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Etude des mécanismes moléculaires contrôlant la réponse chimiotactique de la bactérie Caulobacter crescentus face au cuivre / Vincent Paquet
Titre : Etude des mécanismes moléculaires contrôlant la réponse chimiotactique de la bactérie Caulobacter crescentus face au cuivre Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Vincent Paquet, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Notre environnement est constamment soumis à des variations de température, de concentration en CO2 dans l’air, ou encore à la présence de produits toxiques dans les mers ou les océans. L’augmentation de la concentration en cuivre (Cu) dans les eaux provoquant des stress oxydatifs pour les bactéries qui y sont exposées en est un exemple. Pour éviter des troubles métaboliques, les bactéries développent divers mécanismes de réponses adaptatifs. Caulobacter crescentus est un exemple de ces bactéries qui possède un mécanisme spécifique mis en oeuvre pour résister à ces variations extérieures. En effet, cet organisme aquatique possède un cycle cellulaire assez particulier. Son cycle cellulaire donne naissance à deux
cellules filles totalement différentes que ce soit morphologiquement ou fonctionnellement. Ces deux cellules sont appelées stalked et swarmer. Ces deux cellules réagissent différemment dans un milieu ou la concentration en Cu est stressante. D’un côté, la cellule stalked possède
un système appelé PcoAB qui lui permet de réguler sa concentration intracellulaire en Cu et de l’autre côté, la cellule swarmer peut à l’aide de son flagelle s’éloigner de cet environnement présentant le stress dû au Cu. Ce mécanisme est d’ailleurs appelé le chimiotactisme.
En ce moment, une étude visant à caractériser le chimiotactisme de C. crescentus est menée dans le laboratoire de l’URBM. Ce travail de fin d’étude s’inscrit dans le cadre de cette recherche. L’objectif premier de ce travail est de mettre au point deux protocoles simples et
rapides qui permettent une mise en évidence directe d’un mouvement dû à ce chimiotactisme. Ces deux expériences se basent sur des principes différents, l’une se base sur des gouttières de nage et l’autre se base sur une plaque 96 puits. Ces deux expérimentations
seront adaptées depuis un protocole standard existant afin de trouver les conditions optimales pour visualiser significativement un mouvement chimiotactique.
L’autre axe de ce travail vise à caractériser une protéine reconnue comme un acteur potentiellement important dans ce processus chimiotactique. Pour ce faire, un protocole de surexpression optimale de cette protéine sera mis au point sur base d’un procédé existant et utilisé pour la surexpression d’autres protéines. Pour caractériser cette protéine après surexpression, elle sera purifiée et cristallisée pour en étudier sa structure tridimensionnelle.Note de contenu : Présentation du lieu de stage ................................................................................................ 9
Introduction générale ............................................................................................................11
1. Contexte théorique ........................................................................................................13
1.1 Caulobacter crescentus ..........................................................................................13
1.2 Chimiotactisme .......................................................................................................15
1.3 Methyl-accepting Chemotaxis Protein (MCP) .........................................................17
2. Contexte de la recherche et objectifs .............................................................................19
3. Matériel et méthode .......................................................................................................21
3.1 Test gouttière : Protocole standard .........................................................................21
3.1.1 1ere mise au point.............................................................................................22
3.1.2 2e mise au point...............................................................................................22
3.1.3 3e mise au point...............................................................................................23
3.2 Test de chimiotactisme en plaque 96 puits : protocole standard .............................24
3.2.1 1ere mise au point.............................................................................................25
3.2.2 2e mise au point...............................................................................................26
3.2.3 3e mise au point...............................................................................................27
3.3 Production de souche BL21-pET28a-mcpP ............................................................28
3.3.1 Construction souche BL21-pET28a-mcpP .......................................................28
3.4 Surexpression de BL21-pET28A-mcpP ..................................................................32
3.4.1 Cultures LB-Kan en petit volume de BL21-pET28a-mcpP ...............................32
3.4.2 Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction à l’IPTG en petit volume ...........33
4. Résultats et discussion ..................................................................................................35
4.1 Gouttières ..............................................................................................................35
4.1.1 1ere mise au point .............................................................................................35
4.1.2 2e mise au point...............................................................................................36
4.1.3 3e mise au point...............................................................................................38
4.2 Test de chimiotactisme en Plaque 96 puits ............................................................40
4.2.1 1ere mise au point.............................................................................................40
4.2.2 2e mise au point...............................................................................................41
4.2.3 3e mise au point...............................................................................................42
4.3 Surexpression de McpP .........................................................................................43
4.3.1 Construction de la souche BL21-pET28a-mcpP ..............................................43
4.3.2 Vérification de la surexpression de BL21-pET28a-mcpP .................................45
Conclusion ...........................................................................................................................47
Bibliographie ........................................................................................................................49
Liste des figures ...................................................................................................................50
Liste des tableaux ................................................................................................................50
AnnexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79997 Etude des mécanismes moléculaires contrôlant la réponse chimiotactique de la bactérie Caulobacter crescentus face au cuivre [TFE / Mémoire] / Vincent Paquet, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Notre environnement est constamment soumis à des variations de température, de concentration en CO2 dans l’air, ou encore à la présence de produits toxiques dans les mers ou les océans. L’augmentation de la concentration en cuivre (Cu) dans les eaux provoquant des stress oxydatifs pour les bactéries qui y sont exposées en est un exemple. Pour éviter des troubles métaboliques, les bactéries développent divers mécanismes de réponses adaptatifs. Caulobacter crescentus est un exemple de ces bactéries qui possède un mécanisme spécifique mis en oeuvre pour résister à ces variations extérieures. En effet, cet organisme aquatique possède un cycle cellulaire assez particulier. Son cycle cellulaire donne naissance à deux
cellules filles totalement différentes que ce soit morphologiquement ou fonctionnellement. Ces deux cellules sont appelées stalked et swarmer. Ces deux cellules réagissent différemment dans un milieu ou la concentration en Cu est stressante. D’un côté, la cellule stalked possède
un système appelé PcoAB qui lui permet de réguler sa concentration intracellulaire en Cu et de l’autre côté, la cellule swarmer peut à l’aide de son flagelle s’éloigner de cet environnement présentant le stress dû au Cu. Ce mécanisme est d’ailleurs appelé le chimiotactisme.
En ce moment, une étude visant à caractériser le chimiotactisme de C. crescentus est menée dans le laboratoire de l’URBM. Ce travail de fin d’étude s’inscrit dans le cadre de cette recherche. L’objectif premier de ce travail est de mettre au point deux protocoles simples et
rapides qui permettent une mise en évidence directe d’un mouvement dû à ce chimiotactisme. Ces deux expériences se basent sur des principes différents, l’une se base sur des gouttières de nage et l’autre se base sur une plaque 96 puits. Ces deux expérimentations
seront adaptées depuis un protocole standard existant afin de trouver les conditions optimales pour visualiser significativement un mouvement chimiotactique.
L’autre axe de ce travail vise à caractériser une protéine reconnue comme un acteur potentiellement important dans ce processus chimiotactique. Pour ce faire, un protocole de surexpression optimale de cette protéine sera mis au point sur base d’un procédé existant et utilisé pour la surexpression d’autres protéines. Pour caractériser cette protéine après surexpression, elle sera purifiée et cristallisée pour en étudier sa structure tridimensionnelle.Note de contenu : Présentation du lieu de stage ................................................................................................ 9
Introduction générale ............................................................................................................11
1. Contexte théorique ........................................................................................................13
1.1 Caulobacter crescentus ..........................................................................................13
1.2 Chimiotactisme .......................................................................................................15
1.3 Methyl-accepting Chemotaxis Protein (MCP) .........................................................17
2. Contexte de la recherche et objectifs .............................................................................19
3. Matériel et méthode .......................................................................................................21
3.1 Test gouttière : Protocole standard .........................................................................21
3.1.1 1ere mise au point.............................................................................................22
3.1.2 2e mise au point...............................................................................................22
3.1.3 3e mise au point...............................................................................................23
3.2 Test de chimiotactisme en plaque 96 puits : protocole standard .............................24
3.2.1 1ere mise au point.............................................................................................25
3.2.2 2e mise au point...............................................................................................26
3.2.3 3e mise au point...............................................................................................27
3.3 Production de souche BL21-pET28a-mcpP ............................................................28
3.3.1 Construction souche BL21-pET28a-mcpP .......................................................28
3.4 Surexpression de BL21-pET28A-mcpP ..................................................................32
3.4.1 Cultures LB-Kan en petit volume de BL21-pET28a-mcpP ...............................32
3.4.2 Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction à l’IPTG en petit volume ...........33
4. Résultats et discussion ..................................................................................................35
4.1 Gouttières ..............................................................................................................35
4.1.1 1ere mise au point .............................................................................................35
4.1.2 2e mise au point...............................................................................................36
4.1.3 3e mise au point...............................................................................................38
4.2 Test de chimiotactisme en Plaque 96 puits ............................................................40
4.2.1 1ere mise au point.............................................................................................40
4.2.2 2e mise au point...............................................................................................41
4.2.3 3e mise au point...............................................................................................42
4.3 Surexpression de McpP .........................................................................................43
4.3.1 Construction de la souche BL21-pET28a-mcpP ..............................................43
4.3.2 Vérification de la surexpression de BL21-pET28a-mcpP .................................45
Conclusion ...........................................................................................................................47
Bibliographie ........................................................................................................................49
Liste des figures ...................................................................................................................50
Liste des tableaux ................................................................................................................50
AnnexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79997 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etude des mécanismes de résistance de Caulobacter crescentus au cuivre / Esma ALPAN
Titre : Etude des mécanismes de résistance de Caulobacter crescentus au cuivre Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Esma ALPAN, Auteur ; Jean-Yves MATROULE, Directeur de la recherche ; Johan Wouters, Directeur de la recherche Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Université de Namur département de biologie. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
REMERCIEMENTS
PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE
INTRODUCTION ............................................................................................................................... 13
1. CONTEXTE THÉORIQUE ........................................................................................................... 15
1.1. CAULOBACTER CRESCENTUS ....................................................................................................... 15
