Centre de Documentation Campus Montignies
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Lundi : 8h-18h30
Mardi : 8h-18h30
Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Recherche de nouveaux inhibiteurs de la phosphosérine phosphatase (SerB2) - étude des interactions de petites molécules sur l’activité et l’inhibition de SerB2 par DSF et tests enzymatiques / Simon Cheval
Titre : Recherche de nouveaux inhibiteurs de la phosphosérine phosphatase (SerB2) - étude des interactions de petites molécules sur l’activité et l’inhibition de SerB2 par DSF et tests enzymatiques Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Simon Cheval, Auteur ; Jérôme Cornil, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Unamur laboratoire de Chimie Biologique Structurale CBS Tuberculose SerB2 Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La tuberculose, une maladie infectieuse causée par une bactérie, Mycobacterium tuberculosis, est devenue un problème de santé mondiale, notamment suite à l’apparition de souches résistantes aux traitements actuels. Afin de lutter contre cette maladie, le développement de nouveaux antibiotiques et donc la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques sont fortement encouragés. Une de ces cibles thérapeutiques déjà identifiée est la voie de la sérine, une voie essentielle à la survie du pathogène.
Ce travail s’intègre dans ces recherches pour lutter contre la tuberculose en s’intéressant plus particulièrement à une enzyme de la voie de la sérine, SerB2. Selon des études précédentes, cette enzyme s’avère non seulement essentielle à la survie de la bactérie mais aussi à sa virulence dans l’organisme de son hôte. Une de ces recherches étudiant la structure de SerB2 montre la présence d’un site actif liés à deux domaines ACT régulateurs. Cette observation laisse espérer la possibilité d’inhiber cette enzyme via ces deux domaines dans le but de développer un nouveau pharmacophore (modèle de conception d’un médicament). L’objectif principal de ce TFE est donc la recherche d’inhibiteurs potentiels de SerB2 en ciblant les deux domaines ACT de l’enzyme. Cette recherche se fera à partir d’un panel d’acides aminés
et par l’intermédiaire de test DSF et enzymatiques. Il faudra produire l’enzyme, optimiser les conditions des différents tests et réaliser des screening de l’enzyme avec les acides aminés. Les domaines ciblés permettront-ils de mettre en évidence des acides aminés avec une haute interaction/inhibition de l’enzyme ? Est-ce que l’inhibition de SerB2 par des acides aminés est une piste exploitable dans la lutte contre la tuberculose ? De nombreuses perspectives sont
encore à envisager ...Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
Remerciements.............................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ...................................................................................................... 9
Chapitre I. L’université de Namur – l’Unamur .................................................................. 9
Chapitre II. Le laboratoire de Chimie Biologique Structurale – le CBS.......................... 9
I. Contexte général............................................................................................................... 10
Chapitre I. La tuberculose................................................................................................. 10
Introduction ............................................................................................................... 10
La pathologie ............................................................................................................. 10
L’agent infectieux - M. tuberculosis.......................................................................... 11
Problématique actuelle – traitement de la tuberculose et apparition de souches
résistantes ......................................................................................................................... 12
Chapitre II. Nouvelles pistes de lutte thérapeutique – la voie de la sérine..................... 13
Identification de la voie de la sérine en tant que cible thérapeutique ........................ 13
Description de la voie de la sérine............................................................................. 13
Chapitre III. Recherches préliminaires sur SerB2, une bonne cible thérapeuthique ? .... 14
SerB2, un facteur de virulence .................................................................................. 14
Structure et fonction de SerB2................................................................................... 15
Inhibiteurs connus de SerB2...................................................................................... 16
II. Objectifs et stratégie......................................................................................................... 18
III. Matériel et méthodes ..................................................................................................... 20
Chapitre I. Production, purification et caractérisation de SerB2 ...................................... 20
Etape préliminaire – préparation de différents tampons............................................ 20
Production (surexpression) de SerB2 His6 ................................................................ 20
Purification par chromatographie d’affinité IMAC, dialyse et clivage du His-tag ... 23
Caractérisation de la purification par électrophorèse SDS-PAGE et dosage au nano
drop................................................................................................................................... 24
Stockage et passage sur colonne PD10...................................................................... 26
Chapitre II. Mise au point des conditions pour test DSF et screening de 30 acides aminés
..................................................................................................................... 27
Mise au point du test DSF de SerB2 avec 10 acides aminés ..................................... 28
Screening des 30 acides aminés................................................................................. 29
Chapitre III. Mise au point des conditions pour test phosphatase et screening des ligands
sélectionnés avec SerB2 ....................................................................................................... 29
Détermination de la concentration en acide aminé.................................................... 30
Screening des acides aminés...................................................................................... 30
Chapitre IV. essais de cristallogenèse sur SerB2............................................................. 31
Recherche des conditions de cristallisation ............................................................... 32
Reproduction et optimisation des cristaux................................................................. 32
Analyse cristallographique ........................................................................................ 32
IV. Résultats et discussion................................................................................................... 33
Chapitre I. Surexpression et purification de SerB2 .......................................................... 33
Conclusion intermédiaire........................................................................................... 36
Chapitre II. DSF – optimisation et résultats du screening.............................................. 37
Condition 1 : choix du tampon et du colorant ........................................................... 38
Condition 2 : optimisation de la concentration en enzyme ....................................... 40
Condition 3 : optimisation de la concentration du colorant Syp Orange................... 41
Condition 4 : optimisation de la concentration en acide aminé................................. 42
Conclusion intermédiaire et résumé des conditions sélectionnées ............................ 43
Screening des acides aminés par DSF ....................................................................... 44
Chapitre III. Test phosphatase – optimisation et screening ............................................. 45
Optimisation du test phosphatase .............................................................................. 45
Screening des 30 acides aminés par test phosphatase ............................................... 46
Conclusions intermédiaires........................................................................................ 47
Chapitre IV. Cristallogenèse ............................................................................................ 48
1ère tentative d’obtention de cristaux ......................................................................... 48
Optimisation des conditions de cristallisation ........................................................... 49
Analyse cristallographique ........................................................................................ 49
Conclusions générales et perspectives ..................................................................................... 50
Bibliographie............................................................................................................................ 52
Annexes ........................................................................................................................................
