Centre de Documentation Campus Montignies
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Lundi : 8h-18h30
Mardi : 8h-18h30
Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur des cellules A549 après irradiation par des rayons X. / Christopher Bond
Titre : Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur des cellules A549 après irradiation par des rayons X. Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Christopher Bond, Auteur ; Thierry Arnould, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2022 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : UNamur Laboratoire D’analyse par Reactions Nucleaires (LARN) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le cancer est une maladie connue de notre société et responsable de nombreuses morts. La cause : des mutations au niveau de l’ADN cellulaire menant à une prolifération anarchique et abondante de cellules anormales. Pour traiter ces cellules, des techniques de radiothérapie usant de rayons X ont vu le jour. Une étude récente réalisé par W.Wai-Ying Kam et Richard B. Banati a montré que la pensée initiale dans laquelle les dommages à l’ADN nucléaire était seuls responsables de la mort cellulaire suivant une irradiation ionisante n’était pas tout à fait juste. En effet, dans les cellules existent des organites appelés mitochondries, qui interviennent dans la survie cellulaire. Il est possible que des dommages au niveau de l’ADN mitochondrial ou de la structure de la mitochondrie provoquent l’augmentation de stress oxydatif risquant d’initier la mort cellulaire. Afin de préserver l’intégrité des organites, les mitochondries mettent en place divers mécanismes de biogenèse pour reformer de nouvelles mitochondries et de dégradation pour remplacer celles qui ont été endommagées.
L’objectif de ce travail de fin d’étude s’intègre dans un projet portant sur l’étude du mécanisme de mitophagie et de biogenèse mitochondriale après irradiation par des protons sur des cellules cancéreuses. Dans ce contexte, la mitophagie agirait comme un processus cyto-protecteur et empêcherait le relargage de molécules sources de dommages à la cellule, provenant des mitochondries abimées. Une stratégie de traitement pourrait être d’inhiber la mitophagie dans les cellules cancéreuses de manière à accroitre la mortalité des cellules.
Ce TFE aura pour but la mise en place de protocoles expérimentaux explorant l’autophagie, à l’aide de marqueurs spécifiques tels que LC3-I/II et p62, et l’abondance mitochondriale via le marquage de TOM20 et du complexe OXPHOS présents sur les membranes de la mitochondrie, ainsi que par une quantification d’ADN mitochondrial par qPCR. L’ensemble des manipulations sera réalisé sur des cellules cancéreuses A549 au cours du temps et après exposition à des rayons X, plus adaptés pour des mises au point rapides. Les résultats obtenus ont montré qu’il existait un possible lien entre l’impact des rayons X et l’augmentation du nombre d’autophagosomes dans les cellules au cours du temps. Toutefois, la manipulation a révélé la présence d’autophagie basale dans les cellules non-traitées, rendant l’analyse d’une tendance sur l’autophagie délicate. Les autres résultats portant sur l’abondance mitochondriale, basés sur deux manipulations distinctes, montrent une discordance. D’une part l’impact des rayons X semble entraîner une diminution de l’abondance de TOM20 et du complexe OXPHOS dans les premières 24H suivant le traitement et d’’autre part, on observe une tendance opposée avec une augmentation de la quantité d’ADN mitochondrial dans les cellules. Deux hypothèses sont possibles pour expliquer cet évènement. Premièrement, on suppose que ce phénomène repose sur les timings, supposés différents, entre la synthèse d’ADN mitochondrial et celle de la membrane mitochondriale. La deuxième hypothèse suggère que le mécanisme de biogenèse est incomplet et que la réparation des dommages causés par les radiations ne reposerait que sur la synthèse de l’ADN mitochondrial.Note de contenu : 3
TABLE DES MATIERES
1 Présentation du lieu de stage................................................................................................................................... 1
1.1 L’Université de Namur- L’UNAMUR ................................................................................................................ 1
1.2 Laboratoire d’Analyse par Réactions Nucléaires (LARN) ................................................................................ 1
1.3 Unité de Recherche en Biologie Cellulaire animale (URBC) ........................................................................... 1
2 Contexte général ..................................................................................................................................................... 3
2.1 Le cancer - généralités .................................................................................................................................... 3
2.2 Epidémiologie ................................................................................................................................................. 6
2.3 Traitements et prophylaxie ............................................................................................................................ 7
2.4 les différentes formes de radiothérapie ......................................................................................................... 8
2.5 Rayons X........................................................................................................................................................ 10
2.5.1 Les photons et leurs interactions avec la matière ................................................................................ 10
2.5.2 Production de rayons X ......................................................................................................................... 11
2.5.3 Impact des rayons X sur la matière ...................................................................................................... 12
2.6 Conséquence d’une irradiation sur une cellule ............................................................................................ 13
2.6.1 Phase physique ..................................................................................................................................... 14
2.6.2 Phase chimique ..................................................................................................................................... 14
2.6.3 Phase biologique ................................................................................................................................... 16
2.7 Mort cellulaire .............................................................................................................................................. 17
2.7.1 Autophagie ........................................................................................................................................... 17
2.8 La mitochondrie ............................................................................................................................................ 20
2.8.1 Origine et structure .............................................................................................................................. 20
2.8.2 Les mécanismes de contrôle mis en place par la mitochondrie ........................................................... 23
2.9 Etude ayant déjà traité des effets de rayons x sur l’abondance mitochondriale ......................................... 26
3 objectifs et stratégie .............................................................................................................................................. 28
4 matériel et méthodes ............................................................................................................................................. 29
I. CHAPITRE 1 : PRODUCTION ET IRRADIATION DES CELLULES A549 .................................................................. 29
II. CHAPITRE 2 : extraction et détermination de la concentration en protéines .................................................. 33
III. CHAPITRE 3 : quantification de la protéine d’intérêt par Western blot ....................................................... 35
Préparation des gels pour l’électrophorèse ............................................................................................................ 36
Préparation des échantillons pour l’électrophorèse .............................................................................................. 37
Migration des protéines sur gel ............................................................................................................................... 37
Transfert humide des protéines sur membrane solide .......................................................................................... 38
4
IV. CHAPITRE 4 : rapport de la quantité ADNmt sur ADNn par une quantitative polymérase chain réaction
(qPCR) 41
5 Résultats et discussion .......................................................................................................................................... 46
5.1 Mise en place des conditions expérimentales pour les manipulations western blot .................................. 46
5.1.1 Résultats de la mise au point des conditions expérimentales ........................................................... 47
5.2 Détermination des conditions optimales (Dose et timing) pour une signature d’autophagie/mitophagie. 50
.................................................................................................................................................................................. 53
5.3 Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur cellules A549 avec marquage de TOM20 et OXPHOS sur
Western Blot ............................................................................................................................................................. 54
5.4 Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur cellules A549 avec rapport ADNmt sur ADNn par qPCR.
57
6 Conclusion et perspective..................................................................................................................................... 61
7 Liste des abréviations ........................................................................................................................................... 63
8 Bibliographie ......................................................................................................................................................... 67
9 ANNEXE ................................................................................................................................................................. 70
10 Résumé ................................................................................................................................................................. 81
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105746 Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur des cellules A549 après irradiation par des rayons X. [TFE / Mémoire] / Christopher Bond, Auteur ; Thierry Arnould, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2022.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur
Langues : Français (fre)
Mots-clés : UNamur Laboratoire D’analyse par Reactions Nucleaires (LARN) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le cancer est une maladie connue de notre société et responsable de nombreuses morts. La cause : des mutations au niveau de l’ADN cellulaire menant à une prolifération anarchique et abondante de cellules anormales. Pour traiter ces cellules, des techniques de radiothérapie usant de rayons X ont vu le jour. Une étude récente réalisé par W.Wai-Ying Kam et Richard B. Banati a montré que la pensée initiale dans laquelle les dommages à l’ADN nucléaire était seuls responsables de la mort cellulaire suivant une irradiation ionisante n’était pas tout à fait juste. En effet, dans les cellules existent des organites appelés mitochondries, qui interviennent dans la survie cellulaire. Il est possible que des dommages au niveau de l’ADN mitochondrial ou de la structure de la mitochondrie provoquent l’augmentation de stress oxydatif risquant d’initier la mort cellulaire. Afin de préserver l’intégrité des organites, les mitochondries mettent en place divers mécanismes de biogenèse pour reformer de nouvelles mitochondries et de dégradation pour remplacer celles qui ont été endommagées.
L’objectif de ce travail de fin d’étude s’intègre dans un projet portant sur l’étude du mécanisme de mitophagie et de biogenèse mitochondriale après irradiation par des protons sur des cellules cancéreuses. Dans ce contexte, la mitophagie agirait comme un processus cyto-protecteur et empêcherait le relargage de molécules sources de dommages à la cellule, provenant des mitochondries abimées. Une stratégie de traitement pourrait être d’inhiber la mitophagie dans les cellules cancéreuses de manière à accroitre la mortalité des cellules.
Ce TFE aura pour but la mise en place de protocoles expérimentaux explorant l’autophagie, à l’aide de marqueurs spécifiques tels que LC3-I/II et p62, et l’abondance mitochondriale via le marquage de TOM20 et du complexe OXPHOS présents sur les membranes de la mitochondrie, ainsi que par une quantification d’ADN mitochondrial par qPCR. L’ensemble des manipulations sera réalisé sur des cellules cancéreuses A549 au cours du temps et après exposition à des rayons X, plus adaptés pour des mises au point rapides. Les résultats obtenus ont montré qu’il existait un possible lien entre l’impact des rayons X et l’augmentation du nombre d’autophagosomes dans les cellules au cours du temps. Toutefois, la manipulation a révélé la présence d’autophagie basale dans les cellules non-traitées, rendant l’analyse d’une tendance sur l’autophagie délicate. Les autres résultats portant sur l’abondance mitochondriale, basés sur deux manipulations distinctes, montrent une discordance. D’une part l’impact des rayons X semble entraîner une diminution de l’abondance de TOM20 et du complexe OXPHOS dans les premières 24H suivant le traitement et d’’autre part, on observe une tendance opposée avec une augmentation de la quantité d’ADN mitochondrial dans les cellules. Deux hypothèses sont possibles pour expliquer cet évènement. Premièrement, on suppose que ce phénomène repose sur les timings, supposés différents, entre la synthèse d’ADN mitochondrial et celle de la membrane mitochondriale. La deuxième hypothèse suggère que le mécanisme de biogenèse est incomplet et que la réparation des dommages causés par les radiations ne reposerait que sur la synthèse de l’ADN mitochondrial.Note de contenu : 3
TABLE DES MATIERES
1 Présentation du lieu de stage................................................................................................................................... 1
1.1 L’Université de Namur- L’UNAMUR ................................................................................................................ 1
1.2 Laboratoire d’Analyse par Réactions Nucléaires (LARN) ................................................................................ 1
1.3 Unité de Recherche en Biologie Cellulaire animale (URBC) ........................................................................... 1
2 Contexte général ..................................................................................................................................................... 3
2.1 Le cancer - généralités .................................................................................................................................... 3
2.2 Epidémiologie ................................................................................................................................................. 6
2.3 Traitements et prophylaxie ............................................................................................................................ 7
2.4 les différentes formes de radiothérapie ......................................................................................................... 8
2.5 Rayons X........................................................................................................................................................ 10
2.5.1 Les photons et leurs interactions avec la matière ................................................................................ 10
2.5.2 Production de rayons X ......................................................................................................................... 11
2.5.3 Impact des rayons X sur la matière ...................................................................................................... 12
2.6 Conséquence d’une irradiation sur une cellule ............................................................................................ 13
2.6.1 Phase physique ..................................................................................................................................... 14
2.6.2 Phase chimique ..................................................................................................................................... 14
2.6.3 Phase biologique ................................................................................................................................... 16
2.7 Mort cellulaire .............................................................................................................................................. 17
2.7.1 Autophagie ........................................................................................................................................... 17
2.8 La mitochondrie ............................................................................................................................................ 20
2.8.1 Origine et structure .............................................................................................................................. 20
2.8.2 Les mécanismes de contrôle mis en place par la mitochondrie ........................................................... 23
2.9 Etude ayant déjà traité des effets de rayons x sur l’abondance mitochondriale ......................................... 26
3 objectifs et stratégie .............................................................................................................................................. 28
4 matériel et méthodes ............................................................................................................................................. 29
I. CHAPITRE 1 : PRODUCTION ET IRRADIATION DES CELLULES A549 .................................................................. 29
II. CHAPITRE 2 : extraction et détermination de la concentration en protéines .................................................. 33
III. CHAPITRE 3 : quantification de la protéine d’intérêt par Western blot ....................................................... 35
Préparation des gels pour l’électrophorèse ............................................................................................................ 36
Préparation des échantillons pour l’électrophorèse .............................................................................................. 37
Migration des protéines sur gel ............................................................................................................................... 37
Transfert humide des protéines sur membrane solide .......................................................................................... 38
4
IV. CHAPITRE 4 : rapport de la quantité ADNmt sur ADNn par une quantitative polymérase chain réaction
(qPCR) 41
5 Résultats et discussion .......................................................................................................................................... 46
5.1 Mise en place des conditions expérimentales pour les manipulations western blot .................................. 46
5.1.1 Résultats de la mise au point des conditions expérimentales ........................................................... 47
5.2 Détermination des conditions optimales (Dose et timing) pour une signature d’autophagie/mitophagie. 50
.................................................................................................................................................................................. 53
5.3 Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur cellules A549 avec marquage de TOM20 et OXPHOS sur
Western Blot ............................................................................................................................................................. 54
5.4 Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur cellules A549 avec rapport ADNmt sur ADNn par qPCR.
57
6 Conclusion et perspective..................................................................................................................................... 61
7 Liste des abréviations ........................................................................................................................................... 63
8 Bibliographie ......................................................................................................................................................... 67
9 ANNEXE ................................................................................................................................................................. 70
10 Résumé ................................................................................................................................................................. 81
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Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Recherche de nouveaux inhibiteurs de la phosphosérine phosphatase (SerB2) - étude des interactions de petites molécules sur l’activité et l’inhibition de SerB2 par DSF et tests enzymatiques / Simon Cheval
Titre : Recherche de nouveaux inhibiteurs de la phosphosérine phosphatase (SerB2) - étude des interactions de petites molécules sur l’activité et l’inhibition de SerB2 par DSF et tests enzymatiques Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Simon Cheval, Auteur ; Jérôme Cornil, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Unamur laboratoire de Chimie Biologique Structurale CBS Tuberculose SerB2 Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La tuberculose, une maladie infectieuse causée par une bactérie, Mycobacterium tuberculosis, est devenue un problème de santé mondiale, notamment suite à l’apparition de souches résistantes aux traitements actuels. Afin de lutter contre cette maladie, le développement de nouveaux antibiotiques et donc la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques sont fortement encouragés. Une de ces cibles thérapeutiques déjà identifiée est la voie de la sérine, une voie essentielle à la survie du pathogène.
Ce travail s’intègre dans ces recherches pour lutter contre la tuberculose en s’intéressant plus particulièrement à une enzyme de la voie de la sérine, SerB2. Selon des études précédentes, cette enzyme s’avère non seulement essentielle à la survie de la bactérie mais aussi à sa virulence dans l’organisme de son hôte. Une de ces recherches étudiant la structure de SerB2 montre la présence d’un site actif liés à deux domaines ACT régulateurs. Cette observation laisse espérer la possibilité d’inhiber cette enzyme via ces deux domaines dans le but de développer un nouveau pharmacophore (modèle de conception d’un médicament). L’objectif principal de ce TFE est donc la recherche d’inhibiteurs potentiels de SerB2 en ciblant les deux domaines ACT de l’enzyme. Cette recherche se fera à partir d’un panel d’acides aminés
et par l’intermédiaire de test DSF et enzymatiques. Il faudra produire l’enzyme, optimiser les conditions des différents tests et réaliser des screening de l’enzyme avec les acides aminés. Les domaines ciblés permettront-ils de mettre en évidence des acides aminés avec une haute interaction/inhibition de l’enzyme ? Est-ce que l’inhibition de SerB2 par des acides aminés est une piste exploitable dans la lutte contre la tuberculose ? De nombreuses perspectives sont
encore à envisager ...Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
Remerciements.............................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ...................................................................................................... 9
Chapitre I. L’université de Namur – l’Unamur .................................................................. 9
Chapitre II. Le laboratoire de Chimie Biologique Structurale – le CBS.......................... 9
I. Contexte général............................................................................................................... 10
Chapitre I. La tuberculose................................................................................................. 10
Introduction ............................................................................................................... 10
La pathologie ............................................................................................................. 10
L’agent infectieux - M. tuberculosis.......................................................................... 11
Problématique actuelle – traitement de la tuberculose et apparition de souches
résistantes ......................................................................................................................... 12
Chapitre II. Nouvelles pistes de lutte thérapeutique – la voie de la sérine..................... 13
Identification de la voie de la sérine en tant que cible thérapeutique ........................ 13
Description de la voie de la sérine............................................................................. 13
Chapitre III. Recherches préliminaires sur SerB2, une bonne cible thérapeuthique ? .... 14
SerB2, un facteur de virulence .................................................................................. 14
Structure et fonction de SerB2................................................................................... 15
Inhibiteurs connus de SerB2...................................................................................... 16
II. Objectifs et stratégie......................................................................................................... 18
III. Matériel et méthodes ..................................................................................................... 20
Chapitre I. Production, purification et caractérisation de SerB2 ...................................... 20
Etape préliminaire – préparation de différents tampons............................................ 20
Production (surexpression) de SerB2 His6 ................................................................ 20
Purification par chromatographie d’affinité IMAC, dialyse et clivage du His-tag ... 23
Caractérisation de la purification par électrophorèse SDS-PAGE et dosage au nano
drop................................................................................................................................... 24
Stockage et passage sur colonne PD10...................................................................... 26
Chapitre II. Mise au point des conditions pour test DSF et screening de 30 acides aminés
..................................................................................................................... 27
Mise au point du test DSF de SerB2 avec 10 acides aminés ..................................... 28
Screening des 30 acides aminés................................................................................. 29
Chapitre III. Mise au point des conditions pour test phosphatase et screening des ligands
sélectionnés avec SerB2 ....................................................................................................... 29
Détermination de la concentration en acide aminé.................................................... 30
Screening des acides aminés...................................................................................... 30
Chapitre IV. essais de cristallogenèse sur SerB2............................................................. 31
Recherche des conditions de cristallisation ............................................................... 32
Reproduction et optimisation des cristaux................................................................. 32
Analyse cristallographique ........................................................................................ 32
IV. Résultats et discussion................................................................................................... 33
Chapitre I. Surexpression et purification de SerB2 .......................................................... 33
Conclusion intermédiaire........................................................................................... 36
Chapitre II. DSF – optimisation et résultats du screening.............................................. 37
Condition 1 : choix du tampon et du colorant ........................................................... 38
Condition 2 : optimisation de la concentration en enzyme ....................................... 40
Condition 3 : optimisation de la concentration du colorant Syp Orange................... 41
Condition 4 : optimisation de la concentration en acide aminé................................. 42
Conclusion intermédiaire et résumé des conditions sélectionnées ............................ 43
Screening des acides aminés par DSF ....................................................................... 44
Chapitre III. Test phosphatase – optimisation et screening ............................................. 45
Optimisation du test phosphatase .............................................................................. 45
Screening des 30 acides aminés par test phosphatase ............................................... 46
Conclusions intermédiaires........................................................................................ 47
Chapitre IV. Cristallogenèse ............................................................................................ 48
1ère tentative d’obtention de cristaux ......................................................................... 48
Optimisation des conditions de cristallisation ........................................................... 49
Analyse cristallographique ........................................................................................ 49
Conclusions générales et perspectives ..................................................................................... 50
Bibliographie............................................................................................................................ 52
Annexes ........................................................................................................................................
Annexe 1 – kit cbs screen md1-104 .........................................................................................
Annexe 2 – protocole du test phosphatase ...............................................................................
Annexe 3 – Screening DSF des différents acides aminés à une concentration de 100 μM .....
Annexe 4 – conditions d’optimisation de cristallisation ..........................................................
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100296 Recherche de nouveaux inhibiteurs de la phosphosérine phosphatase (SerB2) - étude des interactions de petites molécules sur l’activité et l’inhibition de SerB2 par DSF et tests enzymatiques [TFE / Mémoire] / Simon Cheval, Auteur ; Jérôme Cornil, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur
Langues : Français (fre)
Mots-clés : Unamur laboratoire de Chimie Biologique Structurale CBS Tuberculose SerB2 Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La tuberculose, une maladie infectieuse causée par une bactérie, Mycobacterium tuberculosis, est devenue un problème de santé mondiale, notamment suite à l’apparition de souches résistantes aux traitements actuels. Afin de lutter contre cette maladie, le développement de nouveaux antibiotiques et donc la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques sont fortement encouragés. Une de ces cibles thérapeutiques déjà identifiée est la voie de la sérine, une voie essentielle à la survie du pathogène.
Ce travail s’intègre dans ces recherches pour lutter contre la tuberculose en s’intéressant plus particulièrement à une enzyme de la voie de la sérine, SerB2. Selon des études précédentes, cette enzyme s’avère non seulement essentielle à la survie de la bactérie mais aussi à sa virulence dans l’organisme de son hôte. Une de ces recherches étudiant la structure de SerB2 montre la présence d’un site actif liés à deux domaines ACT régulateurs. Cette observation laisse espérer la possibilité d’inhiber cette enzyme via ces deux domaines dans le but de développer un nouveau pharmacophore (modèle de conception d’un médicament). L’objectif principal de ce TFE est donc la recherche d’inhibiteurs potentiels de SerB2 en ciblant les deux domaines ACT de l’enzyme. Cette recherche se fera à partir d’un panel d’acides aminés
et par l’intermédiaire de test DSF et enzymatiques. Il faudra produire l’enzyme, optimiser les conditions des différents tests et réaliser des screening de l’enzyme avec les acides aminés. Les domaines ciblés permettront-ils de mettre en évidence des acides aminés avec une haute interaction/inhibition de l’enzyme ? Est-ce que l’inhibition de SerB2 par des acides aminés est une piste exploitable dans la lutte contre la tuberculose ? De nombreuses perspectives sont
encore à envisager ...Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
Remerciements.............................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ...................................................................................................... 9
Chapitre I. L’université de Namur – l’Unamur .................................................................. 9
Chapitre II. Le laboratoire de Chimie Biologique Structurale – le CBS.......................... 9
I. Contexte général............................................................................................................... 10
Chapitre I. La tuberculose................................................................................................. 10
Introduction ............................................................................................................... 10
La pathologie ............................................................................................................. 10
L’agent infectieux - M. tuberculosis.......................................................................... 11
Problématique actuelle – traitement de la tuberculose et apparition de souches
résistantes ......................................................................................................................... 12
Chapitre II. Nouvelles pistes de lutte thérapeutique – la voie de la sérine..................... 13
Identification de la voie de la sérine en tant que cible thérapeutique ........................ 13
Description de la voie de la sérine............................................................................. 13
Chapitre III. Recherches préliminaires sur SerB2, une bonne cible thérapeuthique ? .... 14
SerB2, un facteur de virulence .................................................................................. 14
Structure et fonction de SerB2................................................................................... 15
Inhibiteurs connus de SerB2...................................................................................... 16
II. Objectifs et stratégie......................................................................................................... 18
III. Matériel et méthodes ..................................................................................................... 20
Chapitre I. Production, purification et caractérisation de SerB2 ...................................... 20
Etape préliminaire – préparation de différents tampons............................................ 20
Production (surexpression) de SerB2 His6 ................................................................ 20
Purification par chromatographie d’affinité IMAC, dialyse et clivage du His-tag ... 23
Caractérisation de la purification par électrophorèse SDS-PAGE et dosage au nano
drop................................................................................................................................... 24
Stockage et passage sur colonne PD10...................................................................... 26
Chapitre II. Mise au point des conditions pour test DSF et screening de 30 acides aminés
..................................................................................................................... 27
Mise au point du test DSF de SerB2 avec 10 acides aminés ..................................... 28
Screening des 30 acides aminés................................................................................. 29
Chapitre III. Mise au point des conditions pour test phosphatase et screening des ligands
sélectionnés avec SerB2 ....................................................................................................... 29
Détermination de la concentration en acide aminé.................................................... 30
Screening des acides aminés...................................................................................... 30
Chapitre IV. essais de cristallogenèse sur SerB2............................................................. 31
Recherche des conditions de cristallisation ............................................................... 32
Reproduction et optimisation des cristaux................................................................. 32
Analyse cristallographique ........................................................................................ 32
IV. Résultats et discussion................................................................................................... 33
Chapitre I. Surexpression et purification de SerB2 .......................................................... 33
Conclusion intermédiaire........................................................................................... 36
Chapitre II. DSF – optimisation et résultats du screening.............................................. 37
Condition 1 : choix du tampon et du colorant ........................................................... 38
Condition 2 : optimisation de la concentration en enzyme ....................................... 40
Condition 3 : optimisation de la concentration du colorant Syp Orange................... 41
Condition 4 : optimisation de la concentration en acide aminé................................. 42
Conclusion intermédiaire et résumé des conditions sélectionnées ............................ 43
Screening des acides aminés par DSF ....................................................................... 44
Chapitre III. Test phosphatase – optimisation et screening ............................................. 45
Optimisation du test phosphatase .............................................................................. 45
Screening des 30 acides aminés par test phosphatase ............................................... 46
Conclusions intermédiaires........................................................................................ 47
Chapitre IV. Cristallogenèse ............................................................................................ 48
1ère tentative d’obtention de cristaux ......................................................................... 48
Optimisation des conditions de cristallisation ........................................................... 49
Analyse cristallographique ........................................................................................ 49
Conclusions générales et perspectives ..................................................................................... 50
Bibliographie............................................................................................................................ 52
Annexes ........................................................................................................................................
Annexe 1 – kit cbs screen md1-104 .........................................................................................
Annexe 2 – protocole du test phosphatase ...............................................................................
Annexe 3 – Screening DSF des différents acides aminés à une concentration de 100 μM .....
Annexe 4 – conditions d’optimisation de cristallisation ..........................................................
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100296 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etude des effets du miel sur les mécanismes autophagiques des macrophages / Robin Varsebroucq
Titre : Etude des effets du miel sur les mécanismes autophagiques des macrophages Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Robin Varsebroucq, Auteur ; Véronique Vallery, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le miel est utilisé depuis des milliers d’années dans de nombreuses cultures et est connu pour ses propriétés antibactériennes, anti-inflammatoires et immunomodulatrices. Une recherche précédente a permis de mettre en évidence l’effet du miel Revamil sur l’abondance de protéines autophagiques des macrophages. En effet, les résultats ont montré une augmentation des protéines LC3-II et p62 en présence de Revamil ainsi qu’une phosphorylation du complexe mTOR. L’autophagie désigne le mécanisme par lequel la cellule est capable de dégrader ses éléments cytoplasmiques n’étant plus nécessaire pour produire de nouvelles protéines. Ceci se réalise par l’intermédiaire de ses autophagosomes et lysosomes.
L’objectif de ce travail est de caractériser les mécanismes par lesquels le miel Revamil module la phosphorylation de mTOR et le flux autophagique et de comparer les effets du Revamil aux effets potentiels d’autres miels tels que des miels artisanaux fabriqués à différentes périodes (printemps et été) et du miel Manuka. Cette comparaison, des effets de différents miels a, dans un premier temps, été réalisée par analyse d’abondance protéique des marqueurs de l’autophagie et de kinases/enzymes clés de sa régulation.
Cet objectif est mené en parallèle avec une étude portant sur la recherche du (ou des) composant(s) présent(s) dans le miel potentiellement responsable(s) des effets observés sur l’autophagie.
Cette recherche a permis de montrer une différence de l’augmentation de l’abondance des protéines LC3-II et p62 en fonction du miel utilisé. La composition ainsi que la période de récolte du miel influenceraient cet effet. Deux miels artisanaux ont montré des profils complétement différents et les miels médicaux alors que le Revamil et le Manuka montrent des effets relativement similaires.
Les résultats montrent une augmentation de l’abondance des protéines LC3-II et p62 pour les conditions Revamil, Manuka et miel d’été par rapport à la condition « Sugar Mix » contrairement au miel de printemps qui se comporte comme la condition « Sugar Mix ».
Ceci pourrait être expliqué par deux hypothèses. En effet, soit il pourrait s’agir d’une stimulation de l’initiation de l’autophagie et donc une accumulation de la production d’autophagosomes, soit il pourrait s’agir d’une inhibition de l’exécution de l’autophagie, c’est-à-dire l’étape de fusion de l’autophagosome avec le lysosome. Cette inhibition empêcherait ainsi la dégradation des autophagosomes, entrainant leur accumulation, ce qui expliquerait pourquoi les protéines LC3-II et p62 voient augmenter leurs abondances. Ces résultats montrent également que la composition du miel ainsi que la période de récolte influencent les effets de ce dernier sur l’abondance des protéines LC3-II et p62.
Une recherche postérieure devrait permettre de mettre en évidence par quelle voie, cette augmentation protéique est-elle induite et de continuer la recherche du (ou des) composant(s) présent(s) dans le miel potentiellement responsable(s) des effets observés sur l’autophagie.Note de contenu : Table des matières
Introduction générale ....................................................................................................................................... 7
I. Contexte général ........................................................................................................................................... 9
1. Le miel .................................................................................................................................................................. 10
1.1 Composition du miel....................................................................................................................................... 10
1.2 Propriétés du miel ........................................................................................................................................... 11
2. Autophagie ............................................................................................................................................................ 16
2.1 Définition autophagie ..................................................................................................................................... 16
2.2 Mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant à la formation de l’autophagosome ............................... 17
2.3 Régulation de la réponse autophagique .......................................................................................................... 19
II. Objectifs et stratégie .................................................................................................................................. 26
III. Matériel et méthodes ................................................................................................................................ 28
1.Matériel .................................................................................................................................................................. 29
1.1 Cellules RAW 264.7 ....................................................................................................................................... 29
1.2 Cultures des RAW264.7 ................................................................................................................................. 29
1.3 Miel Revamil .................................................................................................................................................. 29
1.4 Miel Manuka ................................................................................................................................................... 30
1.5 Miels artisanaux .............................................................................................................................................. 30
2. Méthodes .............................................................................................................................................................. 31
2.1 Lysats cellulaires ............................................................................................................................................ 31
2.2 Dosage protéique par la méthode de Pierce 660 ............................................................................................. 33
2.3 Western blot en immunofluorescence............................................................................................................. 34
2.4 Quantification ................................................................................................................................................. 38
2.5 Analyse Statistique ......................................................................................................................................... 38
2.6 Analyse d’expression de gènes au niveau du transcrit-RT-qPCR .................................................................. 38
IV. Résultats et Discussion ............................................................................................................................ 41
1.Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de LC3-II et de p62 ................................................ 42
1.1 Etude de LC3-II ............................................................................................................................................. 44
1.2 Etude de p62 ................................................................................................................................................... 46
1.3 Etude de la voie de régulation de l’autophagie mTOR dépendante ................................................................ 48
2. Etude des effets du tréhalose sur l’abondance de protéines autophagiques LC3-II et p62. .................................. 50
2.1 Etude de LC3-II .............................................................................................................................................. 52
2.2 Etude de p62 ................................................................................................................................................... 52
Conclusion ..................................................................................................................................................... 53
Liste des abréviations .................................................................................................................................... 57
Table des figures ............................................................................................................................................ 60
Bibliographie ................................................................................................................................................. 62Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=80004 Etude des effets du miel sur les mécanismes autophagiques des macrophages [TFE / Mémoire] / Robin Varsebroucq, Auteur ; Véronique Vallery, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le miel est utilisé depuis des milliers d’années dans de nombreuses cultures et est connu pour ses propriétés antibactériennes, anti-inflammatoires et immunomodulatrices. Une recherche précédente a permis de mettre en évidence l’effet du miel Revamil sur l’abondance de protéines autophagiques des macrophages. En effet, les résultats ont montré une augmentation des protéines LC3-II et p62 en présence de Revamil ainsi qu’une phosphorylation du complexe mTOR. L’autophagie désigne le mécanisme par lequel la cellule est capable de dégrader ses éléments cytoplasmiques n’étant plus nécessaire pour produire de nouvelles protéines. Ceci se réalise par l’intermédiaire de ses autophagosomes et lysosomes.
L’objectif de ce travail est de caractériser les mécanismes par lesquels le miel Revamil module la phosphorylation de mTOR et le flux autophagique et de comparer les effets du Revamil aux effets potentiels d’autres miels tels que des miels artisanaux fabriqués à différentes périodes (printemps et été) et du miel Manuka. Cette comparaison, des effets de différents miels a, dans un premier temps, été réalisée par analyse d’abondance protéique des marqueurs de l’autophagie et de kinases/enzymes clés de sa régulation.
Cet objectif est mené en parallèle avec une étude portant sur la recherche du (ou des) composant(s) présent(s) dans le miel potentiellement responsable(s) des effets observés sur l’autophagie.
Cette recherche a permis de montrer une différence de l’augmentation de l’abondance des protéines LC3-II et p62 en fonction du miel utilisé. La composition ainsi que la période de récolte du miel influenceraient cet effet. Deux miels artisanaux ont montré des profils complétement différents et les miels médicaux alors que le Revamil et le Manuka montrent des effets relativement similaires.
Les résultats montrent une augmentation de l’abondance des protéines LC3-II et p62 pour les conditions Revamil, Manuka et miel d’été par rapport à la condition « Sugar Mix » contrairement au miel de printemps qui se comporte comme la condition « Sugar Mix ».
Ceci pourrait être expliqué par deux hypothèses. En effet, soit il pourrait s’agir d’une stimulation de l’initiation de l’autophagie et donc une accumulation de la production d’autophagosomes, soit il pourrait s’agir d’une inhibition de l’exécution de l’autophagie, c’est-à-dire l’étape de fusion de l’autophagosome avec le lysosome. Cette inhibition empêcherait ainsi la dégradation des autophagosomes, entrainant leur accumulation, ce qui expliquerait pourquoi les protéines LC3-II et p62 voient augmenter leurs abondances. Ces résultats montrent également que la composition du miel ainsi que la période de récolte influencent les effets de ce dernier sur l’abondance des protéines LC3-II et p62.
Une recherche postérieure devrait permettre de mettre en évidence par quelle voie, cette augmentation protéique est-elle induite et de continuer la recherche du (ou des) composant(s) présent(s) dans le miel potentiellement responsable(s) des effets observés sur l’autophagie.Note de contenu : Table des matières
Introduction générale ....................................................................................................................................... 7
I. Contexte général ........................................................................................................................................... 9
1. Le miel .................................................................................................................................................................. 10
1.1 Composition du miel....................................................................................................................................... 10
1.2 Propriétés du miel ........................................................................................................................................... 11
2. Autophagie ............................................................................................................................................................ 16
2.1 Définition autophagie ..................................................................................................................................... 16
2.2 Mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant à la formation de l’autophagosome ............................... 17
2.3 Régulation de la réponse autophagique .......................................................................................................... 19
II. Objectifs et stratégie .................................................................................................................................. 26
III. Matériel et méthodes ................................................................................................................................ 28
1.Matériel .................................................................................................................................................................. 29
1.1 Cellules RAW 264.7 ....................................................................................................................................... 29
1.2 Cultures des RAW264.7 ................................................................................................................................. 29
1.3 Miel Revamil .................................................................................................................................................. 29
1.4 Miel Manuka ................................................................................................................................................... 30
1.5 Miels artisanaux .............................................................................................................................................. 30
2. Méthodes .............................................................................................................................................................. 31
2.1 Lysats cellulaires ............................................................................................................................................ 31
2.2 Dosage protéique par la méthode de Pierce 660 ............................................................................................. 33
2.3 Western blot en immunofluorescence............................................................................................................. 34
2.4 Quantification ................................................................................................................................................. 38
2.5 Analyse Statistique ......................................................................................................................................... 38
2.6 Analyse d’expression de gènes au niveau du transcrit-RT-qPCR .................................................................. 38
IV. Résultats et Discussion ............................................................................................................................ 41
1.Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de LC3-II et de p62 ................................................ 42
1.1 Etude de LC3-II ............................................................................................................................................. 44
1.2 Etude de p62 ................................................................................................................................................... 46
1.3 Etude de la voie de régulation de l’autophagie mTOR dépendante ................................................................ 48
2. Etude des effets du tréhalose sur l’abondance de protéines autophagiques LC3-II et p62. .................................. 50
2.1 Etude de LC3-II .............................................................................................................................................. 52
2.2 Etude de p62 ................................................................................................................................................... 52
Conclusion ..................................................................................................................................................... 53
Liste des abréviations .................................................................................................................................... 57
Table des figures ............................................................................................................................................ 60
Bibliographie ................................................................................................................................................. 62Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=80004 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etude des effets de miels sur l’autophagie des macrophages / Julie George
Titre : Etude des effets de miels sur l’autophagie des macrophages Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Julie George, Auteur ; Gaëtane Maernoudt, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les propriétés curatives du miel sont connues depuis l’Antiquité et sont démontrées par des études contemporaines. En effet, le miel est connu depuis des décennies comme étant un remède naturel. Ses effets anti-inflammatoire, antibactériens et immunomodulatrices ne sont plus à prouver tant le nombre de recherches est important. Une recherche précédente a permis de mettre en évidence l’effet du miel artisanal d’été, des miels dont les propriétés curatives sont connues le Manuka et le Revamil sur l’abondance de protéines autophagiques des macrophages. En effet, les résultats ont montré une augmentation des protéines LC3-II et p62 en leur présence ainsi qu’une phosphorylation du complexe mTOR. L’autophagie désigne le mécanisme par lequel la cellule est capable de dégrader ses propres éléments cytoplasmiques n’étant plus nécessaire pour produire de nouvelles protéines. Ceci se réalise par l’intermédiaire de ses autophagosomes et lysosomes. L’objectif de ce travail de fin d’étude sera de confirmer l’augmentation de l’abondance des protéines autophagiques p62 dans les cellules RAW264.7 en présence du miel d’été, du Manuka et du Revamil. Il s’agira également de confirmer la diminution de l’abondance de la protéine TFEB qui est un marqueur majeur de l’autophagie dans ces 3 miels. L’objectif sera aussi de connaitre par quels mécanismes moléculaires et cellulaires ainsi que de quelle façon ces phénomènes se produisent et régulent l’autophagie. Dans le cadre de mon TFE, l’objectif principal est de connaitre et comprendre l’effet des différents miels sur les mécanismes d’autophagie des cellules macrophages. Pour se faire, on va s’intéresser principalement sur le facteur de transcription TFEB. Cette comparaison, des effets de différents miels a, dans un premier temps, été réalisée par analyse d’abondance protéique des marqueurs de l’autophagie et de kinases/enzymes clés de sa régulation. Cette recherche a permis de montrer une différence de l’augmentation de l’abondance des protéines p62 et TFEB en fonction du miel utilisé. La composition ainsi que la période de récolte du miel influenceraient cet effet. Deux miels artisanaux ont montré des profils complétement différents et les miels médicaux alors que le Revamil et le Manuka montrent des effets relativement similaires. En effet, Les résultats montrent une augmentation de l’abondance de la protéine p62 pour les conditions Revamil, Manuka et miel d’été par rapport à la condition « Sugar Mix » contrairement au miel de printemps qui se comporte comme la condition « Sugar Mix ». Ceci pourrait être expliqué par deux hypothèses. En effet, soit il pourrait s’agir d’une stimulation de l’initiation de l’autophagie et donc une accumulation d’autophagosomes, soit il pourrait s’agir d’une diminution de flux d’autophagie, c’est-à-dire l’étape de fusion de l’autophagosome avec le lysosome. Cette inhibition empêcherait ainsi la dégradation des autophagosomes, entrainant leur accumulation, ce qui expliquerait pourquoi p62 voit son abondance augmenter. Les résultats montrent également une diminution de l’abondance totale de TFEB ainsi qu’une translocation de TFEB dans les miels d’été, le Manuka et le Revamil. Une étude des gènes cibles de TFEB n’a pu affirmer que son activité est plus exprimée dans les miels d’été, Manuka et Revamil malgré sa translocation. Ces résultats montrent également que la composition du miel ainsi que la période de récolte influencent les effets de ce dernier sur l’abondance des protéines p62 et TFEB. Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage ..........................................................................................................................7
Introduction .....................................................................................................................................................8
Le miel........................................................................................................................................................11
Composition du miel..............................................................................................................................11
Propriétés du miel .................................................................................................................................15
L’autophagie ..............................................................................................................................................21
Mécanismes impliqués dans l’autophagie et formation de l’autophagosome .....................................23
Régulation de l’autophagie....................................................................................................................26
Objectif de l’étude .........................................................................................................................................32
Matériel et méthodes ....................................................................................................................................34
Matériels....................................................................................................................................................35
Miels.......................................................................................................................................................35
Cellules RAW 264.7................................................................................................................................37
Méthodes...................................................................................................................................................38
Workflow des manipulations.................................................................................................................38
Dosage protéique par la méthode de Bradford ....................................................................................38
Lysats cellulaires ....................................................................................................................................39
Fractionnement cellulaire......................................................................................................................40
Western blot ..........................................................................................................................................40
Dosage de deux enzymes lysosomales ..................................................................................................44
Immunofluorescence.............................................................................................................................46
Résultats et discussion...................................................................................................................................48
Résultats préliminaires ..............................................................................................................................49
Etude des nouveaux miels .........................................................................................................................49
Micrographie..........................................................................................................................................50
Etude des effets des miels sur l’abondance de p62 ..................................................................................52
Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de p62 par western blot .......................52
Immunofluorescence et observation de l’abondance et de la localisation de p62 au microscope
confocal..................................................................................................................................................54
Etude du facteur de transcription EB ........................................................................................................57
Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de TFEB par des analyses en western blot
...............................................................................................................................................................57
Immunofluorescence et observation au confocal.................................................................................59
Fractionnement .....................................................................................................................................61
Dosage enzymatique .............................................................................................................................63
Conclusions et perspectives ..........................................................................................................................64
Liste des abréviations ................................................................................................................................68
Liste des figures .........................................................................................................................................70
Références bibliographiques .........................................................................................................................72
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100365 Etude des effets de miels sur l’autophagie des macrophages [TFE / Mémoire] / Julie George, Auteur ; Gaëtane Maernoudt, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur
Langues : Français (fre)
Mots-clés : UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les propriétés curatives du miel sont connues depuis l’Antiquité et sont démontrées par des études contemporaines. En effet, le miel est connu depuis des décennies comme étant un remède naturel. Ses effets anti-inflammatoire, antibactériens et immunomodulatrices ne sont plus à prouver tant le nombre de recherches est important. Une recherche précédente a permis de mettre en évidence l’effet du miel artisanal d’été, des miels dont les propriétés curatives sont connues le Manuka et le Revamil sur l’abondance de protéines autophagiques des macrophages. En effet, les résultats ont montré une augmentation des protéines LC3-II et p62 en leur présence ainsi qu’une phosphorylation du complexe mTOR. L’autophagie désigne le mécanisme par lequel la cellule est capable de dégrader ses propres éléments cytoplasmiques n’étant plus nécessaire pour produire de nouvelles protéines. Ceci se réalise par l’intermédiaire de ses autophagosomes et lysosomes. L’objectif de ce travail de fin d’étude sera de confirmer l’augmentation de l’abondance des protéines autophagiques p62 dans les cellules RAW264.7 en présence du miel d’été, du Manuka et du Revamil. Il s’agira également de confirmer la diminution de l’abondance de la protéine TFEB qui est un marqueur majeur de l’autophagie dans ces 3 miels. L’objectif sera aussi de connaitre par quels mécanismes moléculaires et cellulaires ainsi que de quelle façon ces phénomènes se produisent et régulent l’autophagie. Dans le cadre de mon TFE, l’objectif principal est de connaitre et comprendre l’effet des différents miels sur les mécanismes d’autophagie des cellules macrophages. Pour se faire, on va s’intéresser principalement sur le facteur de transcription TFEB. Cette comparaison, des effets de différents miels a, dans un premier temps, été réalisée par analyse d’abondance protéique des marqueurs de l’autophagie et de kinases/enzymes clés de sa régulation. Cette recherche a permis de montrer une différence de l’augmentation de l’abondance des protéines p62 et TFEB en fonction du miel utilisé. La composition ainsi que la période de récolte du miel influenceraient cet effet. Deux miels artisanaux ont montré des profils complétement différents et les miels médicaux alors que le Revamil et le Manuka montrent des effets relativement similaires. En effet, Les résultats montrent une augmentation de l’abondance de la protéine p62 pour les conditions Revamil, Manuka et miel d’été par rapport à la condition « Sugar Mix » contrairement au miel de printemps qui se comporte comme la condition « Sugar Mix ». Ceci pourrait être expliqué par deux hypothèses. En effet, soit il pourrait s’agir d’une stimulation de l’initiation de l’autophagie et donc une accumulation d’autophagosomes, soit il pourrait s’agir d’une diminution de flux d’autophagie, c’est-à-dire l’étape de fusion de l’autophagosome avec le lysosome. Cette inhibition empêcherait ainsi la dégradation des autophagosomes, entrainant leur accumulation, ce qui expliquerait pourquoi p62 voit son abondance augmenter. Les résultats montrent également une diminution de l’abondance totale de TFEB ainsi qu’une translocation de TFEB dans les miels d’été, le Manuka et le Revamil. Une étude des gènes cibles de TFEB n’a pu affirmer que son activité est plus exprimée dans les miels d’été, Manuka et Revamil malgré sa translocation. Ces résultats montrent également que la composition du miel ainsi que la période de récolte influencent les effets de ce dernier sur l’abondance des protéines p62 et TFEB. Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage ..........................................................................................................................7
Introduction .....................................................................................................................................................8
Le miel........................................................................................................................................................11
Composition du miel..............................................................................................................................11
Propriétés du miel .................................................................................................................................15
L’autophagie ..............................................................................................................................................21
Mécanismes impliqués dans l’autophagie et formation de l’autophagosome .....................................23
Régulation de l’autophagie....................................................................................................................26
Objectif de l’étude .........................................................................................................................................32
Matériel et méthodes ....................................................................................................................................34
Matériels....................................................................................................................................................35
Miels.......................................................................................................................................................35
Cellules RAW 264.7................................................................................................................................37
Méthodes...................................................................................................................................................38
Workflow des manipulations.................................................................................................................38
Dosage protéique par la méthode de Bradford ....................................................................................38
Lysats cellulaires ....................................................................................................................................39
Fractionnement cellulaire......................................................................................................................40
Western blot ..........................................................................................................................................40
Dosage de deux enzymes lysosomales ..................................................................................................44
Immunofluorescence.............................................................................................................................46
Résultats et discussion...................................................................................................................................48
Résultats préliminaires ..............................................................................................................................49
Etude des nouveaux miels .........................................................................................................................49
Micrographie..........................................................................................................................................50
Etude des effets des miels sur l’abondance de p62 ..................................................................................52
Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de p62 par western blot .......................52
Immunofluorescence et observation de l’abondance et de la localisation de p62 au microscope
confocal..................................................................................................................................................54
Etude du facteur de transcription EB ........................................................................................................57
Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de TFEB par des analyses en western blot
...............................................................................................................................................................57
Immunofluorescence et observation au confocal.................................................................................59
Fractionnement .....................................................................................................................................61
Dosage enzymatique .............................................................................................................................63
Conclusions et perspectives ..........................................................................................................................64
Liste des abréviations ................................................................................................................................68
Liste des figures .........................................................................................................................................70
Références bibliographiques .........................................................................................................................72
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100365 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etude des mécanismes moléculaires contrôlant la réponse chimiotactique de la bactérie Caulobacter crescentus face au cuivre / Vincent Paquet
Titre : Etude des mécanismes moléculaires contrôlant la réponse chimiotactique de la bactérie Caulobacter crescentus face au cuivre Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Vincent Paquet, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Notre environnement est constamment soumis à des variations de température, de concentration en CO2 dans l’air, ou encore à la présence de produits toxiques dans les mers ou les océans. L’augmentation de la concentration en cuivre (Cu) dans les eaux provoquant des stress oxydatifs pour les bactéries qui y sont exposées en est un exemple. Pour éviter des troubles métaboliques, les bactéries développent divers mécanismes de réponses adaptatifs. Caulobacter crescentus est un exemple de ces bactéries qui possède un mécanisme spécifique mis en oeuvre pour résister à ces variations extérieures. En effet, cet organisme aquatique possède un cycle cellulaire assez particulier. Son cycle cellulaire donne naissance à deux
cellules filles totalement différentes que ce soit morphologiquement ou fonctionnellement. Ces deux cellules sont appelées stalked et swarmer. Ces deux cellules réagissent différemment dans un milieu ou la concentration en Cu est stressante. D’un côté, la cellule stalked possède
un système appelé PcoAB qui lui permet de réguler sa concentration intracellulaire en Cu et de l’autre côté, la cellule swarmer peut à l’aide de son flagelle s’éloigner de cet environnement présentant le stress dû au Cu. Ce mécanisme est d’ailleurs appelé le chimiotactisme.
En ce moment, une étude visant à caractériser le chimiotactisme de C. crescentus est menée dans le laboratoire de l’URBM. Ce travail de fin d’étude s’inscrit dans le cadre de cette recherche. L’objectif premier de ce travail est de mettre au point deux protocoles simples et
rapides qui permettent une mise en évidence directe d’un mouvement dû à ce chimiotactisme. Ces deux expériences se basent sur des principes différents, l’une se base sur des gouttières de nage et l’autre se base sur une plaque 96 puits. Ces deux expérimentations
seront adaptées depuis un protocole standard existant afin de trouver les conditions optimales pour visualiser significativement un mouvement chimiotactique.