1.1.1. Généralités ..................................................................................................................... 15
1.1.2. Cycle de vie ..................................................................................................................... 15
1.2. LE CUIVRE, UN ÉLÉMENT ESSENTIEL .............................................................................................. 16
1.2.1. Distribution du Cu ........................................................................................................... 16
1.2.2. Toxicité du Cu à haute concentration ............................................................................. 18
1.2.3. Utilisation antérieure ..................................................................................................... 18
1.3. MÉCANISMES DE RÉSISTANCE FACE AU CU CHEZ LES BACTÉRIES ......................................................... 19
1.3.1. Pénétration ..................................................................................................................... 19
1.3.2. Prise en charge – Résistance .......................................................................................... 19
1.3.2.1. Système « Cue » ................................................................................................................. 20
1.3.2.2. Système « Cus » ................................................................................................................. 21
1.3.2.3. Système « Pco » ................................................................................................................. 22
1.3.2.4. Système « Cut » .................................................................................................................. 24
1.3.3. Séquestration du Cu ....................................................................................................... 24
1.3.4. Limitation de l’utilisation du Cu...................................................................................... 24
1.4. PATHOLOGIES LIÉES AU CU CHEZ L’HOMME ................................................................................... 25
1.5. RÉPONSE DE C. CRESCENTUS AU CU ............................................................................................. 25
2. OBJECTIFS ET STRATÉGIES ...................................................................................................... 27
3. MATÉRIEL ET MÉTHODES ........................................................................................................ 29
3.1. PRODUCTION ET PURIFICATION DE PCOA ET PCOB .......................................................................... 29
3.1.1. Expression dans la souche BL21 d’E. coli ........................................................................ 29
3.1.2. Plasmide vecteur pET24b ............................................................................................... 29
3.1.2.1. Région Multiple Cloning Site (MCS) .................................................................................... 30
3.1.2.2. Opérateur lac ..................................................................................................................... 30
3.1.2.3. His-tag de PcoA et PcoB ..................................................................................................... 30
3.1.2.4. Sélection à la kanamycine .................................................................................................. 30
3.1.3. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 30
3.1.3.1. Extraction du plasmide pET24b-PcoB « Miniprep » ........................................................... 31
3.1.3.2. Electroporation à partir des souches BL21 et DH10B-pET24b-PcoB .................................. 31
3.1.3.3. PCR des colonies BL21-pET24b-PcoB.................................................................................. 32
3.1.3.4. Migration des résultats de la PCR sur gel d’agarose .......................................................... 33
3.1.4. Surexpression de BL21-pET24b-PcoA et BL21-pET24b-PcoB .......................................... 33
3.1.4.1. Composition du milieu LB................................................................................................... 33
3.1.4.2. Courbe de croissance : mesure D.O. .................................................................................. 33
3.1.4.3. Cultures LB-Kan à petit volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB .................. 34
3.1.4.4. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à petit volume ..... 34
3.1.4.5. Cultures LB-Kan à grand volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB ................ 36
3.1.4.6. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à grand volume ... 36
3.1.5. Purification de PcoA ou PcoB ......................................................................................... 37
3.1.5.1. Première étape de la purification – Traitement à la guanidine 6 M ................................... 37
3.1.5.2. Deuxième étape de la purification – Chromatographie d’affinité ...................................... 38
3.1.5.3. Vérification de la purification de PcoA ou PcoB sur gel SDS-PAGE ..................................... 39
3.1.6. Dialyse de PcoA ou PcoB ................................................................................................ 39
3.1.7. Concentration de PcoA ou PcoB ..................................................................................... 40
3.2. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 42
3.2.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 42
3.2.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse de PcoA ......................................... 42
3.3. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA OU PCOB ........................................................................................ 43
3.3.1. Principe ........................................................................................................................... 43
3.3.2. Méthode ......................................................................................................................... 44
3.3.2.1. Préparation des plaques pour la cristallogenèse ............................................................... 45
3.3.2.2. Observation des plaques au microscope ............................................................................ 45
3.4. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 46
3.4.1. Caractéristiques de la souche sauvage de C. crescentus ................................................ 46
3.4.2. Caractéristiques de la souche E. coli Tn5 ........................................................................ 46
3.4.3. Particularité de la souche C. crescentus ΔAB ................................................................. 46
3.4.4. Composition du milieu PYE (HIGG) ................................................................................. 46
3.4.5. Création des mutants de C. crescentus .......................................................................... 47
3.4.6. Isolement de mutants de C. crescentus sensibles au Cu ................................................. 48
3.4.7. Analyse de la croissance cellulaire en présence de Cu ................................................... 48
3.4.7.1. Croissance de la souche CB15N en présence de Cu ........................................................... 48
3.4.7.2. Croissance de mutants sensibles au Cu en présence de Cu ............................................... 49
4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS ................................................................................................... 51