Annexe 1 – kit cbs screen md1-104 .........................................................................................
Annexe 2 – protocole du test phosphatase ...............................................................................
Annexe 3 – Screening DSF des différents acides aminés à une concentration de 100 μM .....
Annexe 4 – conditions d’optimisation de cristallisation ..........................................................
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100296 Recherche de nouveaux inhibiteurs de la phosphosérine phosphatase (SerB2) - étude des interactions de petites molécules sur l’activité et l’inhibition de SerB2 par DSF et tests enzymatiques [TFE / Mémoire] / Simon Cheval, Auteur ; Jérôme Cornil, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : Unamur laboratoire de Chimie Biologique Structurale CBS Tuberculose SerB2 Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La tuberculose, une maladie infectieuse causée par une bactérie, Mycobacterium tuberculosis, est devenue un problème de santé mondiale, notamment suite à l’apparition de souches résistantes aux traitements actuels. Afin de lutter contre cette maladie, le développement de nouveaux antibiotiques et donc la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques sont fortement encouragés. Une de ces cibles thérapeutiques déjà identifiée est la voie de la sérine, une voie essentielle à la survie du pathogène.
Ce travail s’intègre dans ces recherches pour lutter contre la tuberculose en s’intéressant plus particulièrement à une enzyme de la voie de la sérine, SerB2. Selon des études précédentes, cette enzyme s’avère non seulement essentielle à la survie de la bactérie mais aussi à sa virulence dans l’organisme de son hôte. Une de ces recherches étudiant la structure de SerB2 montre la présence d’un site actif liés à deux domaines ACT régulateurs. Cette observation laisse espérer la possibilité d’inhiber cette enzyme via ces deux domaines dans le but de développer un nouveau pharmacophore (modèle de conception d’un médicament). L’objectif principal de ce TFE est donc la recherche d’inhibiteurs potentiels de SerB2 en ciblant les deux domaines ACT de l’enzyme. Cette recherche se fera à partir d’un panel d’acides aminés
et par l’intermédiaire de test DSF et enzymatiques. Il faudra produire l’enzyme, optimiser les conditions des différents tests et réaliser des screening de l’enzyme avec les acides aminés. Les domaines ciblés permettront-ils de mettre en évidence des acides aminés avec une haute interaction/inhibition de l’enzyme ? Est-ce que l’inhibition de SerB2 par des acides aminés est une piste exploitable dans la lutte contre la tuberculose ? De nombreuses perspectives sont
encore à envisager ...Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
Remerciements.............................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ...................................................................................................... 9
Chapitre I. L’université de Namur – l’Unamur .................................................................. 9
Chapitre II. Le laboratoire de Chimie Biologique Structurale – le CBS.......................... 9
I. Contexte général............................................................................................................... 10
Chapitre I. La tuberculose................................................................................................. 10
Introduction ............................................................................................................... 10
La pathologie ............................................................................................................. 10
L’agent infectieux - M. tuberculosis.......................................................................... 11
Problématique actuelle – traitement de la tuberculose et apparition de souches
résistantes ......................................................................................................................... 12
Chapitre II. Nouvelles pistes de lutte thérapeutique – la voie de la sérine..................... 13
Identification de la voie de la sérine en tant que cible thérapeutique ........................ 13
Description de la voie de la sérine............................................................................. 13
Chapitre III. Recherches préliminaires sur SerB2, une bonne cible thérapeuthique ? .... 14
SerB2, un facteur de virulence .................................................................................. 14
Structure et fonction de SerB2................................................................................... 15
Inhibiteurs connus de SerB2...................................................................................... 16
II. Objectifs et stratégie......................................................................................................... 18
III. Matériel et méthodes ..................................................................................................... 20
Chapitre I. Production, purification et caractérisation de SerB2 ...................................... 20
Etape préliminaire – préparation de différents tampons............................................ 20
Production (surexpression) de SerB2 His6 ................................................................ 20
Purification par chromatographie d’affinité IMAC, dialyse et clivage du His-tag ... 23
Caractérisation de la purification par électrophorèse SDS-PAGE et dosage au nano
drop................................................................................................................................... 24
Stockage et passage sur colonne PD10...................................................................... 26
Chapitre II. Mise au point des conditions pour test DSF et screening de 30 acides aminés
..................................................................................................................... 27
Mise au point du test DSF de SerB2 avec 10 acides aminés ..................................... 28
Screening des 30 acides aminés................................................................................. 29
Chapitre III. Mise au point des conditions pour test phosphatase et screening des ligands
sélectionnés avec SerB2 ....................................................................................................... 29
Détermination de la concentration en acide aminé.................................................... 30
Screening des acides aminés...................................................................................... 30
Chapitre IV. essais de cristallogenèse sur SerB2............................................................. 31
Recherche des conditions de cristallisation ............................................................... 32
Reproduction et optimisation des cristaux................................................................. 32
