Centre de Documentation Campus Montignies
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Lundi : 8h-18h30
Mardi : 8h-18h30
Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Auteur Alexia MARY |
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Mise au point de méthodes relatives à l'étude de la réparation de l'ADN chez le rotifère Adineta vaga / Alexia MARY
Titre : Mise au point de méthodes relatives à l'étude de la réparation de l'ADN chez le rotifère Adineta vaga Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Alexia MARY, Auteur ; Matthieu TERWAGNE, Directeur de la recherche Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Université de Namur Laboratoire d'écologie et de génétique évolutive. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage ......................................................................................... 13
Introduction .................................................................................................................... 15
Contexte général ............................................................................................................. 17
I. Les rotifères ......................................................................................................... 17
II. Taxonomie des rotifères ..................................................................................... 18
III. Morphologie d’un rotifère bdelloïde .................................................................. 21
IV. Quelques millions d’années de reproduction asexuée....................................... 24
V. Adineta vaga, porteur d’un génome particulier ................................................. 26
a. Structure particulière du génome .................................................................... 26
b. Conversion génique et transfert horizontal de gènes ..................................... 27
VI. Capacité de résistance à la dessiccation et aux irradiations ionisantes ............. 28
a. Capacité de résistance ..................................................................................... 28
b. Effets sur le génome......................................................................................... 29
VII. Mécanismes de réparation de l'ADN .................................................................. 31
Objectifs et stratégies ..................................................................................................... 37
Matériel et méthodes ..................................................................................................... 39
I. Culture, récolte et dénombrement des rotifères bdelloïdes Adineta vaga ....... 39
a. Culture du rotifère bdelloïde Adineta vaga ..................................................... 39
b. Culture de rotifères bdelloïde Adineta vaga marqués constitutivement au 5-
ethynyl-2′-deoxycytidine (EdC) ................................................................................ 39
c. Récolte des rotifères A. vaga ........................................................................... 39
d. Dénombrement des rotifères A. vaga ............................................................. 40
II. Milieux, tampons et solutions............................................................................. 40
a. Eau de source naturelle de Spa© .................................................................... 40
b. Extraits de laitue autoclavés ............................................................................ 40
c. Tampons et solutions ....................................................................................... 41
i. Solutions et tampons pour l'immunofluorescence et gel d'électrophorèse41
ii. Solutions et tampons d'extraction des noyaux d'A.vaga ............................ 42
iii. Tampon de lyse pour l'extraction protéique totale de cellules humaines .. 43
iv. Solutions et tampons pour le Western Blot ................................................ 44
III. Dessiccation de rotifères bdelloides A. vaga ...................................................... 45
IV. Irradiations ionisantes aux protons des rotifères bdelloïdes A. vaga ................ 45
V. Microscopie ......................................................................................................... 46
a. Observation d'A. vaga en microscopie optique classique .............................. 46
b. Observation d'A. vaga en microscopie à fluorescence .................................... 46
i. Préparation des lames ................................................................................. 46
ii. Caractéristiques des microscopes utilisés ................................................... 48
VI. Cytométrie en flux ............................................................................................... 48
a. Préparation des échantillons ........................................................................... 48
b. Analyse des échantillons .................................................................