4.1. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOB .............................................................. 51
4.1.1. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 51
4.1.2. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoB .................................................. 53
4.1.3. Vérification de la purification de PcoB ........................................................................... 54
4.1.4. Dialyse des fractions pures de PcoB ............................................................................... 55
4.1.5. Concentration de PcoB ................................................................................................... 56
4.2. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOA .............................................................. 57
4.2.1. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoA ................................................. 57
4.2.2. Vérification de la purification de PcoA ........................................................................... 58
4.2.3. Dialyse des fractions pures de PcoA ............................................................................... 59
4.2.4. Concentration de PcoA ................................................................................................... 59
4.2.4.1. Première culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (2X 200 ml) ............................................. 59
4.2.4.2. Deuxième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.3. Traitement des précipités issus des cultures précédentes ................................................. 60
4.2.4.4. Troisième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.5. Discussion ........................................................................................................................... 61
4.3. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 62
4.3.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 62
4.3.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse ....................................................... 62
4.3.2.1. Résultats du dosage de la concentration de PcoA ............................................................. 62
4.4. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA ..................................................................................................... 63
4.4.1. Cristal dans la plaque PcoA n°A...................................................................................... 63
4.5. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 64
4.5.1. Nombre de mutants isolés « sensibles » au Cu .............................................................. 64
4.5.2. Analyse de la croissance de la souche CB15N en présence de concentrations croissantes en Cu....... ...................................................................................................................................... 64
4.5.3. Analyse de la croissance des mutants sensibles au Cu en présence de 100 ou 150 μM de Cu………..Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65824 Etude des mécanismes de résistance de Caulobacter crescentus au cuivre [TFE / Mémoire] / Esma ALPAN, Auteur ; Jean-Yves MATROULE, Directeur de la recherche ; Johan Wouters, Directeur de la recherche . - 2017.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Université de Namur département de biologie. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
REMERCIEMENTS
PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE
INTRODUCTION ............................................................................................................................... 13
1. CONTEXTE THÉORIQUE ........................................................................................................... 15
1.1. CAULOBACTER CRESCENTUS ....................................................................................................... 15
1.1.1. Généralités ..................................................................................................................... 15
1.1.2. Cycle de vie ..................................................................................................................... 15
1.2. LE CUIVRE, UN ÉLÉMENT ESSENTIEL .............................................................................................. 16
1.2.1. Distribution du Cu ........................................................................................................... 16
1.2.2. Toxicité du Cu à haute concentration ............................................................................. 18
1.2.3. Utilisation antérieure ..................................................................................................... 18
1.3. MÉCANISMES DE RÉSISTANCE FACE AU CU CHEZ LES BACTÉRIES ......................................................... 19
1.3.1. Pénétration ..................................................................................................................... 19
1.3.2. Prise en charge – Résistance .......................................................................................... 19
1.3.2.1. Système « Cue » ................................................................................................................. 20
1.3.2.2. Système « Cus » ................................................................................................................. 21
1.3.2.3. Système « Pco » ................................................................................................................. 22
1.3.2.4. Système « Cut » .................................................................................................................. 24
1.3.3. Séquestration du Cu ....................................................................................................... 24
1.3.4. Limitation de l’utilisation du Cu...................................................................................... 24
1.4. PATHOLOGIES LIÉES AU CU CHEZ L’HOMME ................................................................................... 25
1.5. RÉPONSE DE C. CRESCENTUS AU CU ............................................................................................. 25
2. OBJECTIFS ET STRATÉGIES ...................................................................................................... 27
3. MATÉRIEL ET MÉTHODES ........................................................................................................ 29
3.1. PRODUCTION ET PURIFICATION DE PCOA ET PCOB .......................................................................... 29
3.1.1. Expression dans la souche BL21 d’E. coli ........................................................................ 29
3.1.2. Plasmide vecteur pET24b ............................................................................................... 29
3.1.2.1. Région Multiple Cloning Site (MCS) .................................................................................... 30
3.1.2.2. Opérateur lac ..................................................................................................................... 30
3.1.2.3. His-tag de PcoA et PcoB ..................................................................................................... 30
3.1.2.4. Sélection à la kanamycine .................................................................................................. 30
3.1.3. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 30
3.1.3.1. Extraction du plasmide pET24b-PcoB « Miniprep » ........................................................... 31
3.1.3.2. Electroporation à partir des souches BL21 et DH10B-pET24b-PcoB .................................. 31
