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Auteur Sarah Willems |
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Étude de la fonction du polyphosphate dans la résistance à la D-cyclosérine / Sarah Willems
Titre : Étude de la fonction du polyphosphate dans la résistance à la D-cyclosérine Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Sarah Willems, Auteur ; François Beaufay, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2020 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le polyphosphate, un biopolymère composé d’une chaîne allant jusqu’à 1000 résidus de phosphates inorganiques, est retrouvé chez tous les organismes étudiés. Il est considéré comme une molécule ancestrale ayant contribué à l’émergence de la vie sur terre. Ce polyanion remplit un nombre surprenant de fonctions cellulaires très diversifiées permettant aux organismes de résister aux conditions de stress les plus extrêmes. Chez les eucaryotes multicellulaires complexes, le polyphosphate a notamment été associé à l’hémostase et l’amylogenèse. Chez les procaryotes, ce polymère est impliqué, entre autres, dans la chélation des métaux, la virulence et le métabolisme énergétique. Deux des fonctions du polyphosphate récemment découvertes ont une importance particulière dans ce travail ; sa capacité à agir en tant que chaperonne et sa fonction dans la régulation de la mobilité des éléments génétiques mobiles.
Connaissant l’importance de cette molécule dans la réponse au stress, il n’est pas étonnant qu’un mutant dépourvu de l’enzyme de synthèse du polyphosphate soit considérablement plus sensible à diverses conditions telles que la chaleur, le manque de ressources nutritives et le stress oxydatif. Lors de travaux précédents, mon maître de stage a pu observer chez une souche mutante d’Escherichia coli incapable de synthétiser le polyphosphate, une sensibilité exacerbée pour la D-cyclosérine (antibiotique ciblant la synthèse du peptidoglycane) en comparaison à une souche de phénotype sauvage.
L’objectif de ce travail consiste à reproduire cet effet et à déterminer ensuite s’il est spécifique à la D-cyclosérine ou général et applicable à d’autres antibiotiques. Il s’agit également de déterminer s’il est associé à une famille d’antibiotique, à une cible, ou à un mécanisme particulier. Pour finir, il consiste à définir précisément le rôle du polyphosphate dans la résistance contre ces antibiotiques.
Pour ce faire, nous avons entrepris une étude de la sensibilité de mutants d’Escherichia coli possédant divers taux intracellulaires de polyphosphate après contact avec des concentrations croissantes de différents antibiotiques testés. Les molécules ont été sélectionnées afin de couvrir un large spectre de mécanismes d’action et de cibles.
Il s’agirait désormais de quantifier précisément le degré de sensibilité d’une souche dépourvue en polyphosphate par une détermination des concentrations minimales inhibitrices et bactéricides. Il faudrait également évaluer si le stress causé par les antibiotiques induit une accumulation de polyphosphate en quantifiant son taux cellulaire. Aussi, il serait intéressant de déterminer si la protection du polyphosphate est liée à sa fonction chaperonne par analyse de l’expression génique par RT-qPCR et par quantification de l’agrégation protéique. Et finalement une analyse globale de la fonction des gènes par tn-seq sera entreprise.Note de contenu : Table des matières
Remerciements ............................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 9
Introduction générale...................................................................................................................
