapide d’ADN plasmidique (miniprep) .......................................................... 37
Polymerase chain reaction (PCR) ...................................................................................... 37
Électrophorèse sur gel d’agarose...................................................................................... 38
Digestion d’ADN par enzyme de restriction ..................................................................... 38
Déphosphorylation de pKOV ............................................................................................ 39
Ligation de pKOV et du produit PCR ppk .......................................................................... 39
Préparation des bactéries compétentes ........................................................................... 39
Transformation des bactéries compétentes et sélection des transformants .................. 39
Résultats et discussion ............................................................................................................. 40
L’absence de polyphosphate augmente la sensibilité à la D-cyclosérine ............................ 40
Le polyphosphate n’intervient pas dans la synthèse du peptidoglycane ............................ 42
Le manque de polyphosphate ne diminue pas la perméabilité d’Escherichia coli .............. 45
Le polyphosphate semble impliqué dans la synthèse des protéines ................................... 47
Discussion ............................................................................................................................. 56
Perspectives.............................................................................................................................. 59
Détermination des CMI et CMB en milieu liquide ................................................................ 59
Quantification de la concentration intra-bactérienne en polyphosphate ........................... 60
Analyse de l’expression génique par RT-qPCR ..................................................................... 60
Extraits protéiques ................................................................................................................ 61
Séquençage d’insertion de transposon ................................................................................ 61
Conclusion générale .....................................................................................................................
Liste des figures ........................................................................................................................ 65
Liste des abréviations ............................................................................................................... 67
Bibliographie ................................................................................................................................
Annexes ........................................................................................................................................Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89148 Étude de la fonction du polyphosphate dans la résistance à la D-cyclosérine [TFE / Mémoire] / Sarah Willems, Auteur ; François Beaufay, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2020.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le polyphosphate, un biopolymère composé d’une chaîne allant jusqu’à 1000 résidus de phosphates inorganiques, est retrouvé chez tous les organismes étudiés. Il est considéré comme une molécule ancestrale ayant contribué à l’émergence de la vie sur terre. Ce polyanion remplit un nombre surprenant de fonctions cellulaires très diversifiées permettant aux organismes de résister aux conditions de stress les plus extrêmes. Chez les eucaryotes multicellulaires complexes, le polyphosphate a notamment été associé à l’hémostase et l’amylogenèse. Chez les procaryotes, ce polymère est impliqué, entre autres, dans la chélation des métaux, la virulence et le métabolisme énergétique. Deux des fonctions du polyphosphate récemment découvertes ont une importance particulière dans ce travail ; sa capacité à agir en tant que chaperonne et sa fonction dans la régulation de la mobilité des éléments génétiques mobiles.
Connaissant l’importance de cette molécule dans la réponse au stress, il n’est pas étonnant qu’un mutant dépourvu de l’enzyme de synthèse du polyphosphate soit considérablement plus sensible à diverses conditions telles que la chaleur, le manque de ressources nutritives et le stress oxydatif. Lors de travaux précédents, mon maître de stage a pu observer chez une souche mutante d’Escherichia coli incapable de synthétiser le polyphosphate, une sensibilité exacerbée pour la D-cyclosérine (antibiotique ciblant la synthèse du peptidoglycane) en comparaison à une souche de phénotype sauvage.
L’objectif de ce travail consiste à reproduire cet effet et à déterminer ensuite s’il est spécifique à la D-cyclosérine ou général et applicable à d’autres antibiotiques. Il s’agit également de déterminer s’il est associé à une famille d’antibiotique, à une cible, ou à un mécanisme particulier. Pour finir, il consiste à définir précisément le rôle du polyphosphate dans la résistance contre ces antibiotiques.
Pour ce faire, nous avons entrepris une étude de la sensibilité de mutants d’Escherichia coli possédant divers taux intracellulaires de polyphosphate après contact avec des concentrations croissantes de différents antibiotiques testés. Les molécules ont été sélectionnées afin de couvrir un large spectre de mécanismes d’action et de cibles.
Il s’agirait désormais de quantifier précisément le degré de sensibilité d’une souche dépourvue en polyphosphate par une détermination des concentrations minimales inhibitrices et bactéricides. Il faudrait également évaluer si le stress causé par les antibiotiques induit une accumulation de polyphosphate en quantifiant son taux cellulaire. Aussi, il serait intéressant de déterminer si la protection du polyphosphate est liée à sa fonction chaperonne par analyse de l’expression génique par RT-qPCR et par quantification de l’agrégation protéique. Et finalement une analyse globale de la fonction des gènes par tn-seq sera entreprise.Note de contenu : Table des matières
Remerciements ............................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 9
Introduction générale...................................................................................................................