3.1.3.3. PCR des colonies BL21-pET24b-PcoB.................................................................................. 32
3.1.3.4. Migration des résultats de la PCR sur gel d’agarose .......................................................... 33
3.1.4. Surexpression de BL21-pET24b-PcoA et BL21-pET24b-PcoB .......................................... 33
3.1.4.1. Composition du milieu LB................................................................................................... 33
3.1.4.2. Courbe de croissance : mesure D.O. .................................................................................. 33
3.1.4.3. Cultures LB-Kan à petit volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB .................. 34
3.1.4.4. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à petit volume ..... 34
3.1.4.5. Cultures LB-Kan à grand volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB ................ 36
3.1.4.6. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à grand volume ... 36
3.1.5. Purification de PcoA ou PcoB ......................................................................................... 37
3.1.5.1. Première étape de la purification – Traitement à la guanidine 6 M ................................... 37
3.1.5.2. Deuxième étape de la purification – Chromatographie d’affinité ...................................... 38
3.1.5.3. Vérification de la purification de PcoA ou PcoB sur gel SDS-PAGE ..................................... 39
3.1.6. Dialyse de PcoA ou PcoB ................................................................................................ 39
3.1.7. Concentration de PcoA ou PcoB ..................................................................................... 40
3.2. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 42
3.2.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 42
3.2.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse de PcoA ......................................... 42
3.3. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA OU PCOB ........................................................................................ 43
3.3.1. Principe ........................................................................................................................... 43
3.3.2. Méthode ......................................................................................................................... 44
3.3.2.1. Préparation des plaques pour la cristallogenèse ............................................................... 45
3.3.2.2. Observation des plaques au microscope ............................................................................ 45
3.4. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 46
3.4.1. Caractéristiques de la souche sauvage de C. crescentus ................................................ 46
3.4.2. Caractéristiques de la souche E. coli Tn5 ........................................................................ 46
3.4.3. Particularité de la souche C. crescentus ΔAB ................................................................. 46
3.4.4. Composition du milieu PYE (HIGG) ................................................................................. 46
3.4.5. Création des mutants de C. crescentus .......................................................................... 47
3.4.6. Isolement de mutants de C. crescentus sensibles au Cu ................................................. 48
3.4.7. Analyse de la croissance cellulaire en présence de Cu ................................................... 48
3.4.7.1. Croissance de la souche CB15N en présence de Cu ........................................................... 48
3.4.7.2. Croissance de mutants sensibles au Cu en présence de Cu ............................................... 49
4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS ................................................................................................... 51
4.1. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOB .............................................................. 51
4.1.1. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 51
4.1.2. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoB .................................................. 53
4.1.3. Vérification de la purification de PcoB ........................................................................... 54
4.1.4. Dialyse des fractions pures de PcoB ............................................................................... 55
4.1.5. Concentration de PcoB ................................................................................................... 56
4.2. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOA .............................................................. 57
4.2.1. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoA ................................................. 57
4.2.2. Vérification de la purification de PcoA ........................................................................... 58
4.2.3. Dialyse des fractions pures de PcoA ............................................................................... 59
4.2.4. Concentration de PcoA ................................................................................................... 59
4.2.4.1. Première culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (2X 200 ml) ............................................. 59
4.2.4.2. Deuxième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.3. Traitement des précipités issus des cultures précédentes ................................................. 60
4.2.4.4. Troisième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.5. Discussion ........................................................................................................................... 61
4.3. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 62
4.3.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 62
4.3.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse ....................................................... 62
4.3.2.1. Résultats du dosage de la concentration de PcoA ............................................................. 62
4.4. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA ..................................................................................................... 63
4.4.1. Cristal dans la plaque PcoA n°A...................................................................................... 63
4.5. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 64
4.5.1. Nombre de mutants isolés « sensibles » au Cu .............................................................. 64
4.5.2. Analyse de la croissance de la souche CB15N en présence de concentrations croissantes en Cu....... ...................................................................................................................................... 64
4.5.3. Analyse de la croissance des mutants sensibles au Cu en présence de 100 ou 150 μM de Cu………..Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65824 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etude du métabolismeoxydatif du neutrophile par la cytométrie en flux / COQUETTE Marie
Titre : Etude du métabolismeoxydatif du neutrophile par la cytométrie en flux Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : COQUETTE Marie, Année de publication : 2009 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Mots-clés : NEUTROPHILE METABOLISME OXYDATIF CYTOMETRIE EN FLUX SEPTICEMIE GRANULOMATOSE SEPTIQUE CHRONIQUE TEST NBT CD64 Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64549 Etude du métabolismeoxydatif du neutrophile par la cytométrie en flux [TFE / Mémoire] / COQUETTE Marie, . - 2009.
