Centre de Documentation Campus Montignies
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Lundi : 8h-18h30
Mardi : 8h-18h30
Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Mise au point de méthodes relatives à l'étude de la réparation de l'ADN chez le rotifère Adineta vaga / Alexia MARY
Titre : Mise au point de méthodes relatives à l'étude de la réparation de l'ADN chez le rotifère Adineta vaga Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Alexia MARY, Auteur ; Matthieu TERWAGNE, Directeur de la recherche Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Université de Namur Laboratoire d'écologie et de génétique évolutive. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage ......................................................................................... 13
Introduction .................................................................................................................... 15
Contexte général ............................................................................................................. 17
I. Les rotifères ......................................................................................................... 17
II. Taxonomie des rotifères ..................................................................................... 18
III. Morphologie d’un rotifère bdelloïde .................................................................. 21
IV. Quelques millions d’années de reproduction asexuée....................................... 24
V. Adineta vaga, porteur d’un génome particulier ................................................. 26
a. Structure particulière du génome .................................................................... 26
b. Conversion génique et transfert horizontal de gènes ..................................... 27
VI. Capacité de résistance à la dessiccation et aux irradiations ionisantes ............. 28
a. Capacité de résistance ..................................................................................... 28
b. Effets sur le génome......................................................................................... 29
VII. Mécanismes de réparation de l'ADN .................................................................. 31
Objectifs et stratégies ..................................................................................................... 37
Matériel et méthodes ..................................................................................................... 39
I. Culture, récolte et dénombrement des rotifères bdelloïdes Adineta vaga ....... 39
a. Culture du rotifère bdelloïde Adineta vaga ..................................................... 39
b. Culture de rotifères bdelloïde Adineta vaga marqués constitutivement au 5-
ethynyl-2′-deoxycytidine (EdC) ................................................................................ 39
c. Récolte des rotifères A. vaga ........................................................................... 39
d. Dénombrement des rotifères A. vaga ............................................................. 40
II. Milieux, tampons et solutions............................................................................. 40
a. Eau de source naturelle de Spa© .................................................................... 40
b. Extraits de laitue autoclavés ............................................................................ 40
c. Tampons et solutions ....................................................................................... 41
i. Solutions et tampons pour l'immunofluorescence et gel d'électrophorèse41
ii. Solutions et tampons d'extraction des noyaux d'A.vaga ............................ 42
iii. Tampon de lyse pour l'extraction protéique totale de cellules humaines .. 43
iv. Solutions et tampons pour le Western Blot ................................................ 44
III. Dessiccation de rotifères bdelloides A. vaga ...................................................... 45
IV. Irradiations ionisantes aux protons des rotifères bdelloïdes A. vaga ................ 45
V. Microscopie ......................................................................................................... 46
a. Observation d'A. vaga en microscopie optique classique .............................. 46
b. Observation d'A. vaga en microscopie à fluorescence .................................... 46
i. Préparation des lames ................................................................................. 46
ii. Caractéristiques des microscopes utilisés ................................................... 48
VI. Cytométrie en flux ............................................................................................... 48
a. Préparation des échantillons ........................................................................... 48
b. Analyse des échantillons .................................................................................. 49
VII. Western Blot ....................................................................................................... 50
a. Extraction des protéines de A. vaga ................................................................ 50
b. Extraction des protéines de cellules humaines A549 ...................................... 50
c. Dosage des protéines ....................................................................................... 51
d. Migration des protéines et transfert sur la membrane ................................... 51
e. Immunodétection ............................................................................................ 52
f. Révélation ........................................................................................................ 52
g. Renouvellement de la membrane.................................................................... 53
VIII. Ensemencement et isolement des bactéries contenues dans les cultures des
rotifères ....................................................................................................................... 53
IX. Polymerase chain reaction .................................................................................. 53
a. Lyse des bactéries ............................................................................................ 54
b. MIX PCR pour amplification d'un fragment du gène de l'ARNr 16s des
bactéries .................................................................................................................. 54
c. Programme du thermocycleur ......................................................................... 55
d. Electrophorèse sur gel d'agarose ..................................................................... 55
Résultats et discussions .................................................................................................. 57
I. Analyses du contenu en ADN des noyaux du rotifère A. vaga par cytométrie en
flux ............................................................................................................................57
a. Mise au point d'une méthode d'extraction des noyaux d'A. vaga et de
l'analyse par cytométrie en flux .............................................................................. 57
b. Détermination du contenu en ADN des différents pics observés ................... 62
c. Détermination du profil de rotifères ayant subit différents stress ................. 64
d. Détection de l'incorporation du 5-ethynyl-2′-deoxycytidine (EdC) dans l’ADN
du rotifère bdelloïde A. vaga................................................................................... 65
i. Vérification de l'intégration de l'analogue .................................................. 66
ii. Mise au point du protocole de détection de l'incorporation de l'EdC dans le
génome des rotifères par cytométrie en flux ..................................................... 68
II. Sélection d’anticorps dirigés contre les protéines impliquées dans les voies de
réparation de cassures double brin de l’ADN. ............................................................ 73
a. Sélection de l'anticorps anti-α-tubuline ........................................................... 73
i. Immunolocalisation de la tubuline chez le rotifère ..................................... 74
ii. Mise au point de l'utilisation des anticorps primaires et secondaires en
immunofluorescence .......................................................................................... 75
b. Protéines provenant de cellules humaines A549 ............................................ 75
c. Sélection des anticorps anti Rad51 et anti Ku70 ............................................ 76
III. Identification des bactéries présentes dans les cultures du rotifère A. vaga .... 81
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65843 Mise au point de méthodes relatives à l'étude de la réparation de l'ADN chez le rotifère Adineta vaga [TFE / Mémoire] / Alexia MARY, Auteur ; Matthieu TERWAGNE, Directeur de la recherche . - 2017.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Université de Namur Laboratoire d'écologie et de génétique évolutive. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage ......................................................................................... 13
Introduction .................................................................................................................... 15
Contexte général ............................................................................................................. 17
I. Les rotifères ......................................................................................................... 17
II. Taxonomie des rotifères ..................................................................................... 18
III. Morphologie d’un rotifère bdelloïde .................................................................. 21
IV. Quelques millions d’années de reproduction asexuée....................................... 24
V. Adineta vaga, porteur d’un génome particulier ................................................. 26
a. Structure particulière du génome .................................................................... 26
b. Conversion génique et transfert horizontal de gènes ..................................... 27
VI. Capacité de résistance à la dessiccation et aux irradiations ionisantes ............. 28
a. Capacité de résistance ..................................................................................... 28
b. Effets sur le génome......................................................................................... 29
VII. Mécanismes de réparation de l'ADN .................................................................. 31
Objectifs et stratégies ..................................................................................................... 37
Matériel et méthodes ..................................................................................................... 39
I. Culture, récolte et dénombrement des rotifères bdelloïdes Adineta vaga ....... 39
a. Culture du rotifère bdelloïde Adineta vaga ..................................................... 39
b. Culture de rotifères bdelloïde Adineta vaga marqués constitutivement au 5-
ethynyl-2′-deoxycytidine (EdC) ................................................................................ 39
c. Récolte des rotifères A. vaga ........................................................................... 39
d. Dénombrement des rotifères A. vaga ............................................................. 40
II. Milieux, tampons et solutions............................................................................. 40
a. Eau de source naturelle de Spa© .................................................................... 40
b. Extraits de laitue autoclavés ............................................................................ 40
c. Tampons et solutions ....................................................................................... 41
i. Solutions et tampons pour l'immunofluorescence et gel d'électrophorèse41
ii. Solutions et tampons d'extraction des noyaux d'A.vaga ............................ 42
iii. Tampon de lyse pour l'extraction protéique totale de cellules humaines .. 43
iv. Solutions et tampons pour le Western Blot ................................................ 44
III. Dessiccation de rotifères bdelloides A. vaga ...................................................... 45
IV. Irradiations ionisantes aux protons des rotifères bdelloïdes A. vaga ................ 45
V. Microscopie ......................................................................................................... 46
a. Observation d'A. vaga en microscopie optique classique .............................. 46
b. Observation d'A. vaga en microscopie à fluorescence .................................... 46
i. Préparation des lames ................................................................................. 46
ii. Caractéristiques des microscopes utilisés ................................................... 48
VI. Cytométrie en flux ............................................................................................... 48
a. Préparation des échantillons ........................................................................... 48
b. Analyse des échantillons .................................................................................. 49
VII. Western Blot ....................................................................................................... 50
a. Extraction des protéines de A. vaga ................................................................ 50
b. Extraction des protéines de cellules humaines A549 ...................................... 50
c. Dosage des protéines ....................................................................................... 51
d. Migration des protéines et transfert sur la membrane ................................... 51
e. Immunodétection ............................................................................................ 52
f. Révélation ........................................................................................................ 52
g. Renouvellement de la membrane.................................................................... 53
VIII. Ensemencement et isolement des bactéries contenues dans les cultures des
rotifères ....................................................................................................................... 53
IX. Polymerase chain reaction .................................................................................. 53
a. Lyse des bactéries ............................................................................................ 54
b. MIX PCR pour amplification d'un fragment du gène de l'ARNr 16s des
bactéries .................................................................................................................. 54
c. Programme du thermocycleur ......................................................................... 55
d. Electrophorèse sur gel d'agarose ..................................................................... 55
Résultats et discussions .................................................................................................. 57
I. Analyses du contenu en ADN des noyaux du rotifère A. vaga par cytométrie en
flux ............................................................................................................................57
a. Mise au point d'une méthode d'extraction des noyaux d'A. vaga et de
l'analyse par cytométrie en flux .............................................................................. 57
b. Détermination du contenu en ADN des différents pics observés ................... 62
c. Détermination du profil de rotifères ayant subit différents stress ................. 64
d. Détection de l'incorporation du 5-ethynyl-2′-deoxycytidine (EdC) dans l’ADN
du rotifère bdelloïde A. vaga................................................................................... 65
i. Vérification de l'intégration de l'analogue .................................................. 66
ii. Mise au point du protocole de détection de l'incorporation de l'EdC dans le
génome des rotifères par cytométrie en flux ..................................................... 68
II. Sélection d’anticorps dirigés contre les protéines impliquées dans les voies de
réparation de cassures double brin de l’ADN. ............................................................ 73
a. Sélection de l'anticorps anti-α-tubuline ........................................................... 73
i. Immunolocalisation de la tubuline chez le rotifère ..................................... 74
ii. Mise au point de l'utilisation des anticorps primaires et secondaires en
immunofluorescence .......................................................................................... 75
b. Protéines provenant de cellules humaines A549 ............................................ 75
c. Sélection des anticorps anti Rad51 et anti Ku70 ............................................ 76
III. Identification des bactéries présentes dans les cultures du rotifère A. vaga .... 81
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65843 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Mise au point d’un modèle de reconnaissance d’antigène tumoral chez la souris / MARINE DELPORTE
Titre : Mise au point d’un modèle de reconnaissance d’antigène tumoral chez la souris Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : MARINE DELPORTE, Année de publication : 2016 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Biologie médicale ULB IMI antigène tumoral immunologie défenses non spécifiques défenses spécifiques lymphocyte T lymphopoïèse TCR CD3 activation des lymphocytes cellule présentatrice d'antigène CMH costimulation cellules T effectrices Th1 Th2 Th17 Treg Thf mémoire immunitaire immunologie anti-tumorale génotypage ADN PCR électrophorèse Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65669 Mise au point d’un modèle de reconnaissance d’antigène tumoral chez la souris [TFE / Mémoire] / MARINE DELPORTE, . - 2016.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : Biologie médicale ULB IMI antigène tumoral immunologie défenses non spécifiques défenses spécifiques lymphocyte T lymphopoïèse TCR CD3 activation des lymphocytes cellule présentatrice d'antigène CMH costimulation cellules T effectrices Th1 Th2 Th17 Treg Thf mémoire immunitaire immunologie anti-tumorale génotypage ADN PCR électrophorèse Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65669 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Mise au point et optimisation d’une méthode d’extraction sur culture cellulaire permettant l’analyse métabonomique des intermédiaires du cycle de krebs par spectrométrie de résonance magnétique nucléaire du proton / Sarah Storder
Titre : Mise au point et optimisation d’une méthode d’extraction sur culture cellulaire permettant l’analyse métabonomique des intermédiaires du cycle de krebs par spectrométrie de résonance magnétique nucléaire du proton Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Sarah Storder, Auteur ; J-M Colet, Directeur de la recherche Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Université de Mons laboratoire de biologie humaine et toxicologie. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières :
Présentation du lieu de stage :......................................................................................................... 6
Introduction : .................................................................................................................................... 7
Problématique : .............................................................................................................................. 19
Matériel et Méthodes : .................................................................................................................. 23
Volet animal : ....................................................................................................................... 25
1) Animaux : espèces et souches : ........................................................................................ 25
2) Récolte des échantillons : ................................................................................................. 26
Volet Cellulaire : ................................................................................................................... 27
1) Décongélation : ................................................................................................................ 28
2) Entretien des Cultures : .................................................................................................... 29
3) Passage cellulaire : ........................................................................................................... 29
4) Récolte des échantillons cellulaires : Scraping ................................................................. 29
5) Extraction : ....................................................................................................................... 30
Volet préparation des échantillons : .................................................................................... 31
1) Urines : ............................................................................................................................. 31
2) Extractions cellulaires : ..................................................................................................... 31
3) Milieux de culture :........................................................................................................... 33
Volet analyse des spectres : ................................................................................................. 34
1) Acquisition des spectres : ................................................................................................. 34
2) Traitement des spectres : ................................................................................................. 34
Résultats : ....................................................................................................................................... 36
Analyse des spectres RMN des urines de rats contrôles : ................................................... 38
Libération des intermédiaires du cycle de Krebs : ............................................................... 40
1) Utilisation d’un pH de travail basique : ............................................................................ 41
2) Double procédure d’extraction : ...................................................................................... 41
Concentration des échantillons : .......................................................................................... 44
1) Utilisation de tubes microcapillaires : .............................................................................. 45
2) Augmentation du nombre de cellules : ............................................................................ 45
3) Influence du nombre de scans : ....................................................................................... 47
4) Analyse des milieux extracellulaires :............................................................................... 47
Discussion : ..................................................................................................................................... 50
Libération des intermédiaires du cycle de Krebs : ............................................................... 50
1) Utilisation de pH basique : ............................................................................................... 50
2) Double extraction : ........................................................................................................... 51
Concentration des échantillons : .......................................................................................... 51
1) Utilisation de microcapillaires : ........................................................................................ 51
Les intermédiaires du cycle de Krebs ne sont pas non plus visualisés sur le spectre obtenu au moyen d’une analyse en microcapillaire. Toutefois l’amélioration flagrante du signal obtenu dans cette condition est très encourageante. ......................................................... 51
2) Concentration des flasques : ............................................................................................ 52
3) Influence du nombre de scans : ....................................................................................... 53
4) Milieux extracellulaires : .................................................................................................. 53
Conclusion : .................................................................................................................................... 54
Perspectives : ................................................................................................................................. 55
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65853 Mise au point et optimisation d’une méthode d’extraction sur culture cellulaire permettant l’analyse métabonomique des intermédiaires du cycle de krebs par spectrométrie de résonance magnétique nucléaire du proton [TFE / Mémoire] / Sarah Storder, Auteur ; J-M Colet, Directeur de la recherche . - 2017.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Université de Mons laboratoire de biologie humaine et toxicologie. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières :
Présentation du lieu de stage :......................................................................................................... 6
Introduction : .................................................................................................................................... 7
Problématique : .............................................................................................................................. 19
Matériel et Méthodes : .................................................................................................................. 23
Volet animal : ....................................................................................................................... 25
1) Animaux : espèces et souches : ........................................................................................ 25
2) Récolte des échantillons : ................................................................................................. 26
Volet Cellulaire : ................................................................................................................... 27
1) Décongélation : ................................................................................................................ 28
2) Entretien des Cultures : .................................................................................................... 29
3) Passage cellulaire : ........................................................................................................... 29
4) Récolte des échantillons cellulaires : Scraping ................................................................. 29
5) Extraction : ....................................................................................................................... 30
Volet préparation des échantillons : .................................................................................... 31
1) Urines : ............................................................................................................................. 31
2) Extractions cellulaires : ..................................................................................................... 31
3) Milieux de culture :........................................................................................................... 33
Volet analyse des spectres : ................................................................................................. 34
1) Acquisition des spectres : ................................................................................................. 34
2) Traitement des spectres : ................................................................................................. 34
Résultats : ....................................................................................................................................... 36
Analyse des spectres RMN des urines de rats contrôles : ................................................... 38
Libération des intermédiaires du cycle de Krebs : ............................................................... 40
1) Utilisation d’un pH de travail basique : ............................................................................ 41
2) Double procédure d’extraction : ...................................................................................... 41
Concentration des échantillons : .......................................................................................... 44
1) Utilisation de tubes microcapillaires : .............................................................................. 45
2) Augmentation du nombre de cellules : ............................................................................ 45
3) Influence du nombre de scans : ....................................................................................... 47
4) Analyse des milieux extracellulaires :............................................................................... 47
Discussion : ..................................................................................................................................... 50
Libération des intermédiaires du cycle de Krebs : ............................................................... 50
1) Utilisation de pH basique : ............................................................................................... 50
2) Double extraction : ........................................................................................................... 51
Concentration des échantillons : .......................................................................................... 51
1) Utilisation de microcapillaires : ........................................................................................ 51
Les intermédiaires du cycle de Krebs ne sont pas non plus visualisés sur le spectre obtenu au moyen d’une analyse en microcapillaire. Toutefois l’amélioration flagrante du signal obtenu dans cette condition est très encourageante. ......................................................... 51
2) Concentration des flasques : ............................................................................................ 52
3) Influence du nombre de scans : ....................................................................................... 53
4) Milieux extracellulaires : .................................................................................................. 53
Conclusion : .................................................................................................................................... 54
Perspectives : ................................................................................................................................. 55
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65853 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Mise au point et optimisation d’un protocole de chimiogramme sur cellules primaires de leucémies / PERRINE BOLAND
Titre : Mise au point et optimisation d’un protocole de chimiogramme sur cellules primaires de leucémies Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : PERRINE BOLAND, Année de publication : 2016 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Biologie médicale Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille hématopoïèse leucémie aigüe traitement culture cellulaire décongélation coculture activité cytotoxique Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage
Introduction générale ............................................................................................................................. 10
I. Contexte général ................................................................................................................................ 12
1. Qu’est-ce que l’hématopoïèse ? ............................................................................................. 12
2. Leucémie aigüe ...................................................................................................................... 13
3. Traitement de la leucémie aigüe ............................................................................................ 15
II. Objectifs et stratégies ........................................................................................................................ 18
III. Matériels et méthodes ...................................................................................................................... 20
Matériel ............................................................................................................................................. 20
1. Appareillage, réactifs et milieux ............................................................................................ 20
2. Culture Cellulaire .................................................................................................................. 21
3. Protocole de décongélation.................................................................................................... 22
Méthode ............................................................................................................................................. 23
Objectif 1 : Optimisation des conditions de culture de cellules primaires issues de patients leucémiques ....................................................................................................................................... 23
1. Tests de milieux de culture .................................................................................................... 23
2. Coculture sur cellules stromales ............................................................................................ 29
Objectif n° 2 : Mise au point du passage en format 384 puits pour la réalisation de chémogrammes ........................................................................................................................................................... 33
1. Comparaison des plaques 384 puits noire et blanche ............................................................ 33
2. Comparaison de l’activité cytotoxique de l’AraC sur lignées leucémiques et donneurs primaires en plaque 384 puits noire et blanche ............................................................................. 34
IV. Résultats .......................................................................................................................................... 38
Objectif n°1 : Optimisation des conditions de culture ....................................................................... 38
1. Mononuclear Cell Medium.................................................................................................... 39
2. IMDM 20% FCS et IMDM 20% FCS complémenté de cytokines ....................................... 41
3. Coculture ............................................................................................................................... 49
Objectif n° 2 : Mise au point du passage en format 384 puits pour la réalisation de chemogrammes ........................................................................................................................................................... 53
1. Comparaison des plaques 384 puits blanche et noire ............................................................ 53
2. Comparaison de l’activité cytotoxique de l’AraC sur lignées leucémiques et donneurs primaires en plaque 384 puits noire et blanche ............................................................................. 56
Discussion et perspectives ..................................................................................................................... 60
Bibliographie ......................................................................................................................................... 64
AnnexePermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65663 Mise au point et optimisation d’un protocole de chimiogramme sur cellules primaires de leucémies [TFE / Mémoire] / PERRINE BOLAND, . - 2016.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : Biologie médicale Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille hématopoïèse leucémie aigüe traitement culture cellulaire décongélation coculture activité cytotoxique Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage
Introduction générale ............................................................................................................................. 10
I. Contexte général ................................................................................................................................ 12
1. Qu’est-ce que l’hématopoïèse ? ............................................................................................. 12
2. Leucémie aigüe ...................................................................................................................... 13
3. Traitement de la leucémie aigüe ............................................................................................ 15
II. Objectifs et stratégies ........................................................................................................................ 18
III. Matériels et méthodes ...................................................................................................................... 20
Matériel ............................................................................................................................................. 20
1. Appareillage, réactifs et milieux ............................................................................................ 20
2. Culture Cellulaire .................................................................................................................. 21
3. Protocole de décongélation.................................................................................................... 22
Méthode ............................................................................................................................................. 23
Objectif 1 : Optimisation des conditions de culture de cellules primaires issues de patients leucémiques ....................................................................................................................................... 23
1. Tests de milieux de culture .................................................................................................... 23
2. Coculture sur cellules stromales ............................................................................................ 29
Objectif n° 2 : Mise au point du passage en format 384 puits pour la réalisation de chémogrammes ........................................................................................................................................................... 33
1. Comparaison des plaques 384 puits noire et blanche ............................................................ 33
2. Comparaison de l’activité cytotoxique de l’AraC sur lignées leucémiques et donneurs primaires en plaque 384 puits noire et blanche ............................................................................. 34
IV. Résultats .......................................................................................................................................... 38
Objectif n°1 : Optimisation des conditions de culture ....................................................................... 38
1. Mononuclear Cell Medium.................................................................................................... 39
2. IMDM 20% FCS et IMDM 20% FCS complémenté de cytokines ....................................... 41
3. Coculture ............................................................................................................................... 49
Objectif n° 2 : Mise au point du passage en format 384 puits pour la réalisation de chemogrammes ........................................................................................................................................................... 53
1. Comparaison des plaques 384 puits blanche et noire ............................................................ 53
2. Comparaison de l’activité cytotoxique de l’AraC sur lignées leucémiques et donneurs primaires en plaque 384 puits noire et blanche ............................................................................. 56
Discussion et perspectives ..................................................................................................................... 60
Bibliographie ......................................................................................................................................... 64
AnnexePermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65663 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Mise au point de protocoles expérimentaux permettant l’identification de marqueurs associés au développement des plaques d’athérosclérose / NICOLAS BAUDOIN
Titre : Mise au point de protocoles expérimentaux permettant l’identification de marqueurs associés au développement des plaques d’athérosclérose Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : NICOLAS BAUDOIN, Auteur Année de publication : 2013 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : BIOLOGIE MÉDICALE PLAQUES D'ATHEROSCLEROSE RECEPTEUR P2 ET P2Y6 ATHEROSCLEROSE LIPIDES ET LIPOPROTEINES GENOTYPAGE DES SOURIS CRYOSECTION MACROPHAGES CD68 CELLULES MUSCULAIRES LISSES (ASMA) OXYDATION DU CHOLESTEROL ARTERES Biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Ce Travail de Fin d’Etude a été réalisé dans le cadre de l’étude du rôle du récepteur P2Y6 dans une maladie inflammatoire des artères, l’athérosclérose. Cette étude est menée à l’Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire, de la Faculté de Médecine à l’Université Libre de Bruxelles.
L’athérosclérose est provoquée par l’entrée et l’oxydation du cholestérol dans la paroi des artères, ce qui amène les cellules endothéliales à recruter les cellules immunitaires de l’organisme que sont les monocytes. Ces derniers se différencient en macrophages et internalisent les LDL oxydés, se transformant alors en cellules spumeuses gorgées de lipides. Il s’en suit une migration et une prolifération des cellules musculaires lisses (CML) de la media qui secrètent de la matrice extracellulaire et forment la plaque fibreuse. Les plaques d’athérosclérose sont sujettes à des ruptures qui vont conduire à la formation de thrombi, obstruant ainsi la lumière artérielle.
Tout au long de ce travail, nous nous sommes penché sur la mise au point de plusieurs protocoles expérimentaux permettant d’identifier et de quantifier deux types cellulaires exprimant le récepteur P2Y6 : les macrophages et les CML. La technique utilisée est l’immunohistofluorescence via des anticorps spécifiques directement couplés à un fluorochrome ou non-couplés et avec l’utilisation d’un anticorps secondaire comme révélateur. Les plaques et le collagène sont également quantifiés via des colorations histochimiques.
Lors de nos expériences, nous avons pris pour modèle des souris génétiquement invalidées pour le gène codant l’Apolipoprotéine E puisque cette dernière protège les souris de l’athérosclérose.
Nous sommes parvenus à établir des protocoles qui permettront d’étudier le rôle in vivo du récepteur P2Y6 chez les macrophages et les CML.Note de contenu : TABLE DES MATIERES
Remerciements
Introduction générale ................................................................................................................ 8
Partie théorique ....................................................................................................................... 10
1. L’athérosclérose ...................................................................................................... 10
1.1. Les lipides et les lipoprotéines .................................................................................. 10
1.2. Structure d’une artère ............................................................................................... 12
1.3. Mécanismes moléculaires et cellulaires associés au développement de l’athérosclérose .................................................................................................................... 12
1.3.1 Initiation de la lésion .......................................................................................... 12
1.3.2 Inflammation ...................................................................................................... 13
1.3.3 Formation des cellules spumeuses .................................................................... 13
1.3.4 Formation des plaques fibreuses ....................................................................... 14
1.3.5 Évolution de la lésion ......................................................................................... 14
1.3.6 Thérapies actuelles ............................................................................................. 15
2. Le modèle murin pour l’athérosclérose .................................................................... 15
3. Composition des plaques athéromateuses : les types cellulaires .............................. 16
3.1. Les cellules endothéliales .......................................................................................... 16
3.2. Les macrophages ....................................................................................................... 17
3.3. Les cellules musculaires lisses ................................................................................... 17
4. Les récepteurs P2 .................................................................................................... 18
4.1. Les récepteurs P2X .................................................................................................... 18
4.2. Les récepteur P2Y ...................................................................................................... 19
4.2.1. Les GPCRs en général ......................................................................................... 19
4.2.2. Les P2Y ................................................................................................................ 19
5. Rôles des récepteurs P2Y dans l’athérosclérose ....................................................... 22
5.1. Rôle du récepteur P2Y13 dans le métabolisme des lipides ........................................ 22
5.2. Rôles dans la régulation de la pression sanguine et de l’endothélium ..................... 22
5.3. Rôle de P2Y1 Dans la réponse inflammatoire ............................................................ 23
5.4. Rôle de P2Y1 dans la prolifération des cellules endothéliales ................................... 23
5.5. Rôle de P2Y2 dans la prolifération des cellules musculaires ..................................... 23
6. Rôle de P2Y6 dans l’athérosclérose .......................................................................... 24
Partie pratique ......................................................................................................................... 26
1. But du travail .......................................................................................................... 26
2. Matériels et méthodes ............................................................................................ 27
2.1. Génotypage des souris .............................................................................................. 27
2.1.1. Principe ............................................................................................................... 27
2.1.2. Matériels ............................................................................................................ 27
2.1.3. Solutions ............................................................................................................. 27
2.1.4. Méthode ............................................................................................................. 28
2.2. Prélèvement des organes chez les souris .................................................................. 29
2.2.1. Matériels ............................................................................................................ 29
2.2.2. Solutions ............................................................................................................. 29
2.2.3. Méthode ............................................................................................................. 30
2.3. Coupe et enrobage des organes pour la cryosection ................................................ 30
2.3.1. Principe ............................................................................................................... 30
2.3.2. Matériels ............................................................................................................ 30
2.3.3. Solutions ............................................................................................................. 31
2.3.4. Méthode ............................................................................................................. 31
2.4. Confection des coupes au cryostat ........................................................................... 31
2.4.1. Principe ............................................................................................................... 31
2.4.2. Matériels ............................................................................................................ 32
2.4.3. Méthode (voir figure 13) .................................................................................... 32
2.5. Identification et quantification des plaques d’athéromes ........................................ 32
2.5.1. Principe de la coloration Oil Red ........................................................................ 32
2.5.2. Matériels ............................................................................................................ 32
2.5.3. Solution .............................................................................................................. 33
2.5.4. Méthode ............................................................................................................. 33
2.5.5. Quantification de la surface des plaques ........................................................... 33
2.6. Identification et quantification du collagène ............................................................ 33
2.6.1. Principe de la coloration Trichrome de Masson ................................................ 33
2.6.2. Matériels ............................................................................................................ 34
2.6.3. Solutions ............................................................................................................. 34
2.6.4. Méthode ............................................................................................................. 34
2.6.5. Quantification de la surface du collagène .......................................................... 35
2.7. Identification et quantification des macrophages (CD68) ....................................... 35
2.7.1. Principe de l’immunohistofluorescence ............................................................ 35
2.7.2. Matériel .............................................................................................................. 36
2.7.3. Solutions ............................................................................................................. 36
2.7.4. Méthode ............................................................................................................. 36
2.7.5. Quantification de la surface des macrophages .................................................. 37
2.8. Identification et quantification des cellules musculaires lisses (ASMA) ................... 38
2.8.1. Principe du protocole d’immunohistofluorescence .......................................... 38
2.8.2. Matériel .............................................................................................................. 38
2.8.3. Solutions ............................................................................................................. 38
2.8.4. Méthode ............................................................................................................. 39
2.8.5. Quantification de la surface des CML ................................................................ 39
3. Résultats et discussion ............................................................................................ 40
3.1. Génotypage des souris .............................................................................................. 40
3.2. Quantification des plaques d’athérosclérose ............................................................ 40
3.3. Quantification du collagène ...................................................................................... 41
3.4. Quantification des macrophages (CD68) ................................................................... 42
3.5. Quantification des cellules musculaires lisses (ASMA) ............................................. 43
Conclusion et perspectives ...................................................................................................... 46
Bibliographie ............................................................................................................................ 48
AnnexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65241 Mise au point de protocoles expérimentaux permettant l’identification de marqueurs associés au développement des plaques d’athérosclérose [TFE / Mémoire] / NICOLAS BAUDOIN, Auteur . - 2013.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : BIOLOGIE MÉDICALE PLAQUES D'ATHEROSCLEROSE RECEPTEUR P2 ET P2Y6 ATHEROSCLEROSE LIPIDES ET LIPOPROTEINES GENOTYPAGE DES SOURIS CRYOSECTION MACROPHAGES CD68 CELLULES MUSCULAIRES LISSES (ASMA) OXYDATION DU CHOLESTEROL ARTERES Biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Ce Travail de Fin d’Etude a été réalisé dans le cadre de l’étude du rôle du récepteur P2Y6 dans une maladie inflammatoire des artères, l’athérosclérose. Cette étude est menée à l’Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire, de la Faculté de Médecine à l’Université Libre de Bruxelles.
L’athérosclérose est provoquée par l’entrée et l’oxydation du cholestérol dans la paroi des artères, ce qui amène les cellules endothéliales à recruter les cellules immunitaires de l’organisme que sont les monocytes. Ces derniers se différencient en macrophages et internalisent les LDL oxydés, se transformant alors en cellules spumeuses gorgées de lipides. Il s’en suit une migration et une prolifération des cellules musculaires lisses (CML) de la media qui secrètent de la matrice extracellulaire et forment la plaque fibreuse. Les plaques d’athérosclérose sont sujettes à des ruptures qui vont conduire à la formation de thrombi, obstruant ainsi la lumière artérielle.
Tout au long de ce travail, nous nous sommes penché sur la mise au point de plusieurs protocoles expérimentaux permettant d’identifier et de quantifier deux types cellulaires exprimant le récepteur P2Y6 : les macrophages et les CML. La technique utilisée est l’immunohistofluorescence via des anticorps spécifiques directement couplés à un fluorochrome ou non-couplés et avec l’utilisation d’un anticorps secondaire comme révélateur. Les plaques et le collagène sont également quantifiés via des colorations histochimiques.
Lors de nos expériences, nous avons pris pour modèle des souris génétiquement invalidées pour le gène codant l’Apolipoprotéine E puisque cette dernière protège les souris de l’athérosclérose.
Nous sommes parvenus à établir des protocoles qui permettront d’étudier le rôle in vivo du récepteur P2Y6 chez les macrophages et les CML.Note de contenu : TABLE DES MATIERES
Remerciements
Introduction générale ................................................................................................................ 8
Partie théorique ....................................................................................................................... 10
1. L’athérosclérose ...................................................................................................... 10
1.1. Les lipides et les lipoprotéines .................................................................................. 10
1.2. Structure d’une artère ............................................................................................... 12
1.3. Mécanismes moléculaires et cellulaires associés au développement de l’athérosclérose .................................................................................................................... 12
1.3.1 Initiation de la lésion .......................................................................................... 12
1.3.2 Inflammation ...................................................................................................... 13
1.3.3 Formation des cellules spumeuses .................................................................... 13
1.3.4 Formation des plaques fibreuses ....................................................................... 14
1.3.5 Évolution de la lésion ......................................................................................... 14
1.3.6 Thérapies actuelles ............................................................................................. 15
2. Le modèle murin pour l’athérosclérose .................................................................... 15
3. Composition des plaques athéromateuses : les types cellulaires .............................. 16
3.1. Les cellules endothéliales .......................................................................................... 16
3.2. Les macrophages ....................................................................................................... 17
3.3. Les cellules musculaires lisses ................................................................................... 17
4. Les récepteurs P2 .................................................................................................... 18
4.1. Les récepteurs P2X .................................................................................................... 18
4.2. Les récepteur P2Y ...................................................................................................... 19
4.2.1. Les GPCRs en général ......................................................................................... 19
4.2.2. Les P2Y ................................................................................................................ 19
5. Rôles des récepteurs P2Y dans l’athérosclérose ....................................................... 22
5.1. Rôle du récepteur P2Y13 dans le métabolisme des lipides ........................................ 22
5.2. Rôles dans la régulation de la pression sanguine et de l’endothélium ..................... 22
5.3. Rôle de P2Y1 Dans la réponse inflammatoire ............................................................ 23
5.4. Rôle de P2Y1 dans la prolifération des cellules endothéliales ................................... 23
5.5. Rôle de P2Y2 dans la prolifération des cellules musculaires ..................................... 23
6. Rôle de P2Y6 dans l’athérosclérose .......................................................................... 24
Partie pratique ......................................................................................................................... 26
1. But du travail .......................................................................................................... 26
2. Matériels et méthodes ............................................................................................ 27
2.1. Génotypage des souris .............................................................................................. 27
2.1.1. Principe ............................................................................................................... 27
2.1.2. Matériels ............................................................................................................ 27
2.1.3. Solutions ............................................................................................................. 27
2.1.4. Méthode ............................................................................................................. 28
2.2. Prélèvement des organes chez les souris .................................................................. 29
2.2.1. Matériels ............................................................................................................ 29
2.2.2. Solutions ............................................................................................................. 29
2.2.3. Méthode ............................................................................................................. 30
2.3. Coupe et enrobage des organes pour la cryosection ................................................ 30
2.3.1. Principe ............................................................................................................... 30
2.3.2. Matériels ............................................................................................................ 30
2.3.3. Solutions ............................................................................................................. 31
2.3.4. Méthode ............................................................................................................. 31
2.4. Confection des coupes au cryostat ........................................................................... 31
2.4.1. Principe ............................................................................................................... 31
2.4.2. Matériels ............................................................................................................ 32
2.4.3. Méthode (voir figure 13) .................................................................................... 32
2.5. Identification et quantification des plaques d’athéromes ........................................ 32
2.5.1. Principe de la coloration Oil Red ........................................................................ 32
2.5.2. Matériels ............................................................................................................ 32
2.5.3. Solution .............................................................................................................. 33
2.5.4. Méthode ............................................................................................................. 33
2.5.5. Quantification de la surface des plaques ........................................................... 33
2.6. Identification et quantification du collagène ............................................................ 33
2.6.1. Principe de la coloration Trichrome de Masson ................................................ 33
2.6.2. Matériels ............................................................................................................ 34
2.6.3. Solutions ............................................................................................................. 34
2.6.4. Méthode ............................................................................................................. 34
2.6.5. Quantification de la surface du collagène .......................................................... 35
2.7. Identification et quantification des macrophages (CD68) ....................................... 35
2.7.1. Principe de l’immunohistofluorescence ............................................................ 35
2.7.2. Matériel .............................................................................................................. 36
2.7.3. Solutions ............................................................................................................. 36
2.7.4. Méthode ............................................................................................................. 36
2.7.5. Quantification de la surface des macrophages .................................................. 37
2.8. Identification et quantification des cellules musculaires lisses (ASMA) ................... 38
2.8.1. Principe du protocole d’immunohistofluorescence .......................................... 38
2.8.2. Matériel .............................................................................................................. 38
2.8.3. Solutions ............................................................................................................. 38
2.8.4. Méthode ............................................................................................................. 39
2.8.5. Quantification de la surface des CML ................................................................ 39
3. Résultats et discussion ............................................................................................ 40
3.1. Génotypage des souris .............................................................................................. 40
3.2. Quantification des plaques d’athérosclérose ............................................................ 40
3.3. Quantification du collagène ...................................................................................... 41
3.4. Quantification des macrophages (CD68) ................................................................... 42
3.5. Quantification des cellules musculaires lisses (ASMA) ............................................. 43
Conclusion et perspectives ...................................................................................................... 46
Bibliographie ............................................................................................................................ 48
AnnexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65241 Exemplaires
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