Centre de Documentation Campus Montignies
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25 résultat(s) recherche sur le mot-clé 'Culture cellulaire'
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Caractérisation de pools de cellules souches dentaires en vue du développement de nouvelles procédures de régénération de la pulpe dentaire / SOPHIE LIGOT
Titre : Caractérisation de pools de cellules souches dentaires en vue du développement de nouvelles procédures de régénération de la pulpe dentaire Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : SOPHIE LIGOT, Auteur Année de publication : 2016 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Louvain Drug Research Institute LDRI Woluwe-Saint-Lambert dent cellules souches émail dentine pulpe papille carie DPSCs SCAPs culture cellulaire pools FACS RT-PCR chondroblastes neurodifférenciation ostéoblastes Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage....................................................................................................8
Introduction.............................................................................................................................10
Contexte général......................................................................................................................12
1 La dent ............................................................................................................................... 12
1.1 Généralités ................................................................................................................. 12
1.1.1 Structure ............................................................................................................. 12
1.1.2 Développement .................................................................................................. 12
1.1.3 Eruption .............................................................................................................. 13
1.2 L'émail ........................................................................................................................ 15
1.3 La dentine .................................................................................................................. 16
1.4 La pulpe ...................................................................................................................... 17
1.5 La papille .................................................................................................................... 19
2 La carie .............................................................................................................................. 20
2.1 Généralités ................................................................................................................. 20
2.2 Pulpite et nécrose pulpaire ........................................................................................ 23
2.3 Traitement ................................................................................................................. 26
3 Les cellules souches ........................................................................................................... 27
3.1 Les cellules souches en général ................................................................................. 27
3.2 Les cellules souches dentaires ................................................................................... 29
3.2.1 DPSCs .................................................................................................................. 29
3.2.2 SCAPs .................................................................................................................. 30
3.2.3 Autres types de cellules souches dentaires ....................................................... 30
Objectifs...................................................................................................................................32
Matériels et méthodes.............................................................................................................34
1 Recueil et congélation des DPSCs et SCAPs ...................................................................... 34
2 Décongélation et culture cellulaire ................................................................................... 34
2.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 34
2.2 Méthode .................................................................................................................... 35
3 Comptage et passage des cellules..................................................................................... 35
3.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 35
3.2 Méthode .................................................................................................................... 36
4 Réalisation des pools de cellules ....................................................................................... 37
4.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 37
4.2 Méthode .................................................................................................................... 38
5 Congélation des pools ....................................................................................................... 38
5.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 38
5.2 Méthode .................................................................................................................... 38
6 FACS ................................................................................................................................... 39
6.1 Point théorique .......................................................................................................... 39
6.2 Matériels et réactifs ................................................................................................... 41
6.3 Méthode .................................................................................................................... 41
7 RT-PCR ............................................................................................................................... 42
7.1 Point théorique .......................................................................................................... 42
7.2 Matériels et réactifs ................................................................................................... 45
7.3 Méthode .................................................................................................................... 46
7.3.1 Extraction d'ARN ................................................................................................. 46
7.3.2 Préparation des cDNA : ...................................................................................... 47
7.3.3 RT-PCR : .............................................................................................................. 47
8 Différenciation en chondroblastes .................................................................................... 48
8.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 48
8.2 Méthode .................................................................................................................... 49
8.3 Enrobage, réalisation de coupes histologiques et colorations : ................................ 49
9 Neurodifférenciation ......................................................................................................... 50
9.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 50
9.2 Méthode .................................................................................................................... 51
9.3 Marquage panNeuroFilament : ................................................................................. 51
10 Différenciation en ostéoblastes ........................................................................................ 51
10.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 51
10.2 Méthode .................................................................................................................... 52
10.3 Marquage Alizarin Red : ............................................................................................. 52
Résultats..................................................................................................................................54
1 Recueil et congélation des DPSCs et SCAPs ...................................................................... 54
2 Réalisation des pools de cellules ....................................................................................... 54
2.1 DPSCs ......................................................................................................................... 54
2.2 SCAPs .......................................................................................................................... 54
3 Congélation des pools à P3 ............................................................................................... 55
3.1 DPSCs ......................................................................................................................... 55
3.2 SCAPs .......................................................................................................................... 55
4 FACS ................................................................................................................................... 56
4.1 DPSCs à P5 .................................................................................................................. 56
4.2 SCAPs à P5 .................................................................................................................. 56
4.3 DPSCs à P10 ................................................................................................................ 56
4.4 SCAPs à P10 ................................................................................................................ 56
4.5 Comparaison du pool DPSC à P5 et P10 .................................................................... 57
4.6 Comparaison du pool DPSC à P5 et P10 .................................................................... 57
5 RT-PCR ............................................................................................................................... 57
6 Différenciation en chondroblastes .................................................................................... 59
6.1 DPSCs à P5 .................................................................................................................. 59
6.2 SCAPs à P5 .................................................................................................................. 59
7 Neurodifférenciation des DPSCs et SCAPs à P5 ................................................................ 59
8 Différenciation en ostéoblastes ........................................................................................ 60
8.1 DPSCs à P5 .................................................................................................................. 60
8.2 SCAPs à P5 .................................................................................................................. 61
Discussion................................................................................................................................62
1 FACS ................................................................................................................................... 62
2 RT-PCR ............................................................................................................................... 62
3 Différenciation en chondroblastes .................................................................................... 63
4 Neurodifférenciation ......................................................................................................... 63