Analyse cristallographique ........................................................................................ 32
IV. Résultats et discussion................................................................................................... 33
Chapitre I. Surexpression et purification de SerB2 .......................................................... 33
Conclusion intermédiaire........................................................................................... 36
Chapitre II. DSF – optimisation et résultats du screening.............................................. 37
Condition 1 : choix du tampon et du colorant ........................................................... 38
Condition 2 : optimisation de la concentration en enzyme ....................................... 40
Condition 3 : optimisation de la concentration du colorant Syp Orange................... 41
Condition 4 : optimisation de la concentration en acide aminé................................. 42
Conclusion intermédiaire et résumé des conditions sélectionnées ............................ 43
Screening des acides aminés par DSF ....................................................................... 44
Chapitre III. Test phosphatase – optimisation et screening ............................................. 45
Optimisation du test phosphatase .............................................................................. 45
Screening des 30 acides aminés par test phosphatase ............................................... 46
Conclusions intermédiaires........................................................................................ 47
Chapitre IV. Cristallogenèse ............................................................................................ 48
1ère tentative d’obtention de cristaux ......................................................................... 48
Optimisation des conditions de cristallisation ........................................................... 49
Analyse cristallographique ........................................................................................ 49
Conclusions générales et perspectives ..................................................................................... 50
Bibliographie............................................................................................................................ 52
Annexes ........................................................................................................................................
Annexe 1 – kit cbs screen md1-104 .........................................................................................
Annexe 2 – protocole du test phosphatase ...............................................................................
Annexe 3 – Screening DSF des différents acides aminés à une concentration de 100 μM .....
Annexe 4 – conditions d’optimisation de cristallisation ..........................................................
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100296 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etude de la résistance à la Bléomycine induite par la protéine TMEM45A dans les cellules cancéreuses HepG2 / SOPHIE CRÈVECOEUR
Titre : Etude de la résistance à la Bléomycine induite par la protéine TMEM45A dans les cellules cancéreuses HepG2 Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : SOPHIE CRÈVECOEUR, Année de publication : 2016 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Biologie médicale UNamur CBS URBC cancer hépatocarcinome radiothérapie traitement étoposide cisplatine bléomycine apoptose cellulaire caspases apoptose intrinsèque apoptose extrinsèque résistance cellulaire pompes à éfflux hypoxie hypoxie tumorale hypoxie chronique hypoxie aigüe HIF angiogenèse tumorale TMEM45A siRNA culture cellulaire comptage cellulaire activité métabolique spectrophotométrie étude cellulaire cytotoxicité LDH Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage ………………………………………………………………………………………………………………… 9
Introduction générale ……………………………………………………………………………………………………………………………11
Contexte général …………………………………………………………………………………………………………………………………. 13
1. Le cancer : généralités .................................................................................................................... 13
1.1. L’hépatocarcinome ................................................................................................................. 13
1.2. Les différents moyens de traitement ...................................................................................... 14
1.2.1. Chirurgie …………………………………………………………………………………………………………………………14
1.2.2. Radiothérapie ………………………………………………………………………………………………………………...14
1.2.3. Chimiothérapie ……………………………………………………………………………………………………………… 15
1.2.4. Thérapie ciblée ……………………………………………………………………………………………………………….16
1.3. Les molécules anticancéreuses ............................................................................................... 17
1.3.1. Etoposide ……………………………………………………………………………………………………………………….17
1.3.2. Cisplatine ……………………………………………………………………………………………………………………….17
1.3.3. Bléomycine …………………………………………………………………………………………………………………….18
2. L’apoptose cellulaire ....................................................................................................................... 19
2.1. L’apoptose ............................................................................................................................... 19
2.2. Les caspases ............................................................................................................................ 19
2.3. Les voies de signalisation de l’apoptose ................................................................................. 20
2.3.1. L'apoptose intrinsèque …………………………………………………………………………………………………..20
2.3.2. L'apoptose extrinsèque …………………………………………………………………………………………………. 20
2.4. L’apoptose et les cellules cancéreuses ................................................................................... 21
3. La résistance .................................................................................................................................... 21
3.1. Résistance cellulaire aux anticancéreux ................................................................................. 21
3.2. Mécanismes de résistance ...................................................................................................... 21
3.2.1. Les pompes à éfflux ………………………………………………………………………………………………………..22
3.2.2. Modification de la cible ………………………………………………………………………………………………….22
4. L’hypoxie et la résistance ................................................................................................................ 22
4.1. L’hypoxie ................................................................................................................................. 22
4.1.1. Hypoxie tumorale …………………………………………………………………………………………………………. 22
