Centre de Documentation Campus Montignies
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Lundi : 8h-18h30
Mardi : 8h-18h30
Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Auteur Jean-Yves MATROULE |
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Etude des mécanismes de résistance de Caulobacter crescentus au cuivre / Esma ALPAN
Titre : Etude des mécanismes de résistance de Caulobacter crescentus au cuivre Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Esma ALPAN, Auteur ; Jean-Yves MATROULE, Directeur de la recherche ; Johan Wouters, Directeur de la recherche Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Université de Namur département de biologie. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
REMERCIEMENTS
PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE
INTRODUCTION ............................................................................................................................... 13
1. CONTEXTE THÉORIQUE ........................................................................................................... 15
1.1. CAULOBACTER CRESCENTUS ....................................................................................................... 15
1.1.1. Généralités ..................................................................................................................... 15
1.1.2. Cycle de vie ..................................................................................................................... 15
1.2. LE CUIVRE, UN ÉLÉMENT ESSENTIEL .............................................................................................. 16
1.2.1. Distribution du Cu ........................................................................................................... 16
1.2.2. Toxicité du Cu à haute concentration ............................................................................. 18
1.2.3. Utilisation antérieure ..................................................................................................... 18
1.3. MÉCANISMES DE RÉSISTANCE FACE AU CU CHEZ LES BACTÉRIES ......................................................... 19
1.3.1. Pénétration ..................................................................................................................... 19
1.3.2. Prise en charge – Résistance .......................................................................................... 19
1.3.2.1. Système « Cue » ................................................................................................................. 20
1.3.2.2. Système « Cus » ................................................................................................................. 21
1.3.2.3. Système « Pco » ................................................................................................................. 22
1.3.2.4. Système « Cut » .................................................................................................................. 24
1.3.3. Séquestration du Cu ....................................................................................................... 24
1.3.4. Limitation de l’utilisation du Cu...................................................................................... 24
1.4. PATHOLOGIES LIÉES AU CU CHEZ L’HOMME ................................................................................... 25
1.5. RÉPONSE DE C. CRESCENTUS AU CU ............................................................................................. 25
2. OBJECTIFS ET STRATÉGIES ...................................................................................................... 27
3. MATÉRIEL ET MÉTHODES ........................................................................................................ 29
3.1. PRODUCTION ET PURIFICATION DE PCOA ET PCOB .......................................................................... 29
3.1.1. Expression dans la souche BL21 d’E. coli ........................................................................ 29
3.1.2. Plasmide vecteur pET24b ............................................................................................... 29
3.1.2.1. Région Multiple Cloning Site (MCS) .................................................................................... 30
3.1.2.2. Opérateur lac ..................................................................................................................... 30
3.1.2.3. His-tag de PcoA et PcoB ..................................................................................................... 30
3.1.2.4. Sélection à la kanamycine .................................................................................................. 30
3.1.3. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 30
3.1.3.1. Extraction du plasmide pET24b-PcoB « Miniprep » ........................................................... 31
3.1.3.2. Electroporation à partir des souches BL21 et DH10B-pET24b-PcoB .................................. 31
3.1.3.3. PCR des colonies BL21-pET24b-PcoB.................................................................................. 32
3.1.3.4. Migration des résultats de la PCR sur gel d’agarose .......................................................... 33
3.1.4. Surexpression de BL21-pET24b-PcoA et BL21-pET24b-PcoB .......................................... 33
3.1.4.1. Composition du milieu LB................................................................................................... 33
3.1.4.2. Courbe de croissance : mesure D.O. .................................................................................. 33
3.1.4.3. Cultures LB-Kan à petit volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB .................. 34
3.1.4.4. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à petit volume ..... 34
3.1.4.5. Cultures LB-Kan à grand volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB ................ 36
3.1.4.6. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à grand volume ... 36
3.1.5. Purification de PcoA ou PcoB ......................................................................................... 37
3.1.5.1. Première étape de la purification – Traitement à la guanidine 6 M ................................... 37
3.1.5.2. Deuxième étape de la purification – Chromatographie d’affinité ...................................... 38
3.1.5.3. Vérification de la purification de PcoA ou PcoB sur gel SDS-PAGE ..................................... 39
3.1.6. Dialyse de PcoA ou PcoB ................................................................................................ 39
3.1.7. Concentration de PcoA ou PcoB ..................................................................................... 40
3.2. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 42
3.2.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 42
3.2.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse de PcoA ......................................... 42
3.3. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA OU PCOB ........................................................................................ 43
3.3.1. Principe ........................................................................................................................... 43
3.3.2. Méthode ......................................................................................................................... 44
3.3.2.1. Préparation des plaques pour la cristallogenèse ............................................................... 45
3.3.2.2. Observation des plaques au microscope ............................................................................ 45
3.4. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 46
3.4.1. Caractéristiques de la souche sauvage de C. crescentus ................................................ 46
3.4.2. Caractéristiques de la souche E. coli Tn5 ........................................................................ 46
3.4.3. Particularité de la souche C. crescentus ΔAB ................................................................. 46
3.4.4. Composition du milieu PYE (HIGG) ................................................................................. 46
3.4.5. Création des mutants de C. crescentus .......................................................................... 47
3.4.6. Isolement de mutants de C. crescentus sensibles au Cu ................................................. 48
3.4.7. Analyse de la croissance cellulaire en présence de Cu ................................................... 48
3.4.7.1. Croissance de la souche CB15N en présence de Cu ........................................................... 48
3.4.7.2. Croissance de mutants sensibles au Cu en présence de Cu ............................................... 49
4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS ................................................................................................... 51
4.1. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOB .............................................................. 51
4.1.1. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 51
4.1.2. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoB .................................................. 53
4.1.3. Vérification de la purification de PcoB ........................................................................... 54
4.1.4. Dialyse des fractions pures de PcoB ............................................................................... 55
4.1.5. Concentration de PcoB ................................................................................................... 56
4.2. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOA .............................................................. 57
4.2.1. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoA ................................................. 57
4.2.2. Vérification de la purification de PcoA ........................................................................... 58
4.2.3. Dialyse des fractions pures de PcoA ............................................................................... 59
4.2.4. Concentration de PcoA ................................................................................................... 59
4.2.4.1. Première culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (2X 200 ml) ............................................. 59
4.2.4.2. Deuxième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.3. Traitement des précipités issus des cultures précédentes ................................................. 60
4.2.4.4. Troisième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.5. Discussion ........................................................................................................................... 61
4.3. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 62
4.3.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 62
4.3.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse ....................................................... 62
4.3.2.1. Résultats du dosage de la concentration de PcoA ............................................................. 62
4.4. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA ..................................................................................................... 63
4.4.1. Cristal dans la plaque PcoA n°A...................................................................................... 63
4.5. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 64
4.5.1. Nombre de mutants isolés « sensibles » au Cu .............................................................. 64
4.5.2. Analyse de la croissance de la souche CB15N en présence de concentrations croissantes en Cu....... ...................................................................................................................................... 64
4.5.3. Analyse de la croissance des mutants sensibles au Cu en présence de 100 ou 150 μM de Cu………..Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65824 Etude des mécanismes de résistance de Caulobacter crescentus au cuivre [TFE / Mémoire] / Esma ALPAN, Auteur ; Jean-Yves MATROULE, Directeur de la recherche ; Johan Wouters, Directeur de la recherche . - 2017.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Université de Namur département de biologie. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
REMERCIEMENTS
PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE
INTRODUCTION ............................................................................................................................... 13
1. CONTEXTE THÉORIQUE ........................................................................................................... 15
1.1. CAULOBACTER CRESCENTUS ....................................................................................................... 15
1.1.1. Généralités ..................................................................................................................... 15
1.1.2. Cycle de vie ..................................................................................................................... 15
1.2. LE CUIVRE, UN ÉLÉMENT ESSENTIEL .............................................................................................. 16
1.2.1. Distribution du Cu ........................................................................................................... 16
1.2.2. Toxicité du Cu à haute concentration ............................................................................. 18
1.2.3. Utilisation antérieure ..................................................................................................... 18
1.3. MÉCANISMES DE RÉSISTANCE FACE AU CU CHEZ LES BACTÉRIES ......................................................... 19
1.3.1. Pénétration ..................................................................................................................... 19
1.3.2. Prise en charge – Résistance .......................................................................................... 19
1.3.2.1. Système « Cue » ................................................................................................................. 20
1.3.2.2. Système « Cus » ................................................................................................................. 21
1.3.2.3. Système « Pco » ................................................................................................................. 22
1.3.2.4. Système « Cut » .................................................................................................................. 24
1.3.3. Séquestration du Cu ....................................................................................................... 24
1.3.4. Limitation de l’utilisation du Cu...................................................................................... 24
1.4. PATHOLOGIES LIÉES AU CU CHEZ L’HOMME ................................................................................... 25
1.5. RÉPONSE DE C. CRESCENTUS AU CU ............................................................................................. 25
2. OBJECTIFS ET STRATÉGIES ...................................................................................................... 27
3. MATÉRIEL ET MÉTHODES ........................................................................................................ 29
3.1. PRODUCTION ET PURIFICATION DE PCOA ET PCOB .......................................................................... 29
3.1.1. Expression dans la souche BL21 d’E. coli ........................................................................ 29
3.1.2. Plasmide vecteur pET24b ............................................................................................... 29
3.1.2.1. Région Multiple Cloning Site (MCS) .................................................................................... 30
3.1.2.2. Opérateur lac ..................................................................................................................... 30
3.1.2.3. His-tag de PcoA et PcoB ..................................................................................................... 30
3.1.2.4. Sélection à la kanamycine .................................................................................................. 30
3.1.3. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 30
3.1.3.1. Extraction du plasmide pET24b-PcoB « Miniprep » ........................................................... 31
3.1.3.2. Electroporation à partir des souches BL21 et DH10B-pET24b-PcoB .................................. 31
3.1.3.3. PCR des colonies BL21-pET24b-PcoB.................................................................................. 32
3.1.3.4. Migration des résultats de la PCR sur gel d’agarose .......................................................... 33
3.1.4. Surexpression de BL21-pET24b-PcoA et BL21-pET24b-PcoB .......................................... 33
3.1.4.1. Composition du milieu LB................................................................................................... 33
3.1.4.2. Courbe de croissance : mesure D.O. .................................................................................. 33
3.1.4.3. Cultures LB-Kan à petit volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB .................. 34
3.1.4.4. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à petit volume ..... 34
3.1.4.5. Cultures LB-Kan à grand volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB ................ 36
3.1.4.6. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à grand volume ... 36
3.1.5. Purification de PcoA ou PcoB ......................................................................................... 37
3.1.5.1. Première étape de la purification – Traitement à la guanidine 6 M ................................... 37
3.1.5.2. Deuxième étape de la purification – Chromatographie d’affinité ...................................... 38
3.1.5.3. Vérification de la purification de PcoA ou PcoB sur gel SDS-PAGE ..................................... 39
3.1.6. Dialyse de PcoA ou PcoB ................................................................................................ 39
3.1.7. Concentration de PcoA ou PcoB ..................................................................................... 40
3.2. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 42
3.2.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 42
3.2.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse de PcoA ......................................... 42
3.3. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA OU PCOB ........................................................................................ 43
3.3.1. Principe ........................................................................................................................... 43
3.3.2. Méthode ......................................................................................................................... 44
3.3.2.1. Préparation des plaques pour la cristallogenèse ............................................................... 45
3.3.2.2. Observation des plaques au microscope ............................................................................ 45
3.4. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 46
3.4.1. Caractéristiques de la souche sauvage de C. crescentus ................................................ 46
3.4.2. Caractéristiques de la souche E. coli Tn5 ........................................................................ 46
3.4.3. Particularité de la souche C. crescentus ΔAB ................................................................. 46
3.4.4. Composition du milieu PYE (HIGG) ................................................................................. 46
3.4.5. Création des mutants de C. crescentus .......................................................................... 47
3.4.6. Isolement de mutants de C. crescentus sensibles au Cu ................................................. 48
3.4.7. Analyse de la croissance cellulaire en présence de Cu ................................................... 48
3.4.7.1. Croissance de la souche CB15N en présence de Cu ........................................................... 48
3.4.7.2. Croissance de mutants sensibles au Cu en présence de Cu ............................................... 49
4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS ................................................................................................... 51
4.1. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOB .............................................................. 51
4.1.1. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 51
4.1.2. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoB .................................................. 53
4.1.3. Vérification de la purification de PcoB ........................................................................... 54
4.1.4. Dialyse des fractions pures de PcoB ............................................................................... 55
4.1.5. Concentration de PcoB ................................................................................................... 56
4.2. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOA .............................................................. 57
4.2.1. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoA ................................................. 57
4.2.2. Vérification de la purification de PcoA ........................................................................... 58
4.2.3. Dialyse des fractions pures de PcoA ............................................................................... 59
4.2.4. Concentration de PcoA ................................................................................................... 59
4.2.4.1. Première culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (2X 200 ml) ............................................. 59
4.2.4.2. Deuxième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.3. Traitement des précipités issus des cultures précédentes ................................................. 60
4.2.4.4. Troisième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.5. Discussion ........................................................................................................................... 61
4.3. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 62
4.3.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 62
4.3.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse ....................................................... 62
4.3.2.1. Résultats du dosage de la concentration de PcoA ............................................................. 62
4.4. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA ..................................................................................................... 63
4.4.1. Cristal dans la plaque PcoA n°A...................................................................................... 63
4.5. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 64
4.5.1. Nombre de mutants isolés « sensibles » au Cu .............................................................. 64
4.5.2. Analyse de la croissance de la souche CB15N en présence de concentrations croissantes en Cu....... ...................................................................................................................................... 64
4.5.3. Analyse de la croissance des mutants sensibles au Cu en présence de 100 ou 150 μM de Cu………..Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65824 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Exploitation des mécanismes moléculaires de résistance au cuivre chez Caulobacter crescentus / Alexandre Babarakos
Titre : Exploitation des mécanismes moléculaires de résistance au cuivre chez Caulobacter crescentus Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Alexandre Babarakos, Auteur ; Jean-Yves MATROULE, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2020 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Afin d’augmenter leur chance de survie, les bactéries ont développé des mécanismes de réponses adaptatifs face à leur environnement changeant.