5 Différenciation en ostéoblastes ........................................................................................ 64
Conclusion................................................................................................................................66
Liste des abréviations...............................................................................................................68
Bibliographie............................................................................................................................70
AnnexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65680 Caractérisation de pools de cellules souches dentaires en vue du développement de nouvelles procédures de régénération de la pulpe dentaire [TFE / Mémoire] / SOPHIE LIGOT, Auteur . - 2016.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Louvain Drug Research Institute LDRI Woluwe-Saint-Lambert dent cellules souches émail dentine pulpe papille carie DPSCs SCAPs culture cellulaire pools FACS RT-PCR chondroblastes neurodifférenciation ostéoblastes Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage....................................................................................................8
Introduction.............................................................................................................................10
Contexte général......................................................................................................................12
1 La dent ............................................................................................................................... 12
1.1 Généralités ................................................................................................................. 12
1.1.1 Structure ............................................................................................................. 12
1.1.2 Développement .................................................................................................. 12
1.1.3 Eruption .............................................................................................................. 13
1.2 L'émail ........................................................................................................................ 15
1.3 La dentine .................................................................................................................. 16
1.4 La pulpe ...................................................................................................................... 17
1.5 La papille .................................................................................................................... 19
2 La carie .............................................................................................................................. 20
2.1 Généralités ................................................................................................................. 20
2.2 Pulpite et nécrose pulpaire ........................................................................................ 23
2.3 Traitement ................................................................................................................. 26
3 Les cellules souches ........................................................................................................... 27
3.1 Les cellules souches en général ................................................................................. 27
3.2 Les cellules souches dentaires ................................................................................... 29
3.2.1 DPSCs .................................................................................................................. 29
3.2.2 SCAPs .................................................................................................................. 30
3.2.3 Autres types de cellules souches dentaires ....................................................... 30
Objectifs...................................................................................................................................32
Matériels et méthodes.............................................................................................................34
1 Recueil et congélation des DPSCs et SCAPs ...................................................................... 34
2 Décongélation et culture cellulaire ................................................................................... 34
2.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 34
2.2 Méthode .................................................................................................................... 35
3 Comptage et passage des cellules..................................................................................... 35
3.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 35
3.2 Méthode .................................................................................................................... 36
4 Réalisation des pools de cellules ....................................................................................... 37
4.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 37
4.2 Méthode .................................................................................................................... 38
5 Congélation des pools ....................................................................................................... 38
5.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 38
5.2 Méthode .................................................................................................................... 38
6 FACS ................................................................................................................................... 39
6.1 Point théorique .......................................................................................................... 39
6.2 Matériels et réactifs ................................................................................................... 41
6.3 Méthode .................................................................................................................... 41
7 RT-PCR ............................................................................................................................... 42
7.1 Point théorique .......................................................................................................... 42
7.2 Matériels et réactifs ................................................................................................... 45
7.3 Méthode .................................................................................................................... 46
7.3.1 Extraction d'ARN ................................................................................................. 46
7.3.2 Préparation des cDNA : ...................................................................................... 47
7.3.3 RT-PCR : .............................................................................................................. 47
8 Différenciation en chondroblastes .................................................................................... 48
8.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 48
8.2 Méthode .................................................................................................................... 49
8.3 Enrobage, réalisation de coupes histologiques et colorations : ................................ 49
9 Neurodifférenciation ......................................................................................................... 50
9.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 50
9.2 Méthode .................................................................................................................... 51
9.3 Marquage panNeuroFilament : ................................................................................. 51
10 Différenciation en ostéoblastes ........................................................................................ 51
10.1 Matériels et réactifs ................................................................................................... 51
10.2 Méthode .................................................................................................................... 52
10.3 Marquage Alizarin Red : ............................................................................................. 52
Résultats..................................................................................................................................54
1 Recueil et congélation des DPSCs et SCAPs ...................................................................... 54
2 Réalisation des pools de cellules ....................................................................................... 54
2.1 DPSCs ......................................................................................................................... 54
2.2 SCAPs .......................................................................................................................... 54
3 Congélation des pools à P3 ............................................................................................... 55
3.1 DPSCs ......................................................................................................................... 55
3.2 SCAPs .......................................................................................................................... 55
4 FACS ................................................................................................................................... 56
4.1 DPSCs à P5 .................................................................................................................. 56
4.2 SCAPs à P5 .................................................................................................................. 56
4.3 DPSCs à P10 ................................................................................................................ 56
4.4 SCAPs à P10 ................................................................................................................ 56
4.5 Comparaison du pool DPSC à P5 et P10 .................................................................... 57
4.6 Comparaison du pool DPSC à P5 et P10 .................................................................... 57
5 RT-PCR ............................................................................................................................... 57
6 Différenciation en chondroblastes .................................................................................... 59
6.1 DPSCs à P5 .................................................................................................................. 59
6.2 SCAPs à P5 .................................................................................................................. 59
7 Neurodifférenciation des DPSCs et SCAPs à P5 ................................................................ 59
8 Différenciation en ostéoblastes ........................................................................................ 60
8.1 DPSCs à P5 .................................................................................................................. 60
8.2 SCAPs à P5 .................................................................................................................. 61
Discussion................................................................................................................................62
1 FACS ................................................................................................................................... 62
2 RT-PCR ............................................................................................................................... 62
3 Différenciation en chondroblastes .................................................................................... 63
4 Neurodifférenciation ......................................................................................................... 63
5 Différenciation en ostéoblastes ........................................................................................ 64
Conclusion................................................................................................................................66
Liste des abréviations...............................................................................................................68
Bibliographie............................................................................................................................70
AnnexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65680 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etude de la résistance à la Bléomycine induite par la protéine TMEM45A dans les cellules cancéreuses HepG2 / SOPHIE CRÈVECOEUR
Titre : Etude de la résistance à la Bléomycine induite par la protéine TMEM45A dans les cellules cancéreuses HepG2 Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : SOPHIE CRÈVECOEUR, Année de publication : 2016 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Biologie médicale UNamur CBS URBC cancer hépatocarcinome radiothérapie traitement étoposide cisplatine bléomycine apoptose cellulaire caspases apoptose intrinsèque apoptose extrinsèque résistance cellulaire pompes à éfflux hypoxie hypoxie tumorale hypoxie chronique hypoxie aigüe HIF angiogenèse tumorale TMEM45A siRNA culture cellulaire comptage cellulaire activité métabolique spectrophotométrie étude cellulaire cytotoxicité LDH Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage ………………………………………………………………………………………………………………… 9
Introduction générale ……………………………………………………………………………………………………………………………11
Contexte général …………………………………………………………………………………………………………………………………. 13
1. Le cancer : généralités .................................................................................................................... 13
1.1. L’hépatocarcinome ................................................................................................................. 13
1.2. Les différents moyens de traitement ...................................................................................... 14
1.2.1. Chirurgie …………………………………………………………………………………………………………………………14
1.2.2. Radiothérapie ………………………………………………………………………………………………………………...14
1.2.3. Chimiothérapie ……………………………………………………………………………………………………………… 15
1.2.4. Thérapie ciblée ……………………………………………………………………………………………………………….16
1.3. Les molécules anticancéreuses ............................................................................................... 17
1.3.1. Etoposide ……………………………………………………………………………………………………………………….17
1.3.2. Cisplatine ……………………………………………………………………………………………………………………….17
1.3.3. Bléomycine …………………………………………………………………………………………………………………….18
2. L’apoptose cellulaire ....................................................................................................................... 19
2.1. L’apoptose ............................................................................................................................... 19
2.2. Les caspases ............................................................................................................................ 19
2.3. Les voies de signalisation de l’apoptose ................................................................................. 20
2.3.1. L'apoptose intrinsèque …………………………………………………………………………………………………..20
2.3.2. L'apoptose extrinsèque …………………………………………………………………………………………………. 20
2.4. L’apoptose et les cellules cancéreuses ................................................................................... 21
3. La résistance .................................................................................................................................... 21
3.1. Résistance cellulaire aux anticancéreux ................................................................................. 21
3.2. Mécanismes de résistance ...................................................................................................... 21
3.2.1. Les pompes à éfflux ………………………………………………………………………………………………………..22
3.2.2. Modification de la cible ………………………………………………………………………………………………….22
4. L’hypoxie et la résistance ................................................................................................................ 22
4.1. L’hypoxie ................................................................................................................................. 22
4.1.1. Hypoxie tumorale …………………………………………………………………………………………………………. 22
4.1.2. Hypoxie chronique ………………………………………………………………………………………………………… 23
6 | P a g e
4.1.3. Hypoxie aiguë ………………………………………………………………………………………………………………...25
4.2. HIF ........................................................................................................................................... 25
4.2.1. Caractéristiques …………………………………………………………………………………………………………….25
4.2.2. HIF, résistances et croissance tumorale ………………………………………………………………………….25
4.3. Angiogenèse tumorale ............................................................................................................ 26
4.4. Résistance en condition d’hypoxie ......................................................................................... 26
5. TMEM45A ....................................................................................................................................... 27
5.1. Découverte .............................................................................................................................. 27
5.2. Caractéristiques ...................................................................................................................... 28
5.3. TMEM45A et l’hypoxie ............................................................................................................ 28
5.4. TMEM45A et le cancer ............................................................................................................ 29
5.5. siRNA ....................................................................................................................................... 30
Objectifs et stratégies …………………………………………………………………………………………………………………………..33
Matériel et méthodes …………………………………………………………………………………………………………………………..35
1. Techniques de culture cellulaire ..................................................................................................... 35
1.1. Matériel biologique ................................................................................................................. 35
1.2. Travail en conditions stériles .................................................................................................. 36
1.3. Comptage cellulaire ................................................................................................................ 36
2. Techniques d’étude cellulaire ......................................................................................................... 37
2.1. Test d’activité métabolique ................................................................................................... 37
2.1.1. Test d'activité métabolique ; MTT .………………………………………………………………………………….37
2.1.2. But .……………………………………………………………………………………………………………………………….. 37
2.1.3. Principe …………………………………………………………………………………………………………………………..37
2.1.4. Spectrophotométrie ……………………………………………………………………………………………………….38
2.2. Test à l’Iodure de Propidium, IP .............................................................................................. 39
2.2.1. Test de résistance …………………………………………………………………………………………………………..39
2.2.2. But ………………………………………………………………………………………………………………………………… 39
2.2.3. Principe …………………………………………………………………………………………………………………………..39
2.2.4. Hypoxie …………………………………………………………………………………………………………………………. 40
2.2.5. Fluorimétrie ……………………………………………………………………………………………………………………41
2.3. LDH .......................................................................................................................................... 42
2.3.1. Test de cytotoxicité ………………………………………………………………………………………………………..42
7 | P a g e
2.3.2. But ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 42
2.3.3. Principe ………………………………………………………………………………………………………………………….42
2.3.4. Lactate déshydrogénase …………………………………………………………………………………………………43
Résultats et discussion ………………………………………………………………………………………………………………………….45
1ère étape : établir la concentration de travail en Bléomycine : test MTT …………………………………………….45
1. Procédure générale ......................................................................................................................... 45
1.1. Jour 1 ....................................................................................................................................... 45
1.2. Jour 2 ....................................................................................................................................... 46
1.3. Jour 3 ....................................................................................................................................... 47
2. Conditions expérimentales ............................................................................................................. 47
3. Résultats .......................................................................................................................................... 48
2ème étape : mise en évidence d'une résistance via un test de viabilité cellulaire : Iodure de Propidium (IP) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 51
1. Procédure générale ......................................................................................................................... 51
1.1. Jour 1 ....................................................................................................................................... 51
1.2. Jour 2 ....................................................................................................................................... 51
1.3. Jour 3 ....................................................................................................................................... 51
2. Conditions expérimentales ............................................................................................................. 52
3. Résultats .......................................................................................................................................... 52
3ème étape : confirmation de la résistance via un test de cytotoxicité : LDH ………………………………………. 54
1. Procédure générale ......................................................................................................................... 54
1.1. Jour 1 ....................................................................................................................................... 54
1.2. Jour 2 ....................................................................................................................................... 54
1.3. Jour 3 ....................................................................................................................................... 54
2. Conditions expérimentales ............................................................................................................. 54
3. Résultats ........................................................................................................................................ 566
Conclusions ............................................................................................................................................. 59
Perspectives ............................................................................................................................................ 59
Table des abréviations …………………………………………………………………………………………………………………………. 63
Bibliographie ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 65
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65665 Etude de la résistance à la Bléomycine induite par la protéine TMEM45A dans les cellules cancéreuses HepG2 [TFE / Mémoire] / SOPHIE CRÈVECOEUR, . - 2016.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : Biologie médicale UNamur CBS URBC cancer hépatocarcinome radiothérapie traitement étoposide cisplatine bléomycine apoptose cellulaire caspases apoptose intrinsèque apoptose extrinsèque résistance cellulaire pompes à éfflux hypoxie hypoxie tumorale hypoxie chronique hypoxie aigüe HIF angiogenèse tumorale TMEM45A siRNA culture cellulaire comptage cellulaire activité métabolique spectrophotométrie étude cellulaire cytotoxicité LDH Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage ………………………………………………………………………………………………………………… 9
Introduction générale ……………………………………………………………………………………………………………………………11
Contexte général …………………………………………………………………………………………………………………………………. 13
1. Le cancer : généralités .................................................................................................................... 13
1.1. L’hépatocarcinome ................................................................................................................. 13
1.2. Les différents moyens de traitement ...................................................................................... 14
1.2.1. Chirurgie …………………………………………………………………………………………………………………………14
1.2.2. Radiothérapie ………………………………………………………………………………………………………………...14
1.2.3. Chimiothérapie ……………………………………………………………………………………………………………… 15
1.2.4. Thérapie ciblée ……………………………………………………………………………………………………………….16
1.3. Les molécules anticancéreuses ............................................................................................... 17
1.3.1. Etoposide ……………………………………………………………………………………………………………………….17
1.3.2. Cisplatine ……………………………………………………………………………………………………………………….17
1.3.3. Bléomycine …………………………………………………………………………………………………………………….18
2. L’apoptose cellulaire ....................................................................................................................... 19
2.1. L’apoptose ............................................................................................................................... 19
2.2. Les caspases ............................................................................................................................ 19
2.3. Les voies de signalisation de l’apoptose ................................................................................. 20
2.3.1. L'apoptose intrinsèque …………………………………………………………………………………………………..20
2.3.2. L'apoptose extrinsèque …………………………………………………………………………………………………. 20
2.4. L’apoptose et les cellules cancéreuses ................................................................................... 21
3. La résistance .................................................................................................................................... 21
3.1. Résistance cellulaire aux anticancéreux ................................................................................. 21
3.2. Mécanismes de résistance ...................................................................................................... 21
3.2.1. Les pompes à éfflux ………………………………………………………………………………………………………..22
3.2.2. Modification de la cible ………………………………………………………………………………………………….22
4. L’hypoxie et la résistance ................................................................................................................ 22
4.1. L’hypoxie ................................................................................................................................. 22
4.1.1. Hypoxie tumorale …………………………………………………………………………………………………………. 22
4.1.2. Hypoxie chronique ………………………………………………………………………………………………………… 23
6 | P a g e
4.1.3. Hypoxie aiguë ………………………………………………………………………………………………………………...25
4.2. HIF ........................................................................................................................................... 25
4.2.1. Caractéristiques …………………………………………………………………………………………………………….25
4.2.2. HIF, résistances et croissance tumorale ………………………………………………………………………….25
4.3. Angiogenèse tumorale ............................................................................................................ 26
4.4. Résistance en condition d’hypoxie ......................................................................................... 26
5. TMEM45A ....................................................................................................................................... 27
5.1. Découverte .............................................................................................................................. 27
5.2. Caractéristiques ...................................................................................................................... 28
5.3. TMEM45A et l’hypoxie ............................................................................................................ 28
5.4. TMEM45A et le cancer ............................................................................................................ 29
5.5. siRNA ....................................................................................................................................... 30
Objectifs et stratégies …………………………………………………………………………………………………………………………..33
Matériel et méthodes …………………………………………………………………………………………………………………………..35
1. Techniques de culture cellulaire ..................................................................................................... 35
1.1. Matériel biologique ................................................................................................................. 35
1.2. Travail en conditions stériles .................................................................................................. 36
1.3. Comptage cellulaire ................................................................................................................ 36
2. Techniques d’étude cellulaire ......................................................................................................... 37
2.1. Test d’activité métabolique ................................................................................................... 37
2.1.1. Test d'activité métabolique ; MTT .………………………………………………………………………………….37
2.1.2. But .……………………………………………………………………………………………………………………………….. 37
2.1.3. Principe …………………………………………………………………………………………………………………………..37
2.1.4. Spectrophotométrie ……………………………………………………………………………………………………….38
2.2. Test à l’Iodure de Propidium, IP .............................................................................................. 39
2.2.1. Test de résistance …………………………………………………………………………………………………………..39
2.2.2. But ………………………………………………………………………………………………………………………………… 39
2.2.3. Principe …………………………………………………………………………………………………………………………..39
2.2.4. Hypoxie …………………………………………………………………………………………………………………………. 40
2.2.5. Fluorimétrie ……………………………………………………………………………………………………………………41
2.3. LDH .......................................................................................................................................... 42
2.3.1. Test de cytotoxicité ………………………………………………………………………………………………………..42
7 | P a g e
2.3.2. But ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 42
2.3.3. Principe ………………………………………………………………………………………………………………………….42
2.3.4. Lactate déshydrogénase …………………………………………………………………………………………………43
Résultats et discussion ………………………………………………………………………………………………………………………….45
1ère étape : établir la concentration de travail en Bléomycine : test MTT …………………………………………….45
1. Procédure générale ......................................................................................................................... 45
1.1. Jour 1 ....................................................................................................................................... 45
1.2. Jour 2 ....................................................................................................................................... 46
1.3. Jour 3 ....................................................................................................................................... 47
2. Conditions expérimentales ............................................................................................................. 47
3. Résultats .......................................................................................................................................... 48
2ème étape : mise en évidence d'une résistance via un test de viabilité cellulaire : Iodure de Propidium (IP) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 51
1. Procédure générale ......................................................................................................................... 51
1.1. Jour 1 ....................................................................................................................................... 51
1.2. Jour 2 ....................................................................................................................................... 51
1.3. Jour 3 ....................................................................................................................................... 51
2. Conditions expérimentales ............................................................................................................. 52
3. Résultats .......................................................................................................................................... 52
3ème étape : confirmation de la résistance via un test de cytotoxicité : LDH ………………………………………. 54
1. Procédure générale ......................................................................................................................... 54
1.1. Jour 1 ....................................................................................................................................... 54
1.2. Jour 2 ....................................................................................................................................... 54
1.3. Jour 3 ....................................................................................................................................... 54
2. Conditions expérimentales ............................................................................................................. 54
3. Résultats ........................................................................................................................................ 566
Conclusions ............................................................................................................................................. 59
Perspectives ............................................................................................................................................ 59
Table des abréviations …………………………………………………………………………………………………………………………. 63
Bibliographie ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 65
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65665 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Impact de la méthylation sur le promoteur des LATs durant l'infection in vivo et in vitro du virus de la maladie de Marek / Oriana Laforgia
Titre : Impact de la méthylation sur le promoteur des LATs durant l'infection in vivo et in vitro du virus de la maladie de Marek Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Oriana Laforgia, Auteur Année de publication : 2016 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Unité de Recherche Vétérinaire Intégrée URVI maladie de Malek microARN transcription expression phase de latence du MDV epigénétique culture cellulaire extraction ADN quantification ADN bisulfite nested PCR électrophorèse ADN purification acide nucléique ligation clonage LAT Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : SOMMAIRE
Remerciements
1 PrÉsentation du lieu de stage................................................................................................ 7
2 Introduction .......................................................................................................................... 9
3 Contexte général ................................................................................................................. 11
3.1 La maladie de Marek ................................................................................................... 11
3.1.1 Historique: ........................................................................................................... 11
3.1.2 Classification:....................................................................................................... 12
3.1.3 Formes cliniques.................................................................................................. 13
3.1.4 Structure du virus ................................................................................................ 14
3.1.5 Cycle de vie .......................................................................................................... 15
3.2 Les microARN .............................................................................................................. 17
3.2.1 Généralités .......................................................................................................... 17
3.2.2 Biogenèse des microARN .................................................................................... 18
3.2.3 Les microARN de GaHV-2 .................................................................................... 19
3.2.4 Initiation de la transcription et « core » promoteur ........................................... 20
3.3 Transcription et expression des gènes durant la phase de latence du MDV .............. 21
3.3.1 Le gène ICP4 ........................................................................................................ 21
3.3.3 LAT (Latency associated transcript) .................................................................... 22
3.4 Épigénétique ............................................................................................................... 24
3.4.1 Généralités .......................................................................................................... 24
3.4.2 Acétylation des histones ..................................................................................... 24
3.4.3 Phosphorylation des histones ............................................................................. 25
3.4.4 Méthylation des histones .................................................................................... 25
3.4.5 Méthylation de l'ADN .......................................................................................... 26
3.4.6 Méthylation de l'ADN dans le MDV .................................................................... 27
4 Objectifs et stratÉgie ........................................................................................................... 29
5 Matériel et méthodes ......................................................................................................... 31
5.1 Culture cellulaire ......................................................................................................... 31
5.1.1 Les cellules MSB-1 ............................................................................................... 31
5.1.2 Cellules embryonnaires de poulet infectées (CEFs) par la souche virale RB-1B . 31
5.1.3 Epithéliums de follicules plumeux (FFE) .............................................................. 31
5.2 Extraction d'ADN et quantification ............................................................................. 32
5.3 Traitement au bisulfite ................................................................................................ 32
5.4 Nested polymerase chain reaction (nested PCR) ........................................................ 34
5.5 Électrophorèse d'ADN ................................................................................................. 35
5.6 Purification des acides nucléiques .............................................................................. 36
5.7 Préparation des bactéries compétentes ..................................................................... 36
6
5.8 Ligation vecteur/insert ................................................................................................ 36
5.9 Clonage ........................................................................................................................ 37
5.10 Système blanc/bleu ..................................................................................................... 38
5.11 Screen PCR et séquençage .......................................................................................... 39
6 RÉsultats et discussion ........................................................................................................ 41
6.1 Construction de la région promotrice du LAT ............................................................. 41
6.2 Effet du traitement au bisulfite ................................................................................... 43
6.3 Amplification par PCR nichée des échantillons traités au bisulfite ............................. 45
6.4 Clonage des amplicons obtenus à partir d'échantillons biologiques .......................... 47
6.5 Analyse des profils de méthylation du promoteur LAT dans différents contextes biologiques .............................................................................................................................. 50
6.5.1 Distribution des répétitions in vivo et in vitro ..................................................... 50
6.5.2 Profils de méthylation in vivo et in vitro ............................................................. 52
6.5.3 Pourcentage de méthylation pour chaque site CpG ........................................... 54
7 Discussion et conclusion ..................................................................................................... 57
8 Liste des figures ................................................................................................................... 59
9 Liste des tableaux ................................................................................................................ 60
10 Glossaire .......................................................................................................................... 61
11 Bibliographie ................................................................................................................... 65Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65676 Impact de la méthylation sur le promoteur des LATs durant l'infection in vivo et in vitro du virus de la maladie de Marek [TFE / Mémoire] / Oriana Laforgia, Auteur . - 2016.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Unité de Recherche Vétérinaire Intégrée URVI maladie de Malek microARN transcription expression phase de latence du MDV epigénétique culture cellulaire extraction ADN quantification ADN bisulfite nested PCR électrophorèse ADN purification acide nucléique ligation clonage LAT Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : SOMMAIRE
Remerciements
1 PrÉsentation du lieu de stage................................................................................................ 7
2 Introduction .......................................................................................................................... 9
3 Contexte général ................................................................................................................. 11
3.1 La maladie de Marek ................................................................................................... 11
3.1.1 Historique: ........................................................................................................... 11
3.1.2 Classification:....................................................................................................... 12
3.1.3 Formes cliniques.................................................................................................. 13
3.1.4 Structure du virus ................................................................................................ 14
3.1.5 Cycle de vie .......................................................................................................... 15
3.2 Les microARN .............................................................................................................. 17
3.2.1 Généralités .......................................................................................................... 17
3.2.2 Biogenèse des microARN .................................................................................... 18
3.2.3 Les microARN de GaHV-2 .................................................................................... 19
3.2.4 Initiation de la transcription et « core » promoteur ........................................... 20
3.3 Transcription et expression des gènes durant la phase de latence du MDV .............. 21
3.3.1 Le gène ICP4 ........................................................................................................ 21
3.3.3 LAT (Latency associated transcript) .................................................................... 22
3.4 Épigénétique ............................................................................................................... 24
3.4.1 Généralités .......................................................................................................... 24
3.4.2 Acétylation des histones ..................................................................................... 24
3.4.3 Phosphorylation des histones ............................................................................. 25
3.4.4 Méthylation des histones .................................................................................... 25
3.4.5 Méthylation de l'ADN .......................................................................................... 26
3.4.6 Méthylation de l'ADN dans le MDV .................................................................... 27
4 Objectifs et stratÉgie ........................................................................................................... 29
5 Matériel et méthodes ......................................................................................................... 31
5.1 Culture cellulaire ......................................................................................................... 31
5.1.1 Les cellules MSB-1 ............................................................................................... 31
5.1.2 Cellules embryonnaires de poulet infectées (CEFs) par la souche virale RB-1B . 31
5.1.3 Epithéliums de follicules plumeux (FFE) .............................................................. 31
5.2 Extraction d'ADN et quantification ............................................................................. 32
5.3 Traitement au bisulfite ................................................................................................ 32
5.4 Nested polymerase chain reaction (nested PCR) ........................................................ 34
5.5 Électrophorèse d'ADN ................................................................................................. 35
5.6 Purification des acides nucléiques .............................................................................. 36
5.7 Préparation des bactéries compétentes ..................................................................... 36
6
5.8 Ligation vecteur/insert ................................................................................................ 36
5.9 Clonage ........................................................................................................................ 37
5.10 Système blanc/bleu ..................................................................................................... 38
5.11 Screen PCR et séquençage .......................................................................................... 39
6 RÉsultats et discussion ........................................................................................................ 41
6.1 Construction de la région promotrice du LAT ............................................................. 41
6.2 Effet du traitement au bisulfite ................................................................................... 43
6.3 Amplification par PCR nichée des échantillons traités au bisulfite ............................. 45
6.4 Clonage des amplicons obtenus à partir d'échantillons biologiques .......................... 47
6.5 Analyse des profils de méthylation du promoteur LAT dans différents contextes biologiques .............................................................................................................................. 50
6.5.1 Distribution des répétitions in vivo et in vitro ..................................................... 50
6.5.2 Profils de méthylation in vivo et in vitro ............................................................. 52
6.5.3 Pourcentage de méthylation pour chaque site CpG ........................................... 54
7 Discussion et conclusion ..................................................................................................... 57
8 Liste des figures ................................................................................................................... 59
9 Liste des tableaux ................................................................................................................ 60
10 Glossaire .......................................................................................................................... 61
11 Bibliographie ................................................................................................................... 65Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65676 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Mise au point et optimisation d’un protocole de chimiogramme sur cellules primaires de leucémies / PERRINE BOLAND
Titre : Mise au point et optimisation d’un protocole de chimiogramme sur cellules primaires de leucémies Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : PERRINE BOLAND, Année de publication : 2016 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Biologie médicale Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille hématopoïèse leucémie aigüe traitement culture cellulaire décongélation coculture activité cytotoxique Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage
Introduction générale ............................................................................................................................. 10
I. Contexte général ................................................................................................................................ 12
1. Qu’est-ce que l’hématopoïèse ? ............................................................................................. 12
2. Leucémie aigüe ...................................................................................................................... 13
3. Traitement de la leucémie aigüe ............................................................................................ 15
II. Objectifs et stratégies ........................................................................................................................ 18
III. Matériels et méthodes ...................................................................................................................... 20
Matériel ............................................................................................................................................. 20
1. Appareillage, réactifs et milieux ............................................................................................ 20
2. Culture Cellulaire .................................................................................................................. 21
3. Protocole de décongélation.................................................................................................... 22
Méthode ............................................................................................................................................. 23
Objectif 1 : Optimisation des conditions de culture de cellules primaires issues de patients leucémiques ....................................................................................................................................... 23
1. Tests de milieux de culture .................................................................................................... 23
2. Coculture sur cellules stromales ............................................................................................ 29
Objectif n° 2 : Mise au point du passage en format 384 puits pour la réalisation de chémogrammes ........................................................................................................................................................... 33
1. Comparaison des plaques 384 puits noire et blanche ............................................................ 33
2. Comparaison de l’activité cytotoxique de l’AraC sur lignées leucémiques et donneurs primaires en plaque 384 puits noire et blanche ............................................................................. 34
IV. Résultats .......................................................................................................................................... 38
Objectif n°1 : Optimisation des conditions de culture ....................................................................... 38
1. Mononuclear Cell Medium.................................................................................................... 39
2. IMDM 20% FCS et IMDM 20% FCS complémenté de cytokines ....................................... 41
3. Coculture ............................................................................................................................... 49
Objectif n° 2 : Mise au point du passage en format 384 puits pour la réalisation de chemogrammes ........................................................................................................................................................... 53
1. Comparaison des plaques 384 puits blanche et noire ............................................................ 53
2. Comparaison de l’activité cytotoxique de l’AraC sur lignées leucémiques et donneurs primaires en plaque 384 puits noire et blanche ............................................................................. 56
Discussion et perspectives ..................................................................................................................... 60
Bibliographie ......................................................................................................................................... 64
AnnexePermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65663 Mise au point et optimisation d’un protocole de chimiogramme sur cellules primaires de leucémies [TFE / Mémoire] / PERRINE BOLAND, . - 2016.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : Biologie médicale Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille hématopoïèse leucémie aigüe traitement culture cellulaire décongélation coculture activité cytotoxique Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage
Introduction générale ............................................................................................................................. 10
I. Contexte général ................................................................................................................................ 12
1. Qu’est-ce que l’hématopoïèse ? ............................................................................................. 12
2. Leucémie aigüe ...................................................................................................................... 13
3. Traitement de la leucémie aigüe ............................................................................................ 15
II. Objectifs et stratégies ........................................................................................................................ 18
III. Matériels et méthodes ...................................................................................................................... 20
Matériel ............................................................................................................................................. 20
1. Appareillage, réactifs et milieux ............................................................................................ 20
2. Culture Cellulaire .................................................................................................................. 21
3. Protocole de décongélation.................................................................................................... 22
Méthode ............................................................................................................................................. 23
Objectif 1 : Optimisation des conditions de culture de cellules primaires issues de patients leucémiques ....................................................................................................................................... 23
1. Tests de milieux de culture .................................................................................................... 23
2. Coculture sur cellules stromales ............................................................................................ 29
Objectif n° 2 : Mise au point du passage en format 384 puits pour la réalisation de chémogrammes ........................................................................................................................................................... 33
1. Comparaison des plaques 384 puits noire et blanche ............................................................ 33
2. Comparaison de l’activité cytotoxique de l’AraC sur lignées leucémiques et donneurs primaires en plaque 384 puits noire et blanche ............................................................................. 34
IV. Résultats .......................................................................................................................................... 38
Objectif n°1 : Optimisation des conditions de culture ....................................................................... 38
1. Mononuclear Cell Medium.................................................................................................... 39
2. IMDM 20% FCS et IMDM 20% FCS complémenté de cytokines ....................................... 41
3. Coculture ............................................................................................................................... 49
Objectif n° 2 : Mise au point du passage en format 384 puits pour la réalisation de chemogrammes ........................................................................................................................................................... 53
1. Comparaison des plaques 384 puits blanche et noire ............................................................ 53
2. Comparaison de l’activité cytotoxique de l’AraC sur lignées leucémiques et donneurs primaires en plaque 384 puits noire et blanche ............................................................................. 56
Discussion et perspectives ..................................................................................................................... 60
Bibliographie ......................................................................................................................................... 64
AnnexePermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65663 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Validation du rôle cytotoxique de l'acide pamitique sur des cellules myoblastiques et macrophagiques de souris. Investigation d'une nouvelle adipokine, la chémérine / BRUNO INFOSINO
Titre : Validation du rôle cytotoxique de l'acide pamitique sur des cellules myoblastiques et macrophagiques de souris. Investigation d'une nouvelle adipokine, la chémérine Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : BRUNO INFOSINO, Auteur Année de publication : 2016 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. . Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale obésité déséquilibre énergétique prédisposition génétique tissu adipeux adipokine culture cellulaire ARN analyse protéique acide palmitique chérémine Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................ 9
CONTEXTE GENERAL ....................................................................................................... 11
1 L’OBESITE ..................................................................................................................... 11
1.1 QUELQUES CHIFFRES .................................................................................................. 11
1.2 QU’EST-CE QUE L’OBESITE ? ....................................................................................... 12
1.3 LES CAUSES ................................................................................................................ 13
1.3.1 Déséquilibre énergétique ....................................................................................... 13
1.3.2 Prédisposition génétique ........................................................................................ 14
1.3.3 L’environnement .................................................................................................... 14
1.4 LES CONSEQUENCES ................................................................................................... 15
2 TISSUS TOUCHES PAR L’OBESITE ........................................................................ 15
2.1 LE TISSU ADIPEUX ....................................................................................................... 16
2.1.1 Le tissu adipeux sain .............................................................................................. 16
2.1.2 Altération du tissu adipeux .................................................................................... 17
2.2 LE MUSCLE ................................................................................................................. 19
3 LES ADIPOKINES ......................................................................................................... 20
OBJECTIFS ET STRATEGIE ............................................................................................. 25
MATERIEL ET METHODES .............................................................................................. 27
4 CULTURE CELLULAIRE ............................................................................................ 27
4.1 MATERIEL .................................................................................................................. 27
4.2 LIGNEES CELLULAIRES ............................................................................................... 27
4.3 DECONGELATION DES CELLULES ................................................................................ 28
4.4 CULTURE DES CELLULES ............................................................................................. 29
4.5 PASSAGE DES CELLULES ............................................................................................. 30
4.6 ENSEMENCEMENT DES CELLULES ............................................................................... 31
4.7 STERILITE ................................................................................................................... 31
4.8 TEST MYCOPLASME .................................................................................................... 32
4.9 PROTOCOLE EXPERIMENTAL : GROUPES ET DOSES DE TRAVAIL................................... 33
4.10 TEST MTT .................................................................................................................. 34
4.11 RECOLTE DES CELLULES ............................................................................................. 34
5 ANALYSE HISTOLOGIQUE ....................................................................................... 35
5.1 MATERIEL .................................................................................................................. 35
5.2 OIL RED O .................................................................................................................. 35
6 ANALYSE ARN .............................................................................................................. 36
6.1 MATERIEL .................................................................................................................. 36
6.2 EXTRACTION ARN ..................................................................................................... 37
6.2.1 Lyse cellulaire ........................................................................................................ 37
6.2.2 Filtration du lysat .................................................................................................. 37
6.2.3 Liaison de l’ARN sur la membrane ........................................................................ 38
6.2.4 Dessalage de la membrane de silice ...................................................................... 38
6.2.5 Digestion de l’ADN ................................................................................................ 38
6.2.6 Lavage et séchage de la membrane de silice ......................................................... 38
6.2.7 Elution de l’ARN total ............................................................................................ 39
6.3 DOSAGE DE L’ARN PAR SPECTROPHOTOMETRIE ........................................................ 39
6.4 RETRO-TRANSCRIPTION .............................................................................................. 39
6.5 ANALYSE PCR............................................................................................................ 40
6.5.1 PCR qualitative ...................................................................................................... 40
6.5.2 PCR quantitative .................................................................................................... 43
7 ANALYSE PROTEIQUE .............................................................................................. 45
7.1 MATERIEL .................................................................................................................. 45
7.2 EXTRACTION PROTEIQUE ............................................................................................ 46
7.3 DOSAGE PROTEIQUE PAR LE TEST BCA (BICINCHONIC ACID ; KIT PIERCE BCA PROTEIN ASSAY (THERMO FISHER SCIENTIFIC)) ................................................................... 46
7.4 PREPARATION DES GELS DE POLYACRYLAMIDE .......................................................... 47
7.5 ELECTROPHORESE ...................................................................................................... 49
7.6 BLOTTING ................................................................................................................... 49
7.7 BLOCAGE .................................................................................................................... 50
7.8 IMMUNODETECTION .................................................................................................... 50
7.9 REVELATION ............................................................................................................... 51
7.10 DENSITOMETRIE ......................................................................................................... 51
7.11 RECYCLAGE DE LA MEMBRANE ................................................................................... 51
RESULTATS .......................................................................................................................... 53
8 EFFET LIPOTOXIQUE DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR LES CELLULES MYOBLASTIQUES DE SOURIS (C2C12) ........................................................................... 54
8.1 EVALUATION DE LA MORTALITE CELLULAIRE INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR UN TEST MTT ...................................................................... 54
8.2 MISE EN EVIDENCE D’INCLUSIONS LIPIDIQUES INTRACELLULAIRES INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR LA COLORATION AU OIL RED O ............. 54
8.3 EFFET DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR L’EXPRESSION DU GENE CODANT POUR L’AMPK-Α1 PAR RT-PCR QUALITATIVE ET QUANTITATIVE ................................................................. 56
8.4 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DE LA FORME ACTIVEE DE L’AMPK (PHOSPHO-AMPK) AINSI QUE LA FORME TOTALE (AMPK) PAR WESTERN BLOT ................................... 58
8.5 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DU RECEPTEUR A LA CHEMERINE (CMKLR1) PAR WESTERN BLOT ..................................................................................................................... 60
9 VALIDATION DE LA LIPOTOXICITE DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR LES CELLULES MACROPHAGIQUES DE SOURIS (RAW 264.7) ...................................... 61
9.1 EVALUATION DE LA MORTALITE CELLULAIRE INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR UN TEST MTT ...................................................................... 61
9.2 MISE EN EVIDENCE D’INCLUSIONS LIPIDIQUES INTRACELLULAIRES INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR LA COLORATION AU OIL RED O ............. 62
9.3 EFFET DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR L’EXPRESSION DU GENE CODANT POUR L’AMPK-Α1 PAR RT-PCR QUALITATIVE .............................................................................................. 64
9.4 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DE LA FORME ACTIVEE DE L’AMPK (PHOSPHO-AMPK) AINSI QUE LA FORME TOTALE (AMPK) PAR WESTERN BLOT ................................... 65
9.5 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DU RECEPTEUR A LA CHEMERINE (CMKLR1) PAR WESTERN BLOT ..................................................................................................................... 66
DISCUSSION ET PERSPECTIVES .................................................................................... 67
CONCLUSION ....................................................................................................................... 71
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................. 73
ANNEXE ................................................................................................................................. 77Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65675 Validation du rôle cytotoxique de l'acide pamitique sur des cellules myoblastiques et macrophagiques de souris. Investigation d'une nouvelle adipokine, la chémérine [TFE / Mémoire] / BRUNO INFOSINO, Auteur . - 2016.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. .
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale obésité déséquilibre énergétique prédisposition génétique tissu adipeux adipokine culture cellulaire ARN analyse protéique acide palmitique chérémine Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................ 9
CONTEXTE GENERAL ....................................................................................................... 11
1 L’OBESITE ..................................................................................................................... 11
1.1 QUELQUES CHIFFRES .................................................................................................. 11
1.2 QU’EST-CE QUE L’OBESITE ? ....................................................................................... 12
1.3 LES CAUSES ................................................................................................................ 13
1.3.1 Déséquilibre énergétique ....................................................................................... 13
1.3.2 Prédisposition génétique ........................................................................................ 14
1.3.3 L’environnement .................................................................................................... 14
1.4 LES CONSEQUENCES ................................................................................................... 15
2 TISSUS TOUCHES PAR L’OBESITE ........................................................................ 15
2.1 LE TISSU ADIPEUX ....................................................................................................... 16
2.1.1 Le tissu adipeux sain .............................................................................................. 16
2.1.2 Altération du tissu adipeux .................................................................................... 17
2.2 LE MUSCLE ................................................................................................................. 19
3 LES ADIPOKINES ......................................................................................................... 20
OBJECTIFS ET STRATEGIE ............................................................................................. 25
MATERIEL ET METHODES .............................................................................................. 27
4 CULTURE CELLULAIRE ............................................................................................ 27
4.1 MATERIEL .................................................................................................................. 27
4.2 LIGNEES CELLULAIRES ............................................................................................... 27
4.3 DECONGELATION DES CELLULES ................................................................................ 28
4.4 CULTURE DES CELLULES ............................................................................................. 29
4.5 PASSAGE DES CELLULES ............................................................................................. 30
4.6 ENSEMENCEMENT DES CELLULES ............................................................................... 31
4.7 STERILITE ................................................................................................................... 31
4.8 TEST MYCOPLASME .................................................................................................... 32
4.9 PROTOCOLE EXPERIMENTAL : GROUPES ET DOSES DE TRAVAIL................................... 33
4.10 TEST MTT .................................................................................................................. 34
4.11 RECOLTE DES CELLULES ............................................................................................. 34
5 ANALYSE HISTOLOGIQUE ....................................................................................... 35
5.1 MATERIEL .................................................................................................................. 35
5.2 OIL RED O .................................................................................................................. 35
6 ANALYSE ARN .............................................................................................................. 36
6.1 MATERIEL .................................................................................................................. 36
6.2 EXTRACTION ARN ..................................................................................................... 37
6.2.1 Lyse cellulaire ........................................................................................................ 37
6.2.2 Filtration du lysat .................................................................................................. 37
6.2.3 Liaison de l’ARN sur la membrane ........................................................................ 38
6.2.4 Dessalage de la membrane de silice ...................................................................... 38
6.2.5 Digestion de l’ADN ................................................................................................ 38
6.2.6 Lavage et séchage de la membrane de silice ......................................................... 38
6.2.7 Elution de l’ARN total ............................................................................................ 39
6.3 DOSAGE DE L’ARN PAR SPECTROPHOTOMETRIE ........................................................ 39
6.4 RETRO-TRANSCRIPTION .............................................................................................. 39
6.5 ANALYSE PCR............................................................................................................ 40
6.5.1 PCR qualitative ...................................................................................................... 40
6.5.2 PCR quantitative .................................................................................................... 43
7 ANALYSE PROTEIQUE .............................................................................................. 45
7.1 MATERIEL .................................................................................................................. 45
7.2 EXTRACTION PROTEIQUE ............................................................................................ 46
7.3 DOSAGE PROTEIQUE PAR LE TEST BCA (BICINCHONIC ACID ; KIT PIERCE BCA PROTEIN ASSAY (THERMO FISHER SCIENTIFIC)) ................................................................... 46
7.4 PREPARATION DES GELS DE POLYACRYLAMIDE .......................................................... 47
7.5 ELECTROPHORESE ...................................................................................................... 49
7.6 BLOTTING ................................................................................................................... 49
7.7 BLOCAGE .................................................................................................................... 50
7.8 IMMUNODETECTION .................................................................................................... 50
7.9 REVELATION ............................................................................................................... 51
7.10 DENSITOMETRIE ......................................................................................................... 51
7.11 RECYCLAGE DE LA MEMBRANE ................................................................................... 51
RESULTATS .......................................................................................................................... 53
8 EFFET LIPOTOXIQUE DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR LES CELLULES MYOBLASTIQUES DE SOURIS (C2C12) ........................................................................... 54
8.1 EVALUATION DE LA MORTALITE CELLULAIRE INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR UN TEST MTT ...................................................................... 54
8.2 MISE EN EVIDENCE D’INCLUSIONS LIPIDIQUES INTRACELLULAIRES INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR LA COLORATION AU OIL RED O ............. 54
8.3 EFFET DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR L’EXPRESSION DU GENE CODANT POUR L’AMPK-Α1 PAR RT-PCR QUALITATIVE ET QUANTITATIVE ................................................................. 56
8.4 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DE LA FORME ACTIVEE DE L’AMPK (PHOSPHO-AMPK) AINSI QUE LA FORME TOTALE (AMPK) PAR WESTERN BLOT ................................... 58
8.5 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DU RECEPTEUR A LA CHEMERINE (CMKLR1) PAR WESTERN BLOT ..................................................................................................................... 60
9 VALIDATION DE LA LIPOTOXICITE DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR LES CELLULES MACROPHAGIQUES DE SOURIS (RAW 264.7) ...................................... 61
9.1 EVALUATION DE LA MORTALITE CELLULAIRE INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR UN TEST MTT ...................................................................... 61
9.2 MISE EN EVIDENCE D’INCLUSIONS LIPIDIQUES INTRACELLULAIRES INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR LA COLORATION AU OIL RED O ............. 62
9.3 EFFET DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR L’EXPRESSION DU GENE CODANT POUR L’AMPK-Α1 PAR RT-PCR QUALITATIVE .............................................................................................. 64
9.4 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DE LA FORME ACTIVEE DE L’AMPK (PHOSPHO-AMPK) AINSI QUE LA FORME TOTALE (AMPK) PAR WESTERN BLOT ................................... 65
9.5 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DU RECEPTEUR A LA CHEMERINE (CMKLR1) PAR WESTERN BLOT ..................................................................................................................... 66
DISCUSSION ET PERSPECTIVES .................................................................................... 67
CONCLUSION ....................................................................................................................... 71
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................. 73
ANNEXE ................................................................................................................................. 77Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65675 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Mise au point d'un test de croissance cellulaire permettant le criblage de molécules en vue de trouver un inhibiteur de ka résistance à la doxorubicine conférée par la protéine MAGE-A1 aux cellules tumorales mammaires MCF-7 / Martin Lemaire
PermalinkPermalinkLe bal des transformistes. / Philippe Lambert in Athena : Recherche et développement technologique, 291 (Mai 2013)
PermalinkConstruction de vecteurs d expression régulée de la protéine L* du virus de Theiler. / DIMAN Aurélie
PermalinkContribution à la détermination des sites d'initiations de la transcription des gènes Thox1 et 2 et DuoxA1 et 2 dans la thyroïde. / CENZATO Vanessa
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