Contexte général ...................................................................................................................... 13
Le polyphosphate ................................................................................................................. 13
Le polyphosphate, une molécule universellement conservée ......................................... 13
La biosynthèse du polyphosphate .................................................................................... 14
Le polyphosphate, un polymère multifonctionnel ........................................................... 15
Le polyphosphate est une chaperonne majeure .............................................................. 20
Un nouveau rôle pour le polyphosphate .......................................................................... 22
Les antibiotiques ................................................................................................................... 24
Mécanismes d’action des antibiotiques ........................................................................... 25
Les antibiotiques agissant sur la synthèse du peptidoglycane ..................................... 26
Le peptidoglycane ...................................................................................................... 26
Structure du peptidoglycane ................................................................................. 26
Synthèse du peptidoglycane .................................................................................. 27
L’ampicilline et la céphalexine ................................................................................... 28
La fosfomycine ........................................................................................................... 29
Les antibiotiques agissant sur la synthèse et/ou le fonctionnement de l’ADN ............ 29
L’ofloxacine ................................................................................................................ 29
La rifampicine ............................................................................................................ 29
Les antibiotiques inhibant la synthèse protéique ......................................................... 29
La streptomycine, la kanamycine et la gentamicine ................................................. 29
L‘érythromycine ......................................................................................................... 29
Le chloramphénicol ................................................................................................... 30
La tétracycline ............................................................................................................ 30
La D-cyclosérine ............................................................................................................. 30
Mécanismes d’action et de résistance à la D-cyclosérine ......................................... 30
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 32
Matériel et méthodes .............................................................................................................. 34
Tests de survie ...................................................................................................................... 34
Matériel biologique ........................................................................................................... 34
Solutions d’antibiotiques .................................................................................................. 34
Milieux de culture ............................................................................................................. 35
Méthode des tests de survie ............................................................................................. 35
Construction génétique du plasmide pKOV exprimant le gène ppk et transformation de souches Δppk ........................................................................................................................ 36
Le plasmide pKOV ............................................................................................................. 36
Préparation rapide d’ADN plasmidique (miniprep) .......................................................... 37
Polymerase chain reaction (PCR) ...................................................................................... 37
Électrophorèse sur gel d’agarose...................................................................................... 38
Digestion d’ADN par enzyme de restriction ..................................................................... 38
Déphosphorylation de pKOV ............................................................................................ 39
Ligation de pKOV et du produit PCR ppk .......................................................................... 39
Préparation des bactéries compétentes ........................................................................... 39
Transformation des bactéries compétentes et sélection des transformants .................. 39
Résultats et discussion ............................................................................................................. 40
L’absence de polyphosphate augmente la sensibilité à la D-cyclosérine ............................ 40
Le polyphosphate n’intervient pas dans la synthèse du peptidoglycane ............................ 42
Le manque de polyphosphate ne diminue pas la perméabilité d’Escherichia coli .............. 45
Le polyphosphate semble impliqué dans la synthèse des protéines ................................... 47
Discussion ............................................................................................................................. 56
Perspectives.............................................................................................................................. 59
Détermination des CMI et CMB en milieu liquide ................................................................ 59
Quantification de la concentration intra-bactérienne en polyphosphate ........................... 60
Analyse de l’expression génique par RT-qPCR ..................................................................... 60
Extraits protéiques ................................................................................................................ 61
Séquençage d’insertion de transposon ................................................................................ 61
Conclusion générale .....................................................................................................................
Liste des figures ........................................................................................................................ 65
Liste des abréviations ............................................................................................................... 67
Bibliographie ................................................................................................................................
Annexes ........................................................................................................................................Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89148 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Persistance bactérienne à l’ofloxacine : le polyphosphate / Sarah Maque
Titre : Persistance bactérienne à l’ofloxacine : le polyphosphate Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Sarah Maque ; François Beaufay, Promoteur du mémoire Editeur : Montignies-sur-Sambre : Haute Ecole Louvain en Hainaut Année de publication : 2023 Importance : 60p. Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur . Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La découverte accidentelle des antibiotiques fut une révolution majeure dans le traitement des infections. Malheureusement, leur mauvaise utilisation a engendré une pression de sélection qui a permet aux bactéries résistantes et persistantes de se propager.
À l’heure actuelle, la résistance et la persistance bactérienne sont un réel problème de santé publique. Voilà pourquoi certaines études voient le jour afin de développer des solutions pour faire face à ces phénomènes. C’est dans ce projet que l’étude du polyphosphate est né. Le polyphosphate est un polymère linéaire de phosphate inorganique. Présent chez les procaryotes, les eucaryotes et les archées, il est associé à de nombreuses fonctions tel que des mécanismes de résistance au stress. Chez les bactéries, les antibiotiques sont considérés comme un stress. L’objectif de ce stage et de ce travail de fin d’études est de comprendre le rôle du polyphosphate dans les mécanismes de résistance et de persistance bactérienne, et plus précisément dans la persistance à l’ofloxacine. L’ofloxacine est un antibiotique faisant partie de la famille des quinolones. Les quinolones sont des molécules synthétiques dont le mécanisme d’action est d’inhiber la synthèse de l’ADN bactérien. Les anciens résultats obtenus par François Beaufay démontrent que les souches dépourvues de polyphosphate sont plus sensibles aux quinolones par rapport aux souches sauvages.Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=114753 Persistance bactérienne à l’ofloxacine : le polyphosphate [TFE / Mémoire] / Sarah Maque ; François Beaufay, Promoteur du mémoire . - Montignies-sur-Sambre : Haute Ecole Louvain en Hainaut, 2023 . - 60p.