L’autre axe de ce travail vise à caractériser une protéine reconnue comme un acteur potentiellement important dans ce processus chimiotactique. Pour ce faire, un protocole de surexpression optimale de cette protéine sera mis au point sur base d’un procédé existant et utilisé pour la surexpression d’autres protéines. Pour caractériser cette protéine après surexpression, elle sera purifiée et cristallisée pour en étudier sa structure tridimensionnelle.Note de contenu : Présentation du lieu de stage ................................................................................................ 9
Introduction générale ............................................................................................................11
1. Contexte théorique ........................................................................................................13
1.1 Caulobacter crescentus ..........................................................................................13
1.2 Chimiotactisme .......................................................................................................15
1.3 Methyl-accepting Chemotaxis Protein (MCP) .........................................................17
2. Contexte de la recherche et objectifs .............................................................................19
3. Matériel et méthode .......................................................................................................21
3.1 Test gouttière : Protocole standard .........................................................................21
3.1.1 1ere mise au point.............................................................................................22
3.1.2 2e mise au point...............................................................................................22
3.1.3 3e mise au point...............................................................................................23
3.2 Test de chimiotactisme en plaque 96 puits : protocole standard .............................24
3.2.1 1ere mise au point.............................................................................................25
3.2.2 2e mise au point...............................................................................................26
3.2.3 3e mise au point...............................................................................................27
3.3 Production de souche BL21-pET28a-mcpP ............................................................28
3.3.1 Construction souche BL21-pET28a-mcpP .......................................................28
3.4 Surexpression de BL21-pET28A-mcpP ..................................................................32
3.4.1 Cultures LB-Kan en petit volume de BL21-pET28a-mcpP ...............................32
3.4.2 Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction à l’IPTG en petit volume ...........33
4. Résultats et discussion ..................................................................................................35
4.1 Gouttières ..............................................................................................................35
4.1.1 1ere mise au point .............................................................................................35
4.1.2 2e mise au point...............................................................................................36
4.1.3 3e mise au point...............................................................................................38
4.2 Test de chimiotactisme en Plaque 96 puits ............................................................40
4.2.1 1ere mise au point.............................................................................................40
4.2.2 2e mise au point...............................................................................................41
4.2.3 3e mise au point...............................................................................................42
4.3 Surexpression de McpP .........................................................................................43
4.3.1 Construction de la souche BL21-pET28a-mcpP ..............................................43
4.3.2 Vérification de la surexpression de BL21-pET28a-mcpP .................................45
Conclusion ...........................................................................................................................47
Bibliographie ........................................................................................................................49
Liste des figures ...................................................................................................................50
Liste des tableaux ................................................................................................................50
AnnexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79997 Etude des mécanismes moléculaires contrôlant la réponse chimiotactique de la bactérie Caulobacter crescentus face au cuivre [TFE / Mémoire] / Vincent Paquet, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Notre environnement est constamment soumis à des variations de température, de concentration en CO2 dans l’air, ou encore à la présence de produits toxiques dans les mers ou les océans. L’augmentation de la concentration en cuivre (Cu) dans les eaux provoquant des stress oxydatifs pour les bactéries qui y sont exposées en est un exemple. Pour éviter des troubles métaboliques, les bactéries développent divers mécanismes de réponses adaptatifs. Caulobacter crescentus est un exemple de ces bactéries qui possède un mécanisme spécifique mis en oeuvre pour résister à ces variations extérieures. En effet, cet organisme aquatique possède un cycle cellulaire assez particulier. Son cycle cellulaire donne naissance à deux
cellules filles totalement différentes que ce soit morphologiquement ou fonctionnellement. Ces deux cellules sont appelées stalked et swarmer. Ces deux cellules réagissent différemment dans un milieu ou la concentration en Cu est stressante. D’un côté, la cellule stalked possède
un système appelé PcoAB qui lui permet de réguler sa concentration intracellulaire en Cu et de l’autre côté, la cellule swarmer peut à l’aide de son flagelle s’éloigner de cet environnement présentant le stress dû au Cu. Ce mécanisme est d’ailleurs appelé le chimiotactisme.
En ce moment, une étude visant à caractériser le chimiotactisme de C. crescentus est menée dans le laboratoire de l’URBM. Ce travail de fin d’étude s’inscrit dans le cadre de cette recherche. L’objectif premier de ce travail est de mettre au point deux protocoles simples et
rapides qui permettent une mise en évidence directe d’un mouvement dû à ce chimiotactisme. Ces deux expériences se basent sur des principes différents, l’une se base sur des gouttières de nage et l’autre se base sur une plaque 96 puits. Ces deux expérimentations
seront adaptées depuis un protocole standard existant afin de trouver les conditions optimales pour visualiser significativement un mouvement chimiotactique.
L’autre axe de ce travail vise à caractériser une protéine reconnue comme un acteur potentiellement important dans ce processus chimiotactique. Pour ce faire, un protocole de surexpression optimale de cette protéine sera mis au point sur base d’un procédé existant et utilisé pour la surexpression d’autres protéines. Pour caractériser cette protéine après surexpression, elle sera purifiée et cristallisée pour en étudier sa structure tridimensionnelle.Note de contenu : Présentation du lieu de stage ................................................................................................ 9
Introduction générale ............................................................................................................11
1. Contexte théorique ........................................................................................................13
1.1 Caulobacter crescentus ..........................................................................................13
1.2 Chimiotactisme .......................................................................................................15
1.3 Methyl-accepting Chemotaxis Protein (MCP) .........................................................17
2. Contexte de la recherche et objectifs .............................................................................19
3. Matériel et méthode .......................................................................................................21
3.1 Test gouttière : Protocole standard .........................................................................21
3.1.1 1ere mise au point.............................................................................................22
3.1.2 2e mise au point...............................................................................................22
3.1.3 3e mise au point...............................................................................................23
3.2 Test de chimiotactisme en plaque 96 puits : protocole standard .............................24
3.2.1 1ere mise au point.............................................................................................25
3.2.2 2e mise au point...............................................................................................26
3.2.3 3e mise au point...............................................................................................27
3.3 Production de souche BL21-pET28a-mcpP ............................................................28
3.3.1 Construction souche BL21-pET28a-mcpP .......................................................28
3.4 Surexpression de BL21-pET28A-mcpP ..................................................................32
3.4.1 Cultures LB-Kan en petit volume de BL21-pET28a-mcpP ...............................32
3.4.2 Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction à l’IPTG en petit volume ...........33
4. Résultats et discussion ..................................................................................................35
4.1 Gouttières ..............................................................................................................35
4.1.1 1ere mise au point .............................................................................................35
4.1.2 2e mise au point...............................................................................................36
4.1.3 3e mise au point...............................................................................................38
4.2 Test de chimiotactisme en Plaque 96 puits ............................................................40
4.2.1 1ere mise au point.............................................................................................40
4.2.2 2e mise au point...............................................................................................41
4.2.3 3e mise au point...............................................................................................42
4.3 Surexpression de McpP .........................................................................................43
4.3.1 Construction de la souche BL21-pET28a-mcpP ..............................................43
4.3.2 Vérification de la surexpression de BL21-pET28a-mcpP .................................45
Conclusion ...........................................................................................................................47
Bibliographie ........................................................................................................................49
Liste des figures ...................................................................................................................50
Liste des tableaux ................................................................................................................50
AnnexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79997 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etude de la résistance à la Bléomycine induite par la protéine TMEM45A dans les cellules cancéreuses HepG2 / SOPHIE CRÈVECOEUR
PermalinkEtude du rôle de la protéine PicC de Brucella abortus. / SABRINA DELMOITIE
PermalinkMise au point d'un test de croissance cellulaire permettant le criblage de molécules en vue de trouver un inhibiteur de ka résistance à la doxorubicine conférée par la protéine MAGE-A1 aux cellules tumorales mammaires MCF-7 / Martin Lemaire
PermalinkRecherche de la fonction de la maspardine, une protéine déficiente dans la paraplégie spastique 21 / Anaïs Dupuis
PermalinkUniversities of Wallonia. Connecting research to business / LIAISON ENTREPRISES UNIVERSITES
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