Contexte général ...................................................................................................................... 13
Le polyphosphate ................................................................................................................. 13
Le polyphosphate, une molécule universellement conservée ......................................... 13
La biosynthèse du polyphosphate .................................................................................... 14
Le polyphosphate, un polymère multifonctionnel ........................................................... 15
Le polyphosphate est une chaperonne majeure .............................................................. 20
Un nouveau rôle pour le polyphosphate .......................................................................... 22
Les antibiotiques ................................................................................................................... 24
Mécanismes d’action des antibiotiques ........................................................................... 25
Les antibiotiques agissant sur la synthèse du peptidoglycane ..................................... 26
Le peptidoglycane ...................................................................................................... 26
Structure du peptidoglycane ................................................................................. 26
Synthèse du peptidoglycane .................................................................................. 27
L’ampicilline et la céphalexine ................................................................................... 28
La fosfomycine ........................................................................................................... 29
Les antibiotiques agissant sur la synthèse et/ou le fonctionnement de l’ADN ............ 29
L’ofloxacine ................................................................................................................ 29
La rifampicine ............................................................................................................ 29
Les antibiotiques inhibant la synthèse protéique ......................................................... 29
La streptomycine, la kanamycine et la gentamicine ................................................. 29
L‘érythromycine ......................................................................................................... 29
Le chloramphénicol ................................................................................................... 30
La tétracycline ............................................................................................................ 30
La D-cyclosérine ............................................................................................................. 30
Mécanismes d’action et de résistance à la D-cyclosérine ......................................... 30
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 32
Matériel et méthodes .............................................................................................................. 34
Tests de survie ...................................................................................................................... 34
Matériel biologique ........................................................................................................... 34
Solutions d’antibiotiques .................................................................................................. 34
Milieux de culture ............................................................................................................. 35
Méthode des tests de survie ............................................................................................. 35
Construction génétique du plasmide pKOV exprimant le gène ppk et transformation de souches Δppk ........................................................................................................................ 36
Le plasmide pKOV ............................................................................................................. 36
Préparation rapide d’ADN plasmidique (miniprep) .......................................................... 37
Polymerase chain reaction (PCR) ...................................................................................... 37
Électrophorèse sur gel d’agarose...................................................................................... 38
Digestion d’ADN par enzyme de restriction ..................................................................... 38
Déphosphorylation de pKOV ............................................................................................ 39
Ligation de pKOV et du produit PCR ppk .......................................................................... 39
Préparation des bactéries compétentes ........................................................................... 39
Transformation des bactéries compétentes et sélection des transformants .................. 39
Résultats et discussion ............................................................................................................. 40
L’absence de polyphosphate augmente la sensibilité à la D-cyclosérine ............................ 40
Le polyphosphate n’intervient pas dans la synthèse du peptidoglycane ............................ 42
Le manque de polyphosphate ne diminue pas la perméabilité d’Escherichia coli .............. 45
Le polyphosphate semble impliqué dans la synthèse des protéines ................................... 47
Discussion ............................................................................................................................. 56
Perspectives.............................................................................................................................. 59
Détermination des CMI et CMB en milieu liquide ................................................................ 59
Quantification de la concentration intra-bactérienne en polyphosphate ........................... 60
Analyse de l’expression génique par RT-qPCR ..................................................................... 60
Extraits protéiques ................................................................................................................ 61
Séquençage d’insertion de transposon ................................................................................ 61
Conclusion générale .....................................................................................................................
Liste des figures ........................................................................................................................ 65
Liste des abréviations ............................................................................................................... 67
Bibliographie ................................................................................................................................
Annexes ........................................................................................................................................Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89148 Étude de la fonction du polyphosphate dans la résistance à la D-cyclosérine [TFE / Mémoire] / Sarah Willems, Auteur ; François Beaufay, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2020.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le polyphosphate, un biopolymère composé d’une chaîne allant jusqu’à 1000 résidus de phosphates inorganiques, est retrouvé chez tous les organismes étudiés. Il est considéré comme une molécule ancestrale ayant contribué à l’émergence de la vie sur terre. Ce polyanion remplit un nombre surprenant de fonctions cellulaires très diversifiées permettant aux organismes de résister aux conditions de stress les plus extrêmes. Chez les eucaryotes multicellulaires complexes, le polyphosphate a notamment été associé à l’hémostase et l’amylogenèse. Chez les procaryotes, ce polymère est impliqué, entre autres, dans la chélation des métaux, la virulence et le métabolisme énergétique. Deux des fonctions du polyphosphate récemment découvertes ont une importance particulière dans ce travail ; sa capacité à agir en tant que chaperonne et sa fonction dans la régulation de la mobilité des éléments génétiques mobiles.
Connaissant l’importance de cette molécule dans la réponse au stress, il n’est pas étonnant qu’un mutant dépourvu de l’enzyme de synthèse du polyphosphate soit considérablement plus sensible à diverses conditions telles que la chaleur, le manque de ressources nutritives et le stress oxydatif. Lors de travaux précédents, mon maître de stage a pu observer chez une souche mutante d’Escherichia coli incapable de synthétiser le polyphosphate, une sensibilité exacerbée pour la D-cyclosérine (antibiotique ciblant la synthèse du peptidoglycane) en comparaison à une souche de phénotype sauvage.
L’objectif de ce travail consiste à reproduire cet effet et à déterminer ensuite s’il est spécifique à la D-cyclosérine ou général et applicable à d’autres antibiotiques. Il s’agit également de déterminer s’il est associé à une famille d’antibiotique, à une cible, ou à un mécanisme particulier. Pour finir, il consiste à définir précisément le rôle du polyphosphate dans la résistance contre ces antibiotiques.
Pour ce faire, nous avons entrepris une étude de la sensibilité de mutants d’Escherichia coli possédant divers taux intracellulaires de polyphosphate après contact avec des concentrations croissantes de différents antibiotiques testés. Les molécules ont été sélectionnées afin de couvrir un large spectre de mécanismes d’action et de cibles.
Il s’agirait désormais de quantifier précisément le degré de sensibilité d’une souche dépourvue en polyphosphate par une détermination des concentrations minimales inhibitrices et bactéricides. Il faudrait également évaluer si le stress causé par les antibiotiques induit une accumulation de polyphosphate en quantifiant son taux cellulaire. Aussi, il serait intéressant de déterminer si la protection du polyphosphate est liée à sa fonction chaperonne par analyse de l’expression génique par RT-qPCR et par quantification de l’agrégation protéique. Et finalement une analyse globale de la fonction des gènes par tn-seq sera entreprise.Note de contenu : Table des matières
Remerciements ............................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 9
Introduction générale...................................................................................................................
Contexte général ...................................................................................................................... 13
Le polyphosphate ................................................................................................................. 13
Le polyphosphate, une molécule universellement conservée ......................................... 13
La biosynthèse du polyphosphate .................................................................................... 14
Le polyphosphate, un polymère multifonctionnel ........................................................... 15
Le polyphosphate est une chaperonne majeure .............................................................. 20
Un nouveau rôle pour le polyphosphate .......................................................................... 22
Les antibiotiques ................................................................................................................... 24
Mécanismes d’action des antibiotiques ........................................................................... 25
Les antibiotiques agissant sur la synthèse du peptidoglycane ..................................... 26
Le peptidoglycane ...................................................................................................... 26
Structure du peptidoglycane ................................................................................. 26
Synthèse du peptidoglycane .................................................................................. 27
L’ampicilline et la céphalexine ................................................................................... 28
La fosfomycine ........................................................................................................... 29
Les antibiotiques agissant sur la synthèse et/ou le fonctionnement de l’ADN ............ 29
L’ofloxacine ................................................................................................................ 29
La rifampicine ............................................................................................................ 29
Les antibiotiques inhibant la synthèse protéique ......................................................... 29
La streptomycine, la kanamycine et la gentamicine ................................................. 29
L‘érythromycine ......................................................................................................... 29
Le chloramphénicol ................................................................................................... 30
La tétracycline ............................................................................................................ 30
La D-cyclosérine ............................................................................................................. 30
Mécanismes d’action et de résistance à la D-cyclosérine ......................................... 30
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 32
Matériel et méthodes .............................................................................................................. 34
Tests de survie ...................................................................................................................... 34
Matériel biologique ........................................................................................................... 34
Solutions d’antibiotiques .................................................................................................. 34
Milieux de culture ............................................................................................................. 35
Méthode des tests de survie ............................................................................................. 35
Construction génétique du plasmide pKOV exprimant le gène ppk et transformation de souches Δppk ........................................................................................................................ 36
Le plasmide pKOV ............................................................................................................. 36
Préparation rapide d’ADN plasmidique (miniprep) .......................................................... 37
Polymerase chain reaction (PCR) ...................................................................................... 37
Électrophorèse sur gel d’agarose...................................................................................... 38
Digestion d’ADN par enzyme de restriction ..................................................................... 38
Déphosphorylation de pKOV ............................................................................................ 39
Ligation de pKOV et du produit PCR ppk .......................................................................... 39
Préparation des bactéries compétentes ........................................................................... 39
Transformation des bactéries compétentes et sélection des transformants .................. 39
Résultats et discussion ............................................................................................................. 40
L’absence de polyphosphate augmente la sensibilité à la D-cyclosérine ............................ 40
Le polyphosphate n’intervient pas dans la synthèse du peptidoglycane ............................ 42
Le manque de polyphosphate ne diminue pas la perméabilité d’Escherichia coli .............. 45
Le polyphosphate semble impliqué dans la synthèse des protéines ................................... 47
Discussion ............................................................................................................................. 56
Perspectives.............................................................................................................................. 59
Détermination des CMI et CMB en milieu liquide ................................................................ 59
Quantification de la concentration intra-bactérienne en polyphosphate ........................... 60
Analyse de l’expression génique par RT-qPCR ..................................................................... 60
Extraits protéiques ................................................................................................................ 61
Séquençage d’insertion de transposon ................................................................................ 61
Conclusion générale .....................................................................................................................
Liste des figures ........................................................................................................................ 65
Liste des abréviations ............................................................................................................... 67
Bibliographie ................................................................................................................................
Annexes ........................................................................................................................................Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89148 Exemplaires
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