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Mots-clés : NEUTROPHILE METABOLISME OXYDATIF CYTOMETRIE EN FLUX SEPTICEMIE GRANULOMATOSE SEPTIQUE CHRONIQUE TEST NBT CD64 Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64549 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etude du mode d’action de l’harmine et de ses dérivés en tant qu’agents intercalants de l’ADN / Nicolas JUSTE
Titre : Etude du mode d’action de l’harmine et de ses dérivés en tant qu’agents intercalants de l’ADN Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Nicolas JUSTE, Auteur Année de publication : 2014 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : BIOLOGIE MÉDICALE UNIVERSITE DE NAMUR HARMINE DERIVES AGENTS INTERCALANTS ADN SOLUBILITE ABSORBANCE FILTRATION CONCENTRATION MAXIMALE SOLUBLE PURETE TM Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65394 Etude du mode d’action de l’harmine et de ses dérivés en tant qu’agents intercalants de l’ADN [TFE / Mémoire] / Nicolas JUSTE, Auteur . - 2014.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : BIOLOGIE MÉDICALE UNIVERSITE DE NAMUR HARMINE DERIVES AGENTS INTERCALANTS ADN SOLUBILITE ABSORBANCE FILTRATION CONCENTRATION MAXIMALE SOLUBLE PURETE TM Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65394 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etude des modes de conservations de frottis sanguins pour la biobanque / Morgane EMMERECHTS
Titre : Etude des modes de conservations de frottis sanguins pour la biobanque Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Morgane EMMERECHTS, Auteur Année de publication : 2016 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : erythrocytes CHU UCL Namur Mont Godinne leucocytes granulocytes lymphocytes monocytes thrombocytes immunophénotypage sang anticorps cytométrie en flux Mau-Grünwald Giemsa myéloperoxydase double estérase congélation coloration coenzymatique immunomarquage Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu du stage .................................................................................................. 13
Introduction .............................................................................................................................. 15
Partie théorique ....................................................................................................................... 17
1. Les acides nucléiques ....................................................................................................... 17
2. Le gène ............................................................................................................................. 18
3. Du proto-oncogène à l’oncogène ..................................................................................... 20
4. Les mutations ................................................................................................................... 20
5. Le gène Jak2 ..................................................................................................................... 23
6. Syndrome myéloprolifératif ............................................................................................. 23
7. Les cyclines ....................................................................................................................... 25
8. Myélome multiple ............................................................................................................ 26
9. Droplet Digital PCR ........................................................................................................... 27
9. a. Point de départ en pré-PCR : .................................................................................... 28
9. b. Étape 1 : création des gouttelettes grâce au générateur de gouttelettes : ............. 29
9. c. Étape 2 : amplification par PCR : .............................................................................. 30
9. d. Étape 3 : lecture des gouttelettes grâce au lecteur automatique : ......................... 32
9. e. Étape 4 : analyse des résultats par le logiciel QuantaSoft : ..................................... 33
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 37
Partie pratique.......................................................................................................................... 37
1. Dossier de validation ........................................................................................................ 37
2. Dossier de validation pour la recherche de la mutation V617F sur le gène Jak2 par ddPCR ................................................................................................................................... 38
2. a. Manipulation pour les différents paramètres .......................................................... 38
Matériel et méthode .................................................................................................... 38
Mode opératoire ......................................................................................................... 38
10
2. b. Détermination du seuil en ddPCR pour la mutation V617F du gène Jak2 ............... 41
Mise en pratique : Analyse d’une série d’échantillons négatifs et un positif .............. 41
2. c. Répétabilité ............................................................................................................... 43
Mise en pratique : échantillon répété .......................................................................... 43
2. d. Reproductibilité ........................................................................................................ 44
Mise en pratique 1 : jours différents ............................................................................ 44
Mise en pratique 2 : générateur de gouttelettes différents ........................................ 45
2. e. Robustesse ................................................................................................................ 46
Mise en pratique 1 : volumes différents ...................................................................... 46
Mise en pratique 2 : concentrations en ADN différentes ............................................ 48
Mise en pratique 3 : différents volumes avant émulsions ........................................... 49
Mise en pratique 4 : volumes après émulsions différents ........................................... 51
2. f. Sensibilité .................................................................................................................. 52
Mise en pratique : pourcentages différents ................................................................ 52
2. g. Limite de détection ................................................................................................... 53
Mise en pratique : à 0.5% ............................................................................................. 53
2. h. Linéarité .................................................................................................................... 54