Caulobacter cresentus est une bactérie aquatique Gram négatif appartenant à la classe des alphaprotébactéries ayant développé ce genre de mécanismes. Il a été décrit ces dernières années au sein du laboratoire de l’URBM que cette bactérie possédait une stratégie bimodale face au cuivre. En effet, le Cu est un élément essentiel à la vie. Cependant, à de hautes concentrations celui-ci peut devenir toxique et provoquer des stress oxydatifs au sein de la bactérie.
Ainsi, le cycle cellulaire de C. crescentus est caractérisé par une division cellulaire asymétrique générant deux cellules filles morphologiquement et fonctionnellement différentes. La cellule flagellée est capable de fuir le milieu possédant des concentrations en Cu trop élevé quant à la cellule pédonculée elle, se munit d’un système PcoAB lui permettant de réguler sa concentration en Cu intracellulaire.
De nos jours, l’utilisation d’antibiotiques est excessive et souvent mal effectuée et met en danger de nombreuses personnes. C’est pourquoi, ce travail s’inscrit dans un projet visant à diminuer la consommation de ceux-ci au niveau d’un laboratoire de recherches en exploitant les mécanismes moléculaires de résistance au Cu chez C. crescentus afin de construire un plasmide permettant une sélection via cet élément remplaçant celle par les antibiotiques.
L’axe principal de ce travail est consacré à la mutagénèse de la souche sauvage de C. crescentus via différents procédés afin d’obtenir des mutants devenus résistants au Cu et l’utilisation de ceux-ci afin d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans l’homéostasie du Cu et ainsi les exploiter afin d’établir le plasmide permettant la sélection.Note de contenu : Table des matières
Table des matières ______________________________________________________________ 4
Présentation du lieu de stage __________________________________________________ 6
Université de Namur ____________________________________________________________ 6
Unité de recherche en biologie des microorganismes (URBM) ___________________________ 6
Introduction générale ________________________________________________________ 8
1 Contexte général _______________________________________________________ 9
1.1 Le cuivre et son importance dans le monde bactérien ___________________________ 9
1.2 Homéostasie et résistance au cuivre chez les bactéries __________________________ 9
1.3 Caulobacter crescentus ___________________________________________________ 12
1.4 Homéostasie du cuivre dans la cellule pédonculée de C. crescentus _______________ 14
1.5 Les plasmides bactériens _________________________________________________ 14
2 Objectifs et stratégie ___________________________________________________ 18
3 Matériels et méthodes __________________________________________________ 19
3.1 Souches bactériennes et conditions de culture ________________________________ 19
3.2 Plasmides : _____________________________________________________________ 19
3.3 Crible de sensibilité au cuivre ______________________________________________ 20
3.4 Sélection de mutants résistants au Cu _______________________________________ 22
3.5 Construction du plasmide pJS14 oxygénase __________________________________ 25
3.6 Séquençage ____________________________________________________________ 27
4 Résultats _____________________________________________________________ 28
4.1 Sélection de mutants davantage résistants au cuivre ___________________________ 28
4.2 Crible de sensibilité au cuivre chez C. crescentus_______________________________ 35
4.3 Souche sauvage pJS14 oxygénase __________________________________________ 42
5 Discussion ____________________________________________________________ 45
5.1 Crible de sensibilité ______________________________________________________ 45
5.2 Sélection de mutants davantage résistants au Cu ______________________________ 46
5
5.3 Construction d’un plasmide qui pourrait substituer la sélection par les antibiotiques par une sélection au Cu ____________________________________________________________ 48
Conclusion ________________________________________________________________ 50
Bibliographie ______________________________________________________________ 52
Annexes __________________________________________________________________ 62
Annexe sensibilité au Cu ________________________________________________________ 63
Annexes résistance au Cu ________________________________________________________ 66
Annexes construction du plasmide pJS14 oxygénase __________________________________ 70
Annexes McpR ________________________________________________________________ 79Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89121 Exploitation des mécanismes moléculaires de résistance au cuivre chez Caulobacter crescentus [TFE / Mémoire] / Alexandre Babarakos, Auteur ; Jean-Yves MATROULE, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2020.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Afin d’augmenter leur chance de survie, les bactéries ont développé des mécanismes de réponses adaptatifs face à leur environnement changeant.
Caulobacter cresentus est une bactérie aquatique Gram négatif appartenant à la classe des alphaprotébactéries ayant développé ce genre de mécanismes. Il a été décrit ces dernières années au sein du laboratoire de l’URBM que cette bactérie possédait une stratégie bimodale face au cuivre. En effet, le Cu est un élément essentiel à la vie. Cependant, à de hautes concentrations celui-ci peut devenir toxique et provoquer des stress oxydatifs au sein de la bactérie.
Ainsi, le cycle cellulaire de C. crescentus est caractérisé par une division cellulaire asymétrique générant deux cellules filles morphologiquement et fonctionnellement différentes. La cellule flagellée est capable de fuir le milieu possédant des concentrations en Cu trop élevé quant à la cellule pédonculée elle, se munit d’un système PcoAB lui permettant de réguler sa concentration en Cu intracellulaire.
De nos jours, l’utilisation d’antibiotiques est excessive et souvent mal effectuée et met en danger de nombreuses personnes. C’est pourquoi, ce travail s’inscrit dans un projet visant à diminuer la consommation de ceux-ci au niveau d’un laboratoire de recherches en exploitant les mécanismes moléculaires de résistance au Cu chez C. crescentus afin de construire un plasmide permettant une sélection via cet élément remplaçant celle par les antibiotiques.
L’axe principal de ce travail est consacré à la mutagénèse de la souche sauvage de C. crescentus via différents procédés afin d’obtenir des mutants devenus résistants au Cu et l’utilisation de ceux-ci afin d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans l’homéostasie du Cu et ainsi les exploiter afin d’établir le plasmide permettant la sélection.Note de contenu : Table des matières
Table des matières ______________________________________________________________ 4
Présentation du lieu de stage __________________________________________________ 6
Université de Namur ____________________________________________________________ 6
Unité de recherche en biologie des microorganismes (URBM) ___________________________ 6
Introduction générale ________________________________________________________ 8
1 Contexte général _______________________________________________________ 9
1.1 Le cuivre et son importance dans le monde bactérien ___________________________ 9
1.2 Homéostasie et résistance au cuivre chez les bactéries __________________________ 9
1.3 Caulobacter crescentus ___________________________________________________ 12
1.4 Homéostasie du cuivre dans la cellule pédonculée de C. crescentus _______________ 14
1.5 Les plasmides bactériens _________________________________________________ 14
2 Objectifs et stratégie ___________________________________________________ 18
3 Matériels et méthodes __________________________________________________ 19
3.1 Souches bactériennes et conditions de culture ________________________________ 19
3.2 Plasmides : _____________________________________________________________ 19
3.3 Crible de sensibilité au cuivre ______________________________________________ 20
3.4 Sélection de mutants résistants au Cu _______________________________________ 22
3.5 Construction du plasmide pJS14 oxygénase __________________________________ 25
3.6 Séquençage ____________________________________________________________ 27
4 Résultats _____________________________________________________________ 28
4.1 Sélection de mutants davantage résistants au cuivre ___________________________ 28
4.2 Crible de sensibilité au cuivre chez C. crescentus_______________________________ 35
4.3 Souche sauvage pJS14 oxygénase __________________________________________ 42
5 Discussion ____________________________________________________________ 45
5.1 Crible de sensibilité ______________________________________________________ 45
5.2 Sélection de mutants davantage résistants au Cu ______________________________ 46
5
5.3 Construction d’un plasmide qui pourrait substituer la sélection par les antibiotiques par une sélection au Cu ____________________________________________________________ 48
Conclusion ________________________________________________________________ 50
Bibliographie ______________________________________________________________ 52
Annexes __________________________________________________________________ 62
Annexe sensibilité au Cu ________________________________________________________ 63
Annexes résistance au Cu ________________________________________________________ 66
Annexes construction du plasmide pJS14 oxygénase __________________________________ 70
Annexes McpR ________________________________________________________________ 79Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89121 Exemplaires
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