4.1.2. Hypoxie chronique ………………………………………………………………………………………………………… 23
6 | P a g e
4.1.3. Hypoxie aiguë ………………………………………………………………………………………………………………...25
4.2. HIF ........................................................................................................................................... 25
4.2.1. Caractéristiques …………………………………………………………………………………………………………….25
4.2.2. HIF, résistances et croissance tumorale ………………………………………………………………………….25
4.3. Angiogenèse tumorale ............................................................................................................ 26
4.4. Résistance en condition d’hypoxie ......................................................................................... 26
5. TMEM45A ....................................................................................................................................... 27
5.1. Découverte .............................................................................................................................. 27
5.2. Caractéristiques ...................................................................................................................... 28
5.3. TMEM45A et l’hypoxie ............................................................................................................ 28
5.4. TMEM45A et le cancer ............................................................................................................ 29
5.5. siRNA ....................................................................................................................................... 30
Objectifs et stratégies …………………………………………………………………………………………………………………………..33
Matériel et méthodes …………………………………………………………………………………………………………………………..35
1. Techniques de culture cellulaire ..................................................................................................... 35
1.1. Matériel biologique ................................................................................................................. 35
1.2. Travail en conditions stériles .................................................................................................. 36
1.3. Comptage cellulaire ................................................................................................................ 36
2. Techniques d’étude cellulaire ......................................................................................................... 37
2.1. Test d’activité métabolique ................................................................................................... 37
2.1.1. Test d'activité métabolique ; MTT .………………………………………………………………………………….37
2.1.2. But .……………………………………………………………………………………………………………………………….. 37
2.1.3. Principe …………………………………………………………………………………………………………………………..37
2.1.4. Spectrophotométrie ……………………………………………………………………………………………………….38
2.2. Test à l’Iodure de Propidium, IP .............................................................................................. 39
2.2.1. Test de résistance …………………………………………………………………………………………………………..39
2.2.2. But ………………………………………………………………………………………………………………………………… 39
2.2.3. Principe …………………………………………………………………………………………………………………………..39
2.2.4. Hypoxie …………………………………………………………………………………………………………………………. 40
2.2.5. Fluorimétrie ……………………………………………………………………………………………………………………41
2.3. LDH .......................................................................................................................................... 42
2.3.1. Test de cytotoxicité ………………………………………………………………………………………………………..42
7 | P a g e
2.3.2. But ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 42
2.3.3. Principe ………………………………………………………………………………………………………………………….42
2.3.4. Lactate déshydrogénase …………………………………………………………………………………………………43
Résultats et discussion ………………………………………………………………………………………………………………………….45
1ère étape : établir la concentration de travail en Bléomycine : test MTT …………………………………………….45
1. Procédure générale ......................................................................................................................... 45
1.1. Jour 1 ....................................................................................................................................... 45
1.2. Jour 2 ....................................................................................................................................... 46
1.3. Jour 3 ....................................................................................................................................... 47
2. Conditions expérimentales ............................................................................................................. 47
3. Résultats .......................................................................................................................................... 48
2ème étape : mise en évidence d'une résistance via un test de viabilité cellulaire : Iodure de Propidium (IP) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 51
1. Procédure générale ......................................................................................................................... 51
1.1. Jour 1 ....................................................................................................................................... 51
1.2. Jour 2 ....................................................................................................................................... 51
1.3. Jour 3 ....................................................................................................................................... 51
2. Conditions expérimentales ............................................................................................................. 52
3. Résultats .......................................................................................................................................... 52
3ème étape : confirmation de la résistance via un test de cytotoxicité : LDH ………………………………………. 54
1. Procédure générale ......................................................................................................................... 54
1.1. Jour 1 ....................................................................................................................................... 54
1.2. Jour 2 ....................................................................................................................................... 54
1.3. Jour 3 ....................................................................................................................................... 54
2. Conditions expérimentales ............................................................................................................. 54
3. Résultats ........................................................................................................................................ 566