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Langues : Français (fre)
Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La découverte accidentelle des antibiotiques fut une révolution majeure dans le traitement des infections. Malheureusement, leur mauvaise utilisation a engendré une pression de sélection qui a permet aux bactéries résistantes et persistantes de se propager.
À l’heure actuelle, la résistance et la persistance bactérienne sont un réel problème de santé publique. Voilà pourquoi certaines études voient le jour afin de développer des solutions pour faire face à ces phénomènes. C’est dans ce projet que l’étude du polyphosphate est né. Le polyphosphate est un polymère linéaire de phosphate inorganique. Présent chez les procaryotes, les eucaryotes et les archées, il est associé à de nombreuses fonctions tel que des mécanismes de résistance au stress. Chez les bactéries, les antibiotiques sont considérés comme un stress. L’objectif de ce stage et de ce travail de fin d’études est de comprendre le rôle du polyphosphate dans les mécanismes de résistance et de persistance bactérienne, et plus précisément dans la persistance à l’ofloxacine. L’ofloxacine est un antibiotique faisant partie de la famille des quinolones. Les quinolones sont des molécules synthétiques dont le mécanisme d’action est d’inhiber la synthèse de l’ADN bactérien. Les anciens résultats obtenus par François Beaufay démontrent que les souches dépourvues de polyphosphate sont plus sensibles aux quinolones par rapport aux souches sauvages.Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=114753 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Rôle du polyphosphate dans la biogenèse du ribosome / Clotilde Brisbois
Titre : Rôle du polyphosphate dans la biogenèse du ribosome Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Clotilde Brisbois ; François Beaufay, Promoteur du mémoire Editeur : Montignies-sur-Sambre : Haute Ecole Louvain en Hainaut Année de publication : 2023 Importance : 57p. Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur . Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Dans la première moitié du 20ème siècle, la découverte et le développement des antibiotiques ont amélioré l’espérance de vie. Malheureusement, l’utilisation abusive et non contrôlée des antibiotiques ont conduit à l’émergence et la dissémination de mécanismes de résistances chez les bactéries. A l’heure actuelle ces résistances sont un grand problème de santé publique contre lesquels beaucoup de chercheurs essayent de lutter. C’est dans ce contexte que ce travail trouve sa base, en étudiant le polyphosphate. Le polyphosphate est un polymère de phosphate inorganique présent chez tous les
organismes vivants. De multiples fonctions lui sont associées mais surtout dans l’adaptation des bactéries au stress comme les antibiotiques. Le but de ce projet est de comprendre le rôle du polyP dans la biogénèse du ribosome. Pour ce faire, l’intérêt se porte à la résistance d’Escherichia coli aux aminoglycosides. Cette famille d’antibiotiques agissant sur le ribosome, le lien sera facilement prouvé. Comprendre le lien entre le polyP et le ribosome pourra servir de base pour l’étude de la résistance bactérienne aux antibiotiques.Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=114756 Rôle du polyphosphate dans la biogenèse du ribosome [TFE / Mémoire] / Clotilde Brisbois ; François Beaufay, Promoteur du mémoire . - Montignies-sur-Sambre : Haute Ecole Louvain en Hainaut, 2023 . - 57p.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur .
Langues : Français (fre)
Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Dans la première moitié du 20ème siècle, la découverte et le développement des antibiotiques ont amélioré l’espérance de vie. Malheureusement, l’utilisation abusive et non contrôlée des antibiotiques ont conduit à l’émergence et la dissémination de mécanismes de résistances chez les bactéries. A l’heure actuelle ces résistances sont un grand problème de santé publique contre lesquels beaucoup de chercheurs essayent de lutter. C’est dans ce contexte que ce travail trouve sa base, en étudiant le polyphosphate. Le polyphosphate est un polymère de phosphate inorganique présent chez tous les
organismes vivants. De multiples fonctions lui sont associées mais surtout dans l’adaptation des bactéries au stress comme les antibiotiques. Le but de ce projet est de comprendre le rôle du polyP dans la biogénèse du ribosome. Pour ce faire, l’intérêt se porte à la résistance d’Escherichia coli aux aminoglycosides. Cette famille d’antibiotiques agissant sur le ribosome, le lien sera facilement prouvé. Comprendre le lien entre le polyP et le ribosome pourra servir de base pour l’étude de la résistance bactérienne aux antibiotiques.Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=114756 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire