Centre de Documentation Campus Montignies
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Lundi : 8h-18h30
Mardi : 8h-18h30
Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Etude des mécanismes de résistance de Caulobacter crescentus au cuivre / Esma ALPAN
Titre : Etude des mécanismes de résistance de Caulobacter crescentus au cuivre Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Esma ALPAN, Auteur ; Jean-Yves MATROULE, Directeur de la recherche ; Johan Wouters, Directeur de la recherche Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Université de Namur département de biologie. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
REMERCIEMENTS
PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE
INTRODUCTION ............................................................................................................................... 13
1. CONTEXTE THÉORIQUE ........................................................................................................... 15
1.1. CAULOBACTER CRESCENTUS ....................................................................................................... 15
1.1.1. Généralités ..................................................................................................................... 15
1.1.2. Cycle de vie ..................................................................................................................... 15
1.2. LE CUIVRE, UN ÉLÉMENT ESSENTIEL .............................................................................................. 16
1.2.1. Distribution du Cu ........................................................................................................... 16
1.2.2. Toxicité du Cu à haute concentration ............................................................................. 18
1.2.3. Utilisation antérieure ..................................................................................................... 18
1.3. MÉCANISMES DE RÉSISTANCE FACE AU CU CHEZ LES BACTÉRIES ......................................................... 19
1.3.1. Pénétration ..................................................................................................................... 19
1.3.2. Prise en charge – Résistance .......................................................................................... 19
1.3.2.1. Système « Cue » ................................................................................................................. 20
1.3.2.2. Système « Cus » ................................................................................................................. 21
1.3.2.3. Système « Pco » ................................................................................................................. 22
1.3.2.4. Système « Cut » .................................................................................................................. 24
1.3.3. Séquestration du Cu ....................................................................................................... 24
1.3.4. Limitation de l’utilisation du Cu...................................................................................... 24
1.4. PATHOLOGIES LIÉES AU CU CHEZ L’HOMME ................................................................................... 25
1.5. RÉPONSE DE C. CRESCENTUS AU CU ............................................................................................. 25
2. OBJECTIFS ET STRATÉGIES ...................................................................................................... 27
3. MATÉRIEL ET MÉTHODES ........................................................................................................ 29
3.1. PRODUCTION ET PURIFICATION DE PCOA ET PCOB .......................................................................... 29
3.1.1. Expression dans la souche BL21 d’E. coli ........................................................................ 29
3.1.2. Plasmide vecteur pET24b ............................................................................................... 29
3.1.2.1. Région Multiple Cloning Site (MCS) .................................................................................... 30
3.1.2.2. Opérateur lac ..................................................................................................................... 30
3.1.2.3. His-tag de PcoA et PcoB ..................................................................................................... 30
3.1.2.4. Sélection à la kanamycine .................................................................................................. 30
3.1.3. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 30
3.1.3.1. Extraction du plasmide pET24b-PcoB « Miniprep » ........................................................... 31
3.1.3.2. Electroporation à partir des souches BL21 et DH10B-pET24b-PcoB .................................. 31
3.1.3.3. PCR des colonies BL21-pET24b-PcoB.................................................................................. 32
3.1.3.4. Migration des résultats de la PCR sur gel d’agarose .......................................................... 33
3.1.4. Surexpression de BL21-pET24b-PcoA et BL21-pET24b-PcoB .......................................... 33
3.1.4.1. Composition du milieu LB................................................................................................... 33
3.1.4.2. Courbe de croissance : mesure D.O. .................................................................................. 33
3.1.4.3. Cultures LB-Kan à petit volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB .................. 34
3.1.4.4. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à petit volume ..... 34
3.1.4.5. Cultures LB-Kan à grand volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB ................ 36
3.1.4.6. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à grand volume ... 36
3.1.5. Purification de PcoA ou PcoB ......................................................................................... 37
3.1.5.1. Première étape de la purification – Traitement à la guanidine 6 M ................................... 37
3.1.5.2. Deuxième étape de la purification – Chromatographie d’affinité ...................................... 38
3.1.5.3. Vérification de la purification de PcoA ou PcoB sur gel SDS-PAGE ..................................... 39
3.1.6. Dialyse de PcoA ou PcoB ................................................................................................ 39
3.1.7. Concentration de PcoA ou PcoB ..................................................................................... 40
3.2. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 42
3.2.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 42
3.2.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse de PcoA ......................................... 42
3.3. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA OU PCOB ........................................................................................ 43
3.3.1. Principe ........................................................................................................................... 43
3.3.2. Méthode ......................................................................................................................... 44
3.3.2.1. Préparation des plaques pour la cristallogenèse ............................................................... 45
3.3.2.2. Observation des plaques au microscope ............................................................................ 45
3.4. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 46
3.4.1. Caractéristiques de la souche sauvage de C. crescentus ................................................ 46
3.4.2. Caractéristiques de la souche E. coli Tn5 ........................................................................ 46
3.4.3. Particularité de la souche C. crescentus ΔAB ................................................................. 46
3.4.4. Composition du milieu PYE (HIGG) ................................................................................. 46
3.4.5. Création des mutants de C. crescentus .......................................................................... 47
3.4.6. Isolement de mutants de C. crescentus sensibles au Cu ................................................. 48
3.4.7. Analyse de la croissance cellulaire en présence de Cu ................................................... 48
3.4.7.1. Croissance de la souche CB15N en présence de Cu ........................................................... 48
3.4.7.2. Croissance de mutants sensibles au Cu en présence de Cu ............................................... 49
4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS ................................................................................................... 51
4.1. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOB .............................................................. 51
4.1.1. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 51
4.1.2. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoB .................................................. 53
4.1.3. Vérification de la purification de PcoB ........................................................................... 54
4.1.4. Dialyse des fractions pures de PcoB ............................................................................... 55
4.1.5. Concentration de PcoB ................................................................................................... 56
4.2. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOA .............................................................. 57
4.2.1. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoA ................................................. 57
4.2.2. Vérification de la purification de PcoA ........................................................................... 58
4.2.3. Dialyse des fractions pures de PcoA ............................................................................... 59
4.2.4. Concentration de PcoA ................................................................................................... 59
4.2.4.1. Première culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (2X 200 ml) ............................................. 59
4.2.4.2. Deuxième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.3. Traitement des précipités issus des cultures précédentes ................................................. 60
4.2.4.4. Troisième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.5. Discussion ........................................................................................................................... 61
4.3. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 62
4.3.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 62
4.3.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse ....................................................... 62
4.3.2.1. Résultats du dosage de la concentration de PcoA ............................................................. 62
4.4. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA ..................................................................................................... 63
4.4.1. Cristal dans la plaque PcoA n°A...................................................................................... 63
4.5. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 64
4.5.1. Nombre de mutants isolés « sensibles » au Cu .............................................................. 64
4.5.2. Analyse de la croissance de la souche CB15N en présence de concentrations croissantes en Cu....... ...................................................................................................................................... 64
4.5.3. Analyse de la croissance des mutants sensibles au Cu en présence de 100 ou 150 μM de Cu………..Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65824 Etude des mécanismes de résistance de Caulobacter crescentus au cuivre [TFE / Mémoire] / Esma ALPAN, Auteur ; Jean-Yves MATROULE, Directeur de la recherche ; Johan Wouters, Directeur de la recherche . - 2017.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Université de Namur département de biologie. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
REMERCIEMENTS
PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE
INTRODUCTION ............................................................................................................................... 13
1. CONTEXTE THÉORIQUE ........................................................................................................... 15
1.1. CAULOBACTER CRESCENTUS ....................................................................................................... 15
1.1.1. Généralités ..................................................................................................................... 15
1.1.2. Cycle de vie ..................................................................................................................... 15
1.2. LE CUIVRE, UN ÉLÉMENT ESSENTIEL .............................................................................................. 16
1.2.1. Distribution du Cu ........................................................................................................... 16
1.2.2. Toxicité du Cu à haute concentration ............................................................................. 18
1.2.3. Utilisation antérieure ..................................................................................................... 18
1.3. MÉCANISMES DE RÉSISTANCE FACE AU CU CHEZ LES BACTÉRIES ......................................................... 19
1.3.1. Pénétration ..................................................................................................................... 19
1.3.2. Prise en charge – Résistance .......................................................................................... 19
1.3.2.1. Système « Cue » ................................................................................................................. 20
1.3.2.2. Système « Cus » ................................................................................................................. 21
1.3.2.3. Système « Pco » ................................................................................................................. 22
1.3.2.4. Système « Cut » .................................................................................................................. 24
1.3.3. Séquestration du Cu ....................................................................................................... 24
1.3.4. Limitation de l’utilisation du Cu...................................................................................... 24
1.4. PATHOLOGIES LIÉES AU CU CHEZ L’HOMME ................................................................................... 25
1.5. RÉPONSE DE C. CRESCENTUS AU CU ............................................................................................. 25
2. OBJECTIFS ET STRATÉGIES ...................................................................................................... 27
3. MATÉRIEL ET MÉTHODES ........................................................................................................ 29
3.1. PRODUCTION ET PURIFICATION DE PCOA ET PCOB .......................................................................... 29
3.1.1. Expression dans la souche BL21 d’E. coli ........................................................................ 29
3.1.2. Plasmide vecteur pET24b ............................................................................................... 29