Conclusions ............................................................................................................................................. 59
Perspectives ............................................................................................................................................ 59
Table des abréviations …………………………………………………………………………………………………………………………. 63
Bibliographie ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 65
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65665 Etude de la résistance à la Bléomycine induite par la protéine TMEM45A dans les cellules cancéreuses HepG2 [TFE / Mémoire] / SOPHIE CRÈVECOEUR, . - 2016.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : Biologie médicale UNamur CBS URBC cancer hépatocarcinome radiothérapie traitement étoposide cisplatine bléomycine apoptose cellulaire caspases apoptose intrinsèque apoptose extrinsèque résistance cellulaire pompes à éfflux hypoxie hypoxie tumorale hypoxie chronique hypoxie aigüe HIF angiogenèse tumorale TMEM45A siRNA culture cellulaire comptage cellulaire activité métabolique spectrophotométrie étude cellulaire cytotoxicité LDH Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage ………………………………………………………………………………………………………………… 9
Introduction générale ……………………………………………………………………………………………………………………………11
Contexte général …………………………………………………………………………………………………………………………………. 13
1. Le cancer : généralités .................................................................................................................... 13
1.1. L’hépatocarcinome ................................................................................................................. 13
1.2. Les différents moyens de traitement ...................................................................................... 14
1.2.1. Chirurgie …………………………………………………………………………………………………………………………14
1.2.2. Radiothérapie ………………………………………………………………………………………………………………...14
1.2.3. Chimiothérapie ……………………………………………………………………………………………………………… 15
1.2.4. Thérapie ciblée ……………………………………………………………………………………………………………….16
1.3. Les molécules anticancéreuses ............................................................................................... 17
1.3.1. Etoposide ……………………………………………………………………………………………………………………….17
1.3.2. Cisplatine ……………………………………………………………………………………………………………………….17
1.3.3. Bléomycine …………………………………………………………………………………………………………………….18
2. L’apoptose cellulaire ....................................................................................................................... 19
2.1. L’apoptose ............................................................................................................................... 19
2.2. Les caspases ............................................................................................................................ 19
2.3. Les voies de signalisation de l’apoptose ................................................................................. 20
2.3.1. L'apoptose intrinsèque …………………………………………………………………………………………………..20
2.3.2. L'apoptose extrinsèque …………………………………………………………………………………………………. 20
2.4. L’apoptose et les cellules cancéreuses ................................................................................... 21
3. La résistance .................................................................................................................................... 21
3.1. Résistance cellulaire aux anticancéreux ................................................................................. 21
3.2. Mécanismes de résistance ...................................................................................................... 21
3.2.1. Les pompes à éfflux ………………………………………………………………………………………………………..22
3.2.2. Modification de la cible ………………………………………………………………………………………………….22
4. L’hypoxie et la résistance ................................................................................................................ 22
4.1. L’hypoxie ................................................................................................................................. 22
4.1.1. Hypoxie tumorale …………………………………………………………………………………………………………. 22
4.1.2. Hypoxie chronique ………………………………………………………………………………………………………… 23
6 | P a g e
4.1.3. Hypoxie aiguë ………………………………………………………………………………………………………………...25
4.2. HIF ........................................................................................................................................... 25
4.2.1. Caractéristiques …………………………………………………………………………………………………………….25
4.2.2. HIF, résistances et croissance tumorale ………………………………………………………………………….25
4.3. Angiogenèse tumorale ............................................................................................................ 26
4.4. Résistance en condition d’hypoxie ......................................................................................... 26
5. TMEM45A ....................................................................................................................................... 27
5.1. Découverte .............................................................................................................................. 27
5.2. Caractéristiques ...................................................................................................................... 28
5.3. TMEM45A et l’hypoxie ............................................................................................................ 28
5.4. TMEM45A et le cancer ............................................................................................................ 29
5.5. siRNA ....................................................................................................................................... 30
Objectifs et stratégies …………………………………………………………………………………………………………………………..33
Matériel et méthodes …………………………………………………………………………………………………………………………..35
1. Techniques de culture cellulaire ..................................................................................................... 35
1.1. Matériel biologique ................................................................................................................. 35
1.2. Travail en conditions stériles .................................................................................................. 36
1.3. Comptage cellulaire ................................................................................................................ 36
2. Techniques d’étude cellulaire ......................................................................................................... 37
2.1. Test d’activité métabolique ................................................................................................... 37
2.1.1. Test d'activité métabolique ; MTT .………………………………………………………………………………….37
2.1.2. But .……………………………………………………………………………………………………………………………….. 37
2.1.3. Principe …………………………………………………………………………………………………………………………..37
2.1.4. Spectrophotométrie ……………………………………………………………………………………………………….38