Mise en pratique : proportionnalité de concentrations .............................................. 54
2. i. Comparaison de deux méthodes d’analyse : le pyroséquençage et la ddPCR ......... 56
Mode opératoire ......................................................................................................... 57
Mise en pratique 1 : JAK2 de 9.6 à 0.9% ...................................................................... 59
Mise en pratique 2 : vrais ou faux positifs ? ................................................................ 61
3. Dossier de validation pour la recherche de la surexpression en cycline D1 par ddPCR .. 63
3. a. Manipulation pour les différents paramètres .......................................................... 63
Matériel et méthode .................................................................................................... 63
Mode opératoire .......................................................................................................... 63
11
3. b. Linéarité .................................................................................................................... 64
Mise en pratique : dilutions de plasmides en CD1, CD3 et CD1/CD3 .......................... 64
3. c. Spécificité .................................................................................................................. 65
Mise en pratique : dilutions des plasmides en CD1 et CD3 avec des sondes non spécifiques .................................................................................................................... 65
3. d. Établissement d’un seuil de sensibilité .................................................................... 66
Mise en pratique : échantillons négatifs ...................................................................... 66
3. e. Série d’échantillons négatifs et positifs .................................................................... 70
Mise en pratique : comparaison qPCR avec ddPCR ..................................................... 70
3. f. Répétabilité ............................................................................................................... 71
Mise en pratique : positif fort, positif faible, négatif fort et négatif faible ................. 71
3. g. Reproductibilité ........................................................................................................ 72
Mise en pratique : K562 ............................................................................................... 72
Conclusion ................................................................................................................................ 73
Bibliographie ............................................................................................................................ 75
Annexes .................................................................................................................................... 77Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65672 Etude des modes de conservations de frottis sanguins pour la biobanque [TFE / Mémoire] / Morgane EMMERECHTS, Auteur . - 2016.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : erythrocytes CHU UCL Namur Mont Godinne leucocytes granulocytes lymphocytes monocytes thrombocytes immunophénotypage sang anticorps cytométrie en flux Mau-Grünwald Giemsa myéloperoxydase double estérase congélation coloration coenzymatique immunomarquage Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu du stage .................................................................................................. 13
Introduction .............................................................................................................................. 15
Partie théorique ....................................................................................................................... 17
1. Les acides nucléiques ....................................................................................................... 17
2. Le gène ............................................................................................................................. 18
3. Du proto-oncogène à l’oncogène ..................................................................................... 20
4. Les mutations ................................................................................................................... 20
5. Le gène Jak2 ..................................................................................................................... 23
6. Syndrome myéloprolifératif ............................................................................................. 23
7. Les cyclines ....................................................................................................................... 25
8. Myélome multiple ............................................................................................................ 26
9. Droplet Digital PCR ........................................................................................................... 27
9. a. Point de départ en pré-PCR : .................................................................................... 28
9. b. Étape 1 : création des gouttelettes grâce au générateur de gouttelettes : ............. 29
9. c. Étape 2 : amplification par PCR : .............................................................................. 30
9. d. Étape 3 : lecture des gouttelettes grâce au lecteur automatique : ......................... 32
9. e. Étape 4 : analyse des résultats par le logiciel QuantaSoft : ..................................... 33
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 37
Partie pratique.......................................................................................................................... 37
1. Dossier de validation ........................................................................................................ 37
2. Dossier de validation pour la recherche de la mutation V617F sur le gène Jak2 par ddPCR ................................................................................................................................... 38
2. a. Manipulation pour les différents paramètres .......................................................... 38
Matériel et méthode .................................................................................................... 38
Mode opératoire ......................................................................................................... 38
10
2. b. Détermination du seuil en ddPCR pour la mutation V617F du gène Jak2 ............... 41
Mise en pratique : Analyse d’une série d’échantillons négatifs et un positif .............. 41
2. c. Répétabilité ............................................................................................................... 43
Mise en pratique : échantillon répété .......................................................................... 43
