Centre de Documentation Campus Montignies
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Lundi : 8h-18h30
Mardi : 8h-18h30
Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Caractérisation d’inhibiteurs potentiels de l’interaction entre le domaine PWWP de la DNMT3B et le marqueur épigénétique H3K36me3 / Fauve UITTERHAEGEN
Titre : Caractérisation d’inhibiteurs potentiels de l’interaction entre le domaine PWWP de la DNMT3B et le marqueur épigénétique H3K36me3 Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Fauve UITTERHAEGEN, Auteur ; Johan Wouters, Directeur de la recherche Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Université de Namur laboratoire de chimie biologie structurale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage........................................................................................................ 6
Introduction .................................................................................................................................. 7
1. Contexte général ....................................................................................................................... 8
1.1 Chromatine .......................................................................................................................... 8
1.2 Épigénétique ....................................................................................................................... 9
1.2.1 Méthylation de l’ADN ................................................................................................. 10
ADN méthyltransférases ................................................................................................. 11
I Isoformes des DNMTs ............................................................................................... 11
II Structure des DNMTs ............................................................................................... 11
1.2.2 Domaine PWWP ......................................................................................................... 12
1.2.3 Modifications des histones ........................................................................................ 13
1.3 Cancer ................................................................................................................................ 14
1.4 Fonctions de méthylation de l’ADN dans le cancer .......................................................... 15
1.4.1 Répression des gènes suppresseurs de tumeurs ....................................................... 15
1.4.2 Activation d’oncogènes .............................................................................................. 16
Reconnaissance du domaine PWWP de la DNMT3B avec le marqueur épigénétique
H3K36me3 ....................................................................................................................... 17
1.4.3 Inhibiteurs des DNMTs ............................................................................................... 18
2. Objectifs et stratégie ............................................................................................................... 19
3. Principes des techniques ......................................................................................................... 20
3.1 Surexpression du domaine PWWP de la DNMT3B............................................................ 20
3.1.1 Plasmide ..................................................................................................................... 20
3.1.2 Préculture ................................................................................................................... 21
3.1.3 Culture et induction à l’IPTG ...................................................................................... 21
3.2 Purification ........................................................................................................................ 23
3.2.1 Lyse bactérienne ........................................................................................................ 23
3.2.2 Chromatographie d’affinité ........................................................................................ 23
3.2.3 Dialyse et clivage histag ............................................................................................. 25
3.2.4 Chromatographie échangeuse d’ions ........................................................................ 26
3.3 Mesure de la concentration en protéine .......................................................................... 27
3.4 Gel SDS-Page ..................................................................................................................... 28
3.5 Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) ..................................................................... 30
5
3.6 Concentration de la protéine ............................................................................................ 31
3.7 Cristallogenèse .................................................................................................................. 32
3.7.1 Principes ..................................................................................................................... 32
3.8 Récupération des cristaux ................................................................................................. 34
3.9 Synchrotron soleil .............................................................................................................. 35
4. Matériel et Méthodes ............................................................................................................. 37
4.1 Surexpression du domaine PWWP de la DNMT3B............................................................ 37
4.1.1 Préculture ................................................................................................................... 37
4.1.2 Culture et induction à l’IPTG ...................................................................................... 37
4.2. Purification ....................................................................................................................... 38
4.2.1 Lyse bactérienne ........................................................................................................ 38
4.2.2 Chromatographie d’affinité 1 ..................................................................................... 38
4.2.3 Mesure de la concentration en protéine ................................................................... 39
4.2.4 Dialyse et clivage de l’histag ...................................................................................... 39
4.2.5 Chromatographie d’affinité 2 ..................................................................................... 40
4.2.6 Chromatographie échangeuse d’ions ........................................................................ 40
4.3 Gel SDS-Page ..................................................................................................................... 40
4.4 Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) ..................................................................... 41
4.5 Cristallographie ................................................................................................................. 42
4.5.1 Concentration de la protéine ..................................................................................... 42
4.5.2 Conditions cristallographiques ................................................................................... 42
4.5.2.a Essais réalisés dans des boîtes 24 puits............................................................... 42
4.5.2.b Essais réalisés dans des plaques 96 puits ............................................................ 43
4.5.3 Récupération des cristaux .......................................................................................... 44
5. Résultats et discussion ............................................................................................................ 45
5.1 Surexpression du domaine PWWP de la DNMT3B............................................................ 45
5.2 Purification ........................................................................................................................ 46
5.3 Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) ..................................................................... 51
5.4 Cristallogenèse .................................................................................................................. 57
5.5 Récupération des cristaux ................................................................................................. 60
Conclusion ................................................................................................................................... 63
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65860 Caractérisation d’inhibiteurs potentiels de l’interaction entre le domaine PWWP de la DNMT3B et le marqueur épigénétique H3K36me3 [TFE / Mémoire] / Fauve UITTERHAEGEN, Auteur ; Johan Wouters, Directeur de la recherche . - 2017.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Université de Namur laboratoire de chimie biologie structurale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage........................................................................................................ 6
Introduction .................................................................................................................................. 7
1. Contexte général ....................................................................................................................... 8
1.1 Chromatine .......................................................................................................................... 8
1.2 Épigénétique ....................................................................................................................... 9
1.2.1 Méthylation de l’ADN ................................................................................................. 10
ADN méthyltransférases ................................................................................................. 11
I Isoformes des DNMTs ............................................................................................... 11
II Structure des DNMTs ............................................................................................... 11
1.2.2 Domaine PWWP ......................................................................................................... 12
1.2.3 Modifications des histones ........................................................................................ 13
1.3 Cancer ................................................................................................................................ 14
1.4 Fonctions de méthylation de l’ADN dans le cancer .......................................................... 15
1.4.1 Répression des gènes suppresseurs de tumeurs ....................................................... 15
1.4.2 Activation d’oncogènes .............................................................................................. 16
Reconnaissance du domaine PWWP de la DNMT3B avec le marqueur épigénétique
H3K36me3 ....................................................................................................................... 17
1.4.3 Inhibiteurs des DNMTs ............................................................................................... 18
2. Objectifs et stratégie ............................................................................................................... 19
3. Principes des techniques ......................................................................................................... 20
3.1 Surexpression du domaine PWWP de la DNMT3B............................................................ 20
3.1.1 Plasmide ..................................................................................................................... 20
3.1.2 Préculture ................................................................................................................... 21
3.1.3 Culture et induction à l’IPTG ...................................................................................... 21
3.2 Purification ........................................................................................................................ 23
3.2.1 Lyse bactérienne ........................................................................................................ 23
3.2.2 Chromatographie d’affinité ........................................................................................ 23
3.2.3 Dialyse et clivage histag ............................................................................................. 25
3.2.4 Chromatographie échangeuse d’ions ........................................................................ 26
3.3 Mesure de la concentration en protéine .......................................................................... 27
3.4 Gel SDS-Page ..................................................................................................................... 28
3.5 Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) ..................................................................... 30
5
3.6 Concentration de la protéine ............................................................................................ 31
3.7 Cristallogenèse .................................................................................................................. 32
3.7.1 Principes ..................................................................................................................... 32
3.8 Récupération des cristaux ................................................................................................. 34
3.9 Synchrotron soleil .............................................................................................................. 35
4. Matériel et Méthodes ............................................................................................................. 37
4.1 Surexpression du domaine PWWP de la DNMT3B............................................................ 37
4.1.1 Préculture ................................................................................................................... 37
4.1.2 Culture et induction à l’IPTG ...................................................................................... 37
4.2. Purification ....................................................................................................................... 38
4.2.1 Lyse bactérienne ........................................................................................................ 38
4.2.2 Chromatographie d’affinité 1 ..................................................................................... 38
4.2.3 Mesure de la concentration en protéine ................................................................... 39
4.2.4 Dialyse et clivage de l’histag ...................................................................................... 39
4.2.5 Chromatographie d’affinité 2 ..................................................................................... 40
4.2.6 Chromatographie échangeuse d’ions ........................................................................ 40
4.3 Gel SDS-Page ..................................................................................................................... 40
4.4 Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) ..................................................................... 41
4.5 Cristallographie ................................................................................................................. 42
4.5.1 Concentration de la protéine ..................................................................................... 42
4.5.2 Conditions cristallographiques ................................................................................... 42
4.5.2.a Essais réalisés dans des boîtes 24 puits............................................................... 42
4.5.2.b Essais réalisés dans des plaques 96 puits ............................................................ 43
4.5.3 Récupération des cristaux .......................................................................................... 44
5. Résultats et discussion ............................................................................................................ 45
5.1 Surexpression du domaine PWWP de la DNMT3B............................................................ 45
5.2 Purification ........................................................................................................................ 46
5.3 Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) ..................................................................... 51
5.4 Cristallogenèse .................................................................................................................. 57
5.5 Récupération des cristaux ................................................................................................. 60
Conclusion ................................................................................................................................... 63
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65860 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire
Titre : Concentré de chimie Type de document : texte imprimé Auteurs : Johan Wouters, Auteur Mention d'édition : 2e édition [corrigée] Année de publication : DL 2015, cop. 2015 Importance : 1 vol. (X-398 p.) Présentation : ill. en coul., couv. ill. en coul. Format : 24 cm ISBN/ISSN/EAN : 978-2-87037-889-2 Mots-clés : Chimie -- Manuels d'enseignement supérieur Index. décimale : 54 Chimie Résumé : Cette seconde édition de « Concentré de Chimie » est un support fiable et révisé pour l'apprentissage de cette discipline fascinante qu'est la chimie. Il s'adresse à l'étudiant de Baccalauréat des sections scientifiques et médicales abordant la chimie et au futur étudiant qui se destine à des études supérieures dans ces sections.
Le manuel présente, en 10 chapitres, les bases de la chimie générale, de façon rigoureuse, logique et progressive.
Il s'organise en trois parties :
1. La première partie décrit la matière : atomes, molécules, organisations à l'état solide, liquide ou gazeux et en solution ;
2. La seconde partie établit les principes de conservation de la matière et d'énergie qui posent les bases de l'établissement d’équations chimiques pondérées et sous-tendent toute transformation chimique ou physico-chimique. Les facteurs cinétiques qui affectent les vitesses de transformations (bio)chimiques sont également décrits ;
3. La troisième partie passe en revue, en les expliquant, les grandes classes de réactions qui s’observent en solution aqueuse : réactions d’oxydoréduction, acide-base, de précipitation et de complexation. Le support est richement illustré de figures en couleurs qui aident à la compréhension de concepts submicroscopiques. Des compléments d’information replacent certains concepts chimiques dans un contexte concret de la vie quotidienne.
Ce manuel est complété par un site internet : http://concentre-chimie.unamur.be/Note de contenu : Pour aller plus loin : voir le lien Internet En ligne : http://concentre-chimie.unamur.be/ Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65921 Concentré de chimie [texte imprimé] / Johan Wouters, Auteur . - 2e édition [corrigée] . - DL 2015, cop. 2015 . - 1 vol. (X-398 p.) : ill. en coul., couv. ill. en coul. ; 24 cm.
ISBN : 978-2-87037-889-2
Mots-clés : Chimie -- Manuels d'enseignement supérieur Index. décimale : 54 Chimie Résumé : Cette seconde édition de « Concentré de Chimie » est un support fiable et révisé pour l'apprentissage de cette discipline fascinante qu'est la chimie. Il s'adresse à l'étudiant de Baccalauréat des sections scientifiques et médicales abordant la chimie et au futur étudiant qui se destine à des études supérieures dans ces sections.
Le manuel présente, en 10 chapitres, les bases de la chimie générale, de façon rigoureuse, logique et progressive.
Il s'organise en trois parties :
1. La première partie décrit la matière : atomes, molécules, organisations à l'état solide, liquide ou gazeux et en solution ;
2. La seconde partie établit les principes de conservation de la matière et d'énergie qui posent les bases de l'établissement d’équations chimiques pondérées et sous-tendent toute transformation chimique ou physico-chimique. Les facteurs cinétiques qui affectent les vitesses de transformations (bio)chimiques sont également décrits ;
3. La troisième partie passe en revue, en les expliquant, les grandes classes de réactions qui s’observent en solution aqueuse : réactions d’oxydoréduction, acide-base, de précipitation et de complexation. Le support est richement illustré de figures en couleurs qui aident à la compréhension de concepts submicroscopiques. Des compléments d’information replacent certains concepts chimiques dans un contexte concret de la vie quotidienne.
Ce manuel est complété par un site internet : http://concentre-chimie.unamur.be/Note de contenu : Pour aller plus loin : voir le lien Internet En ligne : http://concentre-chimie.unamur.be/ Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65921 Réservation
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Cote Support Localisation Section Disponibilité 54 WOU C Livre Centre de Documentation HELHa Campus Montignies Etagères livres Disponible
DisponibleÉtude de l’effet de l’acide 2-amino-3- phosphonoproprionique et de l’acide 2-amino-4- phosphonobutyrique sur la phosphosérine phosphatase de Brucella melitensis / Laurine Boidequin
Titre : Étude de l’effet de l’acide 2-amino-3- phosphonoproprionique et de l’acide 2-amino-4- phosphonobutyrique sur la phosphosérine phosphatase de Brucella melitensis Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Laurine Boidequin ; Johan Wouters, Promoteur du mémoire ; Jérôme Cornil, Promoteur du mémoire ; Tanguy Scaillet, Promoteur du mémoire Editeur : Montignies-sur-Sambre : Haute Ecole Louvain en Hainaut Année de publication : 2023 Importance : 64p. Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur . Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Ce travail porte sur l’étude de deux molécules : l’acide 2-amino-3- phosphonoproprionique et l’acide 2-amino-4-phosphonobutyrique afin d’empêcher la synthèse de la L-sérine par la phosphosérine phosphatase de Brucella melitensis,
En effet, cette bactérie représente un problème de santé publique majeur dans les pays en voie de développement. Elle est responsable de la brucellose, communément appelée, la fièvre de Malte. Cette maladie atteint majoritairement les chèvres et les brebis mais peut être transmise à l’homme via des produits laitiers contaminées et non pasteurisés.
Lors de précédents travaux, il a été démontré que la L-sérine est indispensable à la prolifération de la bactérie dans les cellules de son hôte, et c’est la raison pour laquelle la phosphosérine phosphatase a été définie comme cible afin de trouver une molécule capable de l’empêcher de remplir son rôle, et ainsi de trouver un traitement contre cette maladie.Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=114739 Étude de l’effet de l’acide 2-amino-3- phosphonoproprionique et de l’acide 2-amino-4- phosphonobutyrique sur la phosphosérine phosphatase de Brucella melitensis [TFE / Mémoire] / Laurine Boidequin ; Johan Wouters, Promoteur du mémoire ; Jérôme Cornil, Promoteur du mémoire ; Tanguy Scaillet, Promoteur du mémoire . - Montignies-sur-Sambre : Haute Ecole Louvain en Hainaut, 2023 . - 64p.
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Langues : Français (fre)
Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Ce travail porte sur l’étude de deux molécules : l’acide 2-amino-3- phosphonoproprionique et l’acide 2-amino-4-phosphonobutyrique afin d’empêcher la synthèse de la L-sérine par la phosphosérine phosphatase de Brucella melitensis,
En effet, cette bactérie représente un problème de santé publique majeur dans les pays en voie de développement. Elle est responsable de la brucellose, communément appelée, la fièvre de Malte. Cette maladie atteint majoritairement les chèvres et les brebis mais peut être transmise à l’homme via des produits laitiers contaminées et non pasteurisés.
Lors de précédents travaux, il a été démontré que la L-sérine est indispensable à la prolifération de la bactérie dans les cellules de son hôte, et c’est la raison pour laquelle la phosphosérine phosphatase a été définie comme cible afin de trouver une molécule capable de l’empêcher de remplir son rôle, et ainsi de trouver un traitement contre cette maladie.Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=114739 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etude des mécanismes de résistance de Caulobacter crescentus au cuivre / Esma ALPAN
Titre : Etude des mécanismes de résistance de Caulobacter crescentus au cuivre Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Esma ALPAN, Auteur ; Jean-Yves MATROULE, Directeur de la recherche ; Johan Wouters, Directeur de la recherche Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Université de Namur département de biologie. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
REMERCIEMENTS
PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE
INTRODUCTION ............................................................................................................................... 13
1. CONTEXTE THÉORIQUE ........................................................................................................... 15
1.1. CAULOBACTER CRESCENTUS ....................................................................................................... 15
1.1.1. Généralités ..................................................................................................................... 15
1.1.2. Cycle de vie ..................................................................................................................... 15
1.2. LE CUIVRE, UN ÉLÉMENT ESSENTIEL .............................................................................................. 16
1.2.1. Distribution du Cu ........................................................................................................... 16
1.2.2. Toxicité du Cu à haute concentration ............................................................................. 18
1.2.3. Utilisation antérieure ..................................................................................................... 18
1.3. MÉCANISMES DE RÉSISTANCE FACE AU CU CHEZ LES BACTÉRIES ......................................................... 19
1.3.1. Pénétration ..................................................................................................................... 19
1.3.2. Prise en charge – Résistance .......................................................................................... 19
1.3.2.1. Système « Cue » ................................................................................................................. 20
1.3.2.2. Système « Cus » ................................................................................................................. 21
1.3.2.3. Système « Pco » ................................................................................................................. 22
1.3.2.4. Système « Cut » .................................................................................................................. 24
1.3.3. Séquestration du Cu ....................................................................................................... 24
1.3.4. Limitation de l’utilisation du Cu...................................................................................... 24
1.4. PATHOLOGIES LIÉES AU CU CHEZ L’HOMME ................................................................................... 25
1.5. RÉPONSE DE C. CRESCENTUS AU CU ............................................................................................. 25
2. OBJECTIFS ET STRATÉGIES ...................................................................................................... 27
3. MATÉRIEL ET MÉTHODES ........................................................................................................ 29
3.1. PRODUCTION ET PURIFICATION DE PCOA ET PCOB .......................................................................... 29
3.1.1. Expression dans la souche BL21 d’E. coli ........................................................................ 29
3.1.2. Plasmide vecteur pET24b ............................................................................................... 29
3.1.2.1. Région Multiple Cloning Site (MCS) .................................................................................... 30
3.1.2.2. Opérateur lac ..................................................................................................................... 30
3.1.2.3. His-tag de PcoA et PcoB ..................................................................................................... 30
3.1.2.4. Sélection à la kanamycine .................................................................................................. 30
3.1.3. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 30
3.1.3.1. Extraction du plasmide pET24b-PcoB « Miniprep » ........................................................... 31
3.1.3.2. Electroporation à partir des souches BL21 et DH10B-pET24b-PcoB .................................. 31
3.1.3.3. PCR des colonies BL21-pET24b-PcoB.................................................................................. 32
3.1.3.4. Migration des résultats de la PCR sur gel d’agarose .......................................................... 33
3.1.4. Surexpression de BL21-pET24b-PcoA et BL21-pET24b-PcoB .......................................... 33
3.1.4.1. Composition du milieu LB................................................................................................... 33
3.1.4.2. Courbe de croissance : mesure D.O. .................................................................................. 33
3.1.4.3. Cultures LB-Kan à petit volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB .................. 34
3.1.4.4. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à petit volume ..... 34
3.1.4.5. Cultures LB-Kan à grand volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB ................ 36
3.1.4.6. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à grand volume ... 36
3.1.5. Purification de PcoA ou PcoB ......................................................................................... 37
3.1.5.1. Première étape de la purification – Traitement à la guanidine 6 M ................................... 37
3.1.5.2. Deuxième étape de la purification – Chromatographie d’affinité ...................................... 38
3.1.5.3. Vérification de la purification de PcoA ou PcoB sur gel SDS-PAGE ..................................... 39
3.1.6. Dialyse de PcoA ou PcoB ................................................................................................ 39
3.1.7. Concentration de PcoA ou PcoB ..................................................................................... 40
3.2. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 42
3.2.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 42
3.2.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse de PcoA ......................................... 42
3.3. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA OU PCOB ........................................................................................ 43
3.3.1. Principe ........................................................................................................................... 43
3.3.2. Méthode ......................................................................................................................... 44
3.3.2.1. Préparation des plaques pour la cristallogenèse ............................................................... 45
3.3.2.2. Observation des plaques au microscope ............................................................................ 45
3.4. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 46
3.4.1. Caractéristiques de la souche sauvage de C. crescentus ................................................ 46
3.4.2. Caractéristiques de la souche E. coli Tn5 ........................................................................ 46
3.4.3. Particularité de la souche C. crescentus ΔAB ................................................................. 46
3.4.4. Composition du milieu PYE (HIGG) ................................................................................. 46
3.4.5. Création des mutants de C. crescentus .......................................................................... 47
3.4.6. Isolement de mutants de C. crescentus sensibles au Cu ................................................. 48
3.4.7. Analyse de la croissance cellulaire en présence de Cu ................................................... 48
3.4.7.1. Croissance de la souche CB15N en présence de Cu ........................................................... 48
3.4.7.2. Croissance de mutants sensibles au Cu en présence de Cu ............................................... 49
4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS ................................................................................................... 51
4.1. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOB .............................................................. 51
4.1.1. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 51
4.1.2. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoB .................................................. 53
4.1.3. Vérification de la purification de PcoB ........................................................................... 54
4.1.4. Dialyse des fractions pures de PcoB ............................................................................... 55
4.1.5. Concentration de PcoB ................................................................................................... 56
4.2. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOA .............................................................. 57
4.2.1. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoA ................................................. 57
4.2.2. Vérification de la purification de PcoA ........................................................................... 58
4.2.3. Dialyse des fractions pures de PcoA ............................................................................... 59
4.2.4. Concentration de PcoA ................................................................................................... 59
4.2.4.1. Première culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (2X 200 ml) ............................................. 59
4.2.4.2. Deuxième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.3. Traitement des précipités issus des cultures précédentes ................................................. 60
4.2.4.4. Troisième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.5. Discussion ........................................................................................................................... 61
4.3. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 62
4.3.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 62
4.3.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse ....................................................... 62
4.3.2.1. Résultats du dosage de la concentration de PcoA ............................................................. 62
4.4. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA ..................................................................................................... 63
4.4.1. Cristal dans la plaque PcoA n°A...................................................................................... 63
4.5. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 64
4.5.1. Nombre de mutants isolés « sensibles » au Cu .............................................................. 64
4.5.2. Analyse de la croissance de la souche CB15N en présence de concentrations croissantes en Cu....... ...................................................................................................................................... 64
4.5.3. Analyse de la croissance des mutants sensibles au Cu en présence de 100 ou 150 μM de Cu………..Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65824 Etude des mécanismes de résistance de Caulobacter crescentus au cuivre [TFE / Mémoire] / Esma ALPAN, Auteur ; Jean-Yves MATROULE, Directeur de la recherche ; Johan Wouters, Directeur de la recherche . - 2017.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Université de Namur département de biologie. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
REMERCIEMENTS
PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE
INTRODUCTION ............................................................................................................................... 13
1. CONTEXTE THÉORIQUE ........................................................................................................... 15
1.1. CAULOBACTER CRESCENTUS ....................................................................................................... 15
1.1.1. Généralités ..................................................................................................................... 15
1.1.2. Cycle de vie ..................................................................................................................... 15
1.2. LE CUIVRE, UN ÉLÉMENT ESSENTIEL .............................................................................................. 16
1.2.1. Distribution du Cu ........................................................................................................... 16
1.2.2. Toxicité du Cu à haute concentration ............................................................................. 18
1.2.3. Utilisation antérieure ..................................................................................................... 18
1.3. MÉCANISMES DE RÉSISTANCE FACE AU CU CHEZ LES BACTÉRIES ......................................................... 19
1.3.1. Pénétration ..................................................................................................................... 19
1.3.2. Prise en charge – Résistance .......................................................................................... 19
1.3.2.1. Système « Cue » ................................................................................................................. 20
1.3.2.2. Système « Cus » ................................................................................................................. 21
1.3.2.3. Système « Pco » ................................................................................................................. 22
1.3.2.4. Système « Cut » .................................................................................................................. 24
1.3.3. Séquestration du Cu ....................................................................................................... 24
1.3.4. Limitation de l’utilisation du Cu...................................................................................... 24
1.4. PATHOLOGIES LIÉES AU CU CHEZ L’HOMME ................................................................................... 25
1.5. RÉPONSE DE C. CRESCENTUS AU CU ............................................................................................. 25
2. OBJECTIFS ET STRATÉGIES ...................................................................................................... 27
3. MATÉRIEL ET MÉTHODES ........................................................................................................ 29
3.1. PRODUCTION ET PURIFICATION DE PCOA ET PCOB .......................................................................... 29
3.1.1. Expression dans la souche BL21 d’E. coli ........................................................................ 29
3.1.2. Plasmide vecteur pET24b ............................................................................................... 29
3.1.2.1. Région Multiple Cloning Site (MCS) .................................................................................... 30
3.1.2.2. Opérateur lac ..................................................................................................................... 30
3.1.2.3. His-tag de PcoA et PcoB ..................................................................................................... 30
3.1.2.4. Sélection à la kanamycine .................................................................................................. 30
3.1.3. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 30
3.1.3.1. Extraction du plasmide pET24b-PcoB « Miniprep » ........................................................... 31
3.1.3.2. Electroporation à partir des souches BL21 et DH10B-pET24b-PcoB .................................. 31
3.1.3.3. PCR des colonies BL21-pET24b-PcoB.................................................................................. 32
3.1.3.4. Migration des résultats de la PCR sur gel d’agarose .......................................................... 33
3.1.4. Surexpression de BL21-pET24b-PcoA et BL21-pET24b-PcoB .......................................... 33
3.1.4.1. Composition du milieu LB................................................................................................... 33
3.1.4.2. Courbe de croissance : mesure D.O. .................................................................................. 33
3.1.4.3. Cultures LB-Kan à petit volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB .................. 34
3.1.4.4. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à petit volume ..... 34
3.1.4.5. Cultures LB-Kan à grand volume de BL21-pET24b-PcoA ou BL21-pET24b-PcoB ................ 36
3.1.4.6. Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction de PcoA ou PcoB à l’IPTG à grand volume ... 36
3.1.5. Purification de PcoA ou PcoB ......................................................................................... 37
3.1.5.1. Première étape de la purification – Traitement à la guanidine 6 M ................................... 37
3.1.5.2. Deuxième étape de la purification – Chromatographie d’affinité ...................................... 38
3.1.5.3. Vérification de la purification de PcoA ou PcoB sur gel SDS-PAGE ..................................... 39
3.1.6. Dialyse de PcoA ou PcoB ................................................................................................ 39
3.1.7. Concentration de PcoA ou PcoB ..................................................................................... 40
3.2. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 42
3.2.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 42
3.2.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse de PcoA ......................................... 42
3.3. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA OU PCOB ........................................................................................ 43
3.3.1. Principe ........................................................................................................................... 43
3.3.2. Méthode ......................................................................................................................... 44
3.3.2.1. Préparation des plaques pour la cristallogenèse ............................................................... 45
3.3.2.2. Observation des plaques au microscope ............................................................................ 45
3.4. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 46
3.4.1. Caractéristiques de la souche sauvage de C. crescentus ................................................ 46
3.4.2. Caractéristiques de la souche E. coli Tn5 ........................................................................ 46
3.4.3. Particularité de la souche C. crescentus ΔAB ................................................................. 46
3.4.4. Composition du milieu PYE (HIGG) ................................................................................. 46
3.4.5. Création des mutants de C. crescentus .......................................................................... 47
3.4.6. Isolement de mutants de C. crescentus sensibles au Cu ................................................. 48
3.4.7. Analyse de la croissance cellulaire en présence de Cu ................................................... 48
3.4.7.1. Croissance de la souche CB15N en présence de Cu ........................................................... 48
3.4.7.2. Croissance de mutants sensibles au Cu en présence de Cu ............................................... 49
4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS ................................................................................................... 51
4.1. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOB .............................................................. 51
4.1.1. Formation d’une souche BL21-pET24b-PcoB .................................................................. 51
4.1.2. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoB .................................................. 53
4.1.3. Vérification de la purification de PcoB ........................................................................... 54
4.1.4. Dialyse des fractions pures de PcoB ............................................................................... 55
4.1.5. Concentration de PcoB ................................................................................................... 56
4.2. PRODUCTION, PURIFICATION ET CRISTALLISATION DE PCOA .............................................................. 57
4.2.1. Vérification de la surexpression de BL21-pET24b-PcoA ................................................. 57
4.2.2. Vérification de la purification de PcoA ........................................................................... 58
4.2.3. Dialyse des fractions pures de PcoA ............................................................................... 59
4.2.4. Concentration de PcoA ................................................................................................... 59
4.2.4.1. Première culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (2X 200 ml) ............................................. 59
4.2.4.2. Deuxième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.3. Traitement des précipités issus des cultures précédentes ................................................. 60
4.2.4.4. Troisième culture LB-Kan de BL21-pET24b-PcoA (4X 250 ml) ............................................ 60
4.2.4.5. Discussion ........................................................................................................................... 61
4.3. OPTIMISATION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL .............................................................................. 62
4.3.1. Tests tampons phosphate salés après la lyse cellulaire ................................................. 62
4.3.2. Tests des tampons phosphate salés pour la dialyse ....................................................... 62
4.3.2.1. Résultats du dosage de la concentration de PcoA ............................................................. 62
4.4. CRISTALLOGRAPHIE DE PCOA ..................................................................................................... 63
4.4.1. Cristal dans la plaque PcoA n°A...................................................................................... 63
4.5. MUTAGENÈSE ......................................................................................................................... 64
4.5.1. Nombre de mutants isolés « sensibles » au Cu .............................................................. 64
4.5.2. Analyse de la croissance de la souche CB15N en présence de concentrations croissantes en Cu....... ...................................................................................................................................... 64
4.5.3. Analyse de la croissance des mutants sensibles au Cu en présence de 100 ou 150 μM de Cu………..Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65824 Exemplaires
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