3.1.2.1. Région Multiple Cloning Site (MCS) .................................................................................... 30
3.1.2.2. Opérateur lac ..................................................................................................................... 30
3.1.2.3. His-tag de PcoA et PcoB ..................................................................................................... 30
3.1.2.4. Sélection à la kanamycine .................................................................................................. 30
3.1.3. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 30
3.1.3.1. Extraction du plasmide pET24b-PcoB « Miniprep » ........................................................... 31
3.1.3.2. Electroporation à partir des souches BL21 et DH10B-pET24b-PcoB .................................. 31
3.1.3.3. PCR des colonies BL21-pET24b-PcoB.................................................................................. 32
3.1.3.4. Migration des résultats de la PCR sur gel d’agarose .......................................................... 33
3.1.4. Surexpression de BL21-pET24b-PcoA et BL21-pET24b-PcoB .......................................... 33
3.1.4.1. Composition du milieu LB................................................................................................... 33
3.1.4.2. Courbe de croissance : mesure D.O. .................................................................................. 33
3.1.4.3. Cultures LB-Kan à petit volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB .................. 34
3.1.4.4. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à petit volume ..... 34
3.1.4.5. Cultures LB-Kan à grand volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB ................ 36
3.1.4.6. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à grand volume ... 36
3.1.5. Purification de PcoA ou PcoB ......................................................................................... 37
3.1.5.1. Première étape de la purification – Traitement à la guanidine 6 M ................................... 37
3.1.5.2. Deuxième étape de la purification – Chromatographie d’affinité ...................................... 38
3.1.5.3. Vérification de la purification de PcoA ou PcoB sur gel SDS-PAGE ..................................... 39
3.1.6. Dialyse de PcoA ou PcoB ................................................................................................ 39
3.1.7. Concentration de PcoA ou PcoB ..................................................................................... 40
3.2. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 42
3.2.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 42
3.2.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse de PcoA ......................................... 42
3.3. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA OU PCOB ........................................................................................ 43
3.3.1. Principe ........................................................................................................................... 43
3.3.2. Méthode ......................................................................................................................... 44
3.3.2.1. Préparation des plaques pour la cristallogenèse ............................................................... 45
3.3.2.2. Observation des plaques au microscope ............................................................................ 45
3.4. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 46
3.4.1. Caractéristiques de la souche sauvage de C. crescentus ................................................ 46
3.4.2. Caractéristiques de la souche E. coli Tn5 ........................................................................ 46
3.4.3. Particularité de la souche C. crescentus ΔAB ................................................................. 46
3.4.4. Composition du milieu PYE (HIGG) ................................................................................. 46
3.4.5. Création des mutants de C. crescentus .......................................................................... 47
3.4.6. Isolement de mutants de C. crescentus sensibles au Cu ................................................. 48
3.4.7. Analyse de la croissance cellulaire en présence de Cu ................................................... 48
3.4.7.1. Croissance de la souche CB15N en présence de Cu ........................................................... 48
3.4.7.2. Croissance de mutants sensibles au Cu en présence de Cu ............................................... 49
4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS ................................................................................................... 51
4.1. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOB .............................................................. 51
4.1.1. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 51
4.1.2. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoB .................................................. 53
4.1.3. Vérification de la purification de PcoB ........................................................................... 54
4.1.4. Dialyse des fractions pures de PcoB ............................................................................... 55
4.1.5. Concentration de PcoB ................................................................................................... 56
4.2. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOA .............................................................. 57
4.2.1. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoA ................................................. 57
4.2.2. Vérification de la purification de PcoA ........................................................................... 58
4.2.3. Dialyse des fractions pures de PcoA ............................................................................... 59
4.2.4. Concentration de PcoA ................................................................................................... 59
4.2.4.1. Première culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (2X 200 ml) ............................................. 59
4.2.4.2. Deuxième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.3. Traitement des précipités issus des cultures précédentes ................................................. 60
4.2.4.4. Troisième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.5. Discussion ........................................................................................................................... 61
4.3. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 62
4.3.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 62
4.3.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse ....................................................... 62
4.3.2.1. Résultats du dosage de la concentration de PcoA ............................................................. 62
4.4. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA ..................................................................................................... 63
4.4.1. Cristal dans la plaque PcoA n°A...................................................................................... 63
4.5. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 64
4.5.1. Nombre de mutants isolés « sensibles » au Cu .............................................................. 64
4.5.2. Analyse de la croissance de la souche CB15N en présence de concentrations croissantes en Cu....... ...................................................................................................................................... 64
4.5.3. Analyse de la croissance des mutants sensibles au Cu en présence de 100 ou 150 μM de Cu………..Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65824 Exemplaires
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