2. d. Reproductibilité ........................................................................................................ 44
Mise en pratique 1 : jours différents ............................................................................ 44
Mise en pratique 2 : générateur de gouttelettes différents ........................................ 45
2. e. Robustesse ................................................................................................................ 46
Mise en pratique 1 : volumes différents ...................................................................... 46
Mise en pratique 2 : concentrations en ADN différentes ............................................ 48
Mise en pratique 3 : différents volumes avant émulsions ........................................... 49
Mise en pratique 4 : volumes après émulsions différents ........................................... 51
2. f. Sensibilité .................................................................................................................. 52
Mise en pratique : pourcentages différents ................................................................ 52
2. g. Limite de détection ................................................................................................... 53
Mise en pratique : à 0.5% ............................................................................................. 53
2. h. Linéarité .................................................................................................................... 54
Mise en pratique : proportionnalité de concentrations .............................................. 54
2. i. Comparaison de deux méthodes d’analyse : le pyroséquençage et la ddPCR ......... 56
Mode opératoire ......................................................................................................... 57
Mise en pratique 1 : JAK2 de 9.6 à 0.9% ...................................................................... 59
Mise en pratique 2 : vrais ou faux positifs ? ................................................................ 61
3. Dossier de validation pour la recherche de la surexpression en cycline D1 par ddPCR .. 63
3. a. Manipulation pour les différents paramètres .......................................................... 63
Matériel et méthode .................................................................................................... 63
Mode opératoire .......................................................................................................... 63
11
3. b. Linéarité .................................................................................................................... 64
Mise en pratique : dilutions de plasmides en CD1, CD3 et CD1/CD3 .......................... 64
3. c. Spécificité .................................................................................................................. 65
Mise en pratique : dilutions des plasmides en CD1 et CD3 avec des sondes non spécifiques .................................................................................................................... 65
3. d. Établissement d’un seuil de sensibilité .................................................................... 66
Mise en pratique : échantillons négatifs ...................................................................... 66
3. e. Série d’échantillons négatifs et positifs .................................................................... 70
Mise en pratique : comparaison qPCR avec ddPCR ..................................................... 70
3. f. Répétabilité ............................................................................................................... 71
Mise en pratique : positif fort, positif faible, négatif fort et négatif faible ................. 71
3. g. Reproductibilité ........................................................................................................ 72
Mise en pratique : K562 ............................................................................................... 72
Conclusion ................................................................................................................................ 73
Bibliographie ............................................................................................................................ 75
Annexes .................................................................................................................................... 77Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65672 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etude par hybridation in situ de l’expression du microARN miR-210 dans les cancers du sein triple négatifs / SARA SOLLENNITA
PermalinkEtude du paramètre IPF (fraction plaquettaire immature) sur XN : validation et intérêt clinique dans le diagnostic différentiel des thrombopénies / Sophie TUMSON
PermalinkEtude de la phase pré-analytique des hémocultures / BOUKO Amélie
PermalinkÉtude de la phosphosérine phosphatase de Mycobacterium marinum : Production, purification et détermination de paramètres enzymatiques. / Adrien Lesne
PermalinkEtude de la physiologie des bactéries en conditions spatiales. / WALBRECQ Sébastien
PermalinkEtude préanalytique sur le dosage du zinc et du cuivre par spectrométrie d’absorption atomique / Lucia Lo cicero
PermalinkEtude de la production de GMPc par les cellules endothéliales / CASTROGIOVANNI Cédric
PermalinkEtude de la production de mélanges gazeux corrosifs instables. Vérification de la stabilité par FTIR / CEDRIC ZOUBAN
PermalinkEtude de la protéine ESAG 5 / DURBECQ Maxime
PermalinkEtude protéomique du secrétome des fibroblastes en sénescence réplicative ou induite par les UVB / FLORE LAURENT
PermalinkEtude de la réaction enzyme-inhibiteur au moyen de techniques HPLC ou FIA / Florimont FAMEREE
PermalinkEtude de la réduction potentielle par une cyanobactérie (Arthrospira sp.) des dommages aux cellules endothéliales humaines soumises à des conditions spatiales simulées / CHASPIERRE Guillaume
PermalinkEtude de la régulation transcriptionnelle du BLV : mise au point de nouveaux outils / Dimitri CEGLAR
PermalinkEtude de la régulation transcriptionnelle des gènes Abc transporteurs en réponse à l’invalidation du gène Abcb5 chez les souris / Franck KONCHECHOU
PermalinkEtude de la relation entre stress oxydatif et tabagisme. Evolution chez les fumeurs en cours de sevrage / GUILLAUME HOUSIAUX
PermalinkEtude de la résistance à la Bléomycine induite par la protéine TMEM45A dans les cellules cancéreuses HepG2 / SOPHIE CRÈVECOEUR
PermalinkEtude du rôle de l’ectonucléotidase CD73 dans un modèle inflammatoire intestinal / CHRISTOPHE VANHAVER
PermalinkEtude du rôle du facteur de transcription Dmrt4 dans le développement du cortex cérébral chez la souris / ÉMILIE POSSONI
PermalinkEtude du rôle potentiel de la prolyl-hydroxylase 2 dans l’indiction des lymphocytes T régulateurs / Charlotte FELTEN
PermalinkEtude du rôle de la protéine PicC de Brucella abortus. / SABRINA DELMOITIE
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