2.2. Test à l’Iodure de Propidium, IP .............................................................................................. 39
2.2.1. Test de résistance …………………………………………………………………………………………………………..39
2.2.2. But ………………………………………………………………………………………………………………………………… 39
2.2.3. Principe …………………………………………………………………………………………………………………………..39
2.2.4. Hypoxie …………………………………………………………………………………………………………………………. 40
2.2.5. Fluorimétrie ……………………………………………………………………………………………………………………41
2.3. LDH .......................................................................................................................................... 42
2.3.1. Test de cytotoxicité ………………………………………………………………………………………………………..42
7 | P a g e
2.3.2. But ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 42
2.3.3. Principe ………………………………………………………………………………………………………………………….42
2.3.4. Lactate déshydrogénase …………………………………………………………………………………………………43
Résultats et discussion ………………………………………………………………………………………………………………………….45
1ère étape : établir la concentration de travail en Bléomycine : test MTT …………………………………………….45
1. Procédure générale ......................................................................................................................... 45
1.1. Jour 1 ....................................................................................................................................... 45
1.2. Jour 2 ....................................................................................................................................... 46
1.3. Jour 3 ....................................................................................................................................... 47
2. Conditions expérimentales ............................................................................................................. 47
3. Résultats .......................................................................................................................................... 48
2ème étape : mise en évidence d'une résistance via un test de viabilité cellulaire : Iodure de Propidium (IP) ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 51
1. Procédure générale ......................................................................................................................... 51
1.1. Jour 1 ....................................................................................................................................... 51
1.2. Jour 2 ....................................................................................................................................... 51
1.3. Jour 3 ....................................................................................................................................... 51
2. Conditions expérimentales ............................................................................................................. 52
3. Résultats .......................................................................................................................................... 52
3ème étape : confirmation de la résistance via un test de cytotoxicité : LDH ………………………………………. 54
1. Procédure générale ......................................................................................................................... 54
1.1. Jour 1 ....................................................................................................................................... 54
1.2. Jour 2 ....................................................................................................................................... 54
1.3. Jour 3 ....................................................................................................................................... 54
2. Conditions expérimentales ............................................................................................................. 54
3. Résultats ........................................................................................................................................ 566
Conclusions ............................................................................................................................................. 59
Perspectives ............................................................................................................................................ 59
Table des abréviations …………………………………………………………………………………………………………………………. 63
Bibliographie ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 65
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65665 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Mise au point de la fluorimétrie différentielle à balayage sur l’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine en vue de réaliser un criblage d’inhibiteurs / DARLENE DE GROOTE
Titre : Mise au point de la fluorimétrie différentielle à balayage sur l’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine en vue de réaliser un criblage d’inhibiteurs Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : DARLENE DE GROOTE, Auteur Année de publication : 2015 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Université de Namur. laboratoire de Chimie Biologique et Structurale CBS Protéine Indoléamine 2,3-dioxygénase humaine // cancer Hido Fluorimétrie différentielle à balayage Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : L’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine (hIDO) est une enzyme impliquée dans le métabolisme du tryptophane. Elle constitue une cible thérapeutique intéressante car elle permet aux cellules cancéreuses de développer des mécanismes de résistance face au système immunitaire.
Dès lors, cette enzyme fait l’objet de nombreuses recherches à l’Université de Namur. Ce travail de fin d’études est ainsi composé de deux parties : la mise au point d’un protocole de production et purification d’hIDO possédant une étiquette de 6 histidines clivable en vue de sa cristallisation ainsi que la mise au point de la fluorimétrie différentielle à balayage sur cette enzyme, afin de mettre en évidence une interaction enzyme-inhibiteur.
D’une part, nous allons mettre au point le protocole de production et de purification d’hIDO possédant une étiquette de 6 histidines clivable. Des cellules d’Escherichia coli BL21 (DE3) transformées avec un plasmide codant pour hIDO permettent la production de l’enzyme. La purification est réalisée par FPLC (fast protein liquid chromatography) à l’aide d’une colonne d’affinité au nickel (IMAC ou immobilized metal affinity chromatography). Nous avons obtenu 2,2 mg de protéine purifiée pour une culture de 200 ml. Des tests d’activité enzymatique ont révélés que les lots d’enzyme purifiée étaient inactifs. Suite à cela, des modifications ont été apportées au niveau du protocole (modification de la concentration en IPTG, du temps et de la température d’induction, du protocole de lyse et changement de précurseur), mais celles-ci n’ont pas permis d’obtenir de l’enzyme active.
D’autre part, la sélection d’inhibiteurs d’hIDO par tests d’inhibition enzymatique ont permis la mise au point de la technique de fluorimétrie différentielle à balayage (DSF ou differential scanning fluorimetry). Nous avons choisi le 4-phénylthiazole-2-thiol (C33) ainsi que le 4-phénylimidazole (PIM). Cette technique est à priori rapide, universelle, bon marché et est basée sur l’utilisation de la fluorescence pour étudier l’effet d’un inhibiteur sur la stabilité de la protéine. La mise au point de cette méthode sur hIDO a permis de montrer une différence significative sur la stabilité de la protéine à l’aide du protocole « Protein Thermal Shift TM Dye Kit », appliqué sur des stocks d’enzyme actifs disponibles au laboratoire. De plus, celui-ci est reproductible et nécessite peu d’enzyme et de réactifs.Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Introduction ................................................................................................................................ 8
Contexte général ........................................................................................................................ 9
1. La fluorimétrie différentielle à balayage ........................................................................ 9
2. L’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine .................................................................... 11 Métabolisme du tryptophane ................................................................................ 11
Intérêt thérapeutique ............................................................................................ 13
Choix du modèle protéique ................................................................................... 14
Inhibiteurs .............................................................................................................. 15
Caractéristiques ..................................................................................................... 16
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 17
Matériel et méthodes .............................................................................................................. 19
1. Techniques de biologie moléculaire ............................................................................ 19 Matériel biologique ................................................................................................ 19
Plasmide pET-15b-hIDO .................................................................................. 19
Cellules d’Escherichia coli (DH10b et BL21) ................................................... 19
Transformation bactérienne .................................................................................. 20
2. Techniques d’étude de protéines ................................................................................ 20 Mise en culture et surexpression ........................................................................... 20
Pré-culture ...................................................................................................... 20
Culture ............................................................................................................ 20
Induction ......................................................................................................... 21
Lyse bactérienne ............................................................................................. 21
Lyse par sonication .................................................................................... 22
Lyse à la presse de French ......................................................................... 22
Protocole ................................................................................................... 22
Purification ............................................................................................................. 22
Principe de la séparation ................................................................................ 23
Protocole......................................................................................................... 24
Electrophorèse SDS-page ....................................................................................... 25
Principe ........................................................................................................... 25
Protocole......................................................................................................... 26
Dialyse .................................................................................................................... 26
Principe ........................................................................................................... 27
Protocole......................................................................................................... 27
Détermination de la concentration protéique ...................................................... 28
Principe ........................................................................................................... 28
Protocole......................................................................................................... 28
Tests enzymatiques ................................................................................................ 29
Principe ........................................................................................................... 29
Protocole......................................................................................................... 29
3. Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) ................................................................ 30 Principe .................................................................................................................. 30
Protocole ................................................................................................................ 31
Résultats et discussion ............................................................................................................. 32
1. Partie 1 : production et purification enzymatique ....................................................... 32 Culture cellulaire .................................................................................................... 32
Induction à l’IPTG ................................................................................................... 32
Lyse cellulaire ......................................................................................................... 33
Purification ............................................................................................................. 35
Caractérisation ....................................................................................................... 37
Quantification ................................................................................................. 37
Détermination de l’activité .................................................................................... 38
Test d’activité enzymatique............................................................................ 38
Rapport de l’absorbance 400/280 nm ............................................................ 40
Optimisation de la production et purification ....................................................... 41
Conclusion de la partie 1 ........................................................................................ 42
2. Partie 2 : mise au point de la DSF ................................................................................. 44 Tests d’inhibition enzymatique .............................................................................. 44
Spectres UV-visible des composés ......................................................................... 45
Protocoles utilisés .................................................................................................. 47
Premier Protocole inspiré de la littérature .................................................... 47
Protocole ................................................................................................... 47
Résultats et discussion .............................................................................. 48
Second protocole inspiré d’un kit ................................................................... 50
Protocole ................................................................................................... 50
Résultats et discussion .............................................................................. 50
Influence de la concentration en inhibiteur .............................................. 51
Comparaison des deux méthodes .................................................................. 53
Conclusion de la partie 2 ........................................................................................ 54
Conclusion et perspectives ....................................................................................................... 55
Table des abréviations.............................................................................................................. 56
Références bibliographiques .................................................................................................... 58
Table des annexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64032 Mise au point de la fluorimétrie différentielle à balayage sur l’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine en vue de réaliser un criblage d’inhibiteurs [TFE / Mémoire] / DARLENE DE GROOTE, Auteur . - 2015.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Université de Namur. laboratoire de Chimie Biologique et Structurale CBS Protéine Indoléamine 2,3-dioxygénase humaine // cancer Hido Fluorimétrie différentielle à balayage Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : L’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine (hIDO) est une enzyme impliquée dans le métabolisme du tryptophane. Elle constitue une cible thérapeutique intéressante car elle permet aux cellules cancéreuses de développer des mécanismes de résistance face au système immunitaire.
Dès lors, cette enzyme fait l’objet de nombreuses recherches à l’Université de Namur. Ce travail de fin d’études est ainsi composé de deux parties : la mise au point d’un protocole de production et purification d’hIDO possédant une étiquette de 6 histidines clivable en vue de sa cristallisation ainsi que la mise au point de la fluorimétrie différentielle à balayage sur cette enzyme, afin de mettre en évidence une interaction enzyme-inhibiteur.
D’une part, nous allons mettre au point le protocole de production et de purification d’hIDO possédant une étiquette de 6 histidines clivable. Des cellules d’Escherichia coli BL21 (DE3) transformées avec un plasmide codant pour hIDO permettent la production de l’enzyme. La purification est réalisée par FPLC (fast protein liquid chromatography) à l’aide d’une colonne d’affinité au nickel (IMAC ou immobilized metal affinity chromatography). Nous avons obtenu 2,2 mg de protéine purifiée pour une culture de 200 ml. Des tests d’activité enzymatique ont révélés que les lots d’enzyme purifiée étaient inactifs. Suite à cela, des modifications ont été apportées au niveau du protocole (modification de la concentration en IPTG, du temps et de la température d’induction, du protocole de lyse et changement de précurseur), mais celles-ci n’ont pas permis d’obtenir de l’enzyme active.
D’autre part, la sélection d’inhibiteurs d’hIDO par tests d’inhibition enzymatique ont permis la mise au point de la technique de fluorimétrie différentielle à balayage (DSF ou differential scanning fluorimetry). Nous avons choisi le 4-phénylthiazole-2-thiol (C33) ainsi que le 4-phénylimidazole (PIM). Cette technique est à priori rapide, universelle, bon marché et est basée sur l’utilisation de la fluorescence pour étudier l’effet d’un inhibiteur sur la stabilité de la protéine. La mise au point de cette méthode sur hIDO a permis de montrer une différence significative sur la stabilité de la protéine à l’aide du protocole « Protein Thermal Shift TM Dye Kit », appliqué sur des stocks d’enzyme actifs disponibles au laboratoire. De plus, celui-ci est reproductible et nécessite peu d’enzyme et de réactifs.Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Introduction ................................................................................................................................ 8
Contexte général ........................................................................................................................ 9
1. La fluorimétrie différentielle à balayage ........................................................................ 9
2. L’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine .................................................................... 11 Métabolisme du tryptophane ................................................................................ 11
Intérêt thérapeutique ............................................................................................ 13
Choix du modèle protéique ................................................................................... 14
Inhibiteurs .............................................................................................................. 15
Caractéristiques ..................................................................................................... 16
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 17
Matériel et méthodes .............................................................................................................. 19
1. Techniques de biologie moléculaire ............................................................................ 19 Matériel biologique ................................................................................................ 19
Plasmide pET-15b-hIDO .................................................................................. 19
Cellules d’Escherichia coli (DH10b et BL21) ................................................... 19
Transformation bactérienne .................................................................................. 20
2. Techniques d’étude de protéines ................................................................................ 20 Mise en culture et surexpression ........................................................................... 20
Pré-culture ...................................................................................................... 20
Culture ............................................................................................................ 20
Induction ......................................................................................................... 21
Lyse bactérienne ............................................................................................. 21
Lyse par sonication .................................................................................... 22
Lyse à la presse de French ......................................................................... 22
Protocole ................................................................................................... 22
Purification ............................................................................................................. 22
Principe de la séparation ................................................................................ 23
Protocole......................................................................................................... 24
Electrophorèse SDS-page ....................................................................................... 25
Principe ........................................................................................................... 25
Protocole......................................................................................................... 26
Dialyse .................................................................................................................... 26
Principe ........................................................................................................... 27
Protocole......................................................................................................... 27
Détermination de la concentration protéique ...................................................... 28
Principe ........................................................................................................... 28
Protocole......................................................................................................... 28
Tests enzymatiques ................................................................................................ 29
Principe ........................................................................................................... 29
Protocole......................................................................................................... 29
3. Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) ................................................................ 30 Principe .................................................................................................................. 30
Protocole ................................................................................................................ 31
Résultats et discussion ............................................................................................................. 32
1. Partie 1 : production et purification enzymatique ....................................................... 32 Culture cellulaire .................................................................................................... 32
Induction à l’IPTG ................................................................................................... 32
Lyse cellulaire ......................................................................................................... 33
Purification ............................................................................................................. 35
Caractérisation ....................................................................................................... 37
Quantification ................................................................................................. 37
Détermination de l’activité .................................................................................... 38
Test d’activité enzymatique............................................................................ 38
Rapport de l’absorbance 400/280 nm ............................................................ 40
Optimisation de la production et purification ....................................................... 41
Conclusion de la partie 1 ........................................................................................ 42
2. Partie 2 : mise au point de la DSF ................................................................................. 44 Tests d’inhibition enzymatique .............................................................................. 44
Spectres UV-visible des composés ......................................................................... 45
Protocoles utilisés .................................................................................................. 47
Premier Protocole inspiré de la littérature .................................................... 47
Protocole ................................................................................................... 47
Résultats et discussion .............................................................................. 48
Second protocole inspiré d’un kit ................................................................... 50
Protocole ................................................................................................... 50
Résultats et discussion .............................................................................. 50
Influence de la concentration en inhibiteur .............................................. 51
Comparaison des deux méthodes .................................................................. 53
Conclusion de la partie 2 ........................................................................................ 54
Conclusion et perspectives ....................................................................................................... 55
Table des abréviations.............................................................................................................. 56
Références bibliographiques .................................................................................................... 58
Table des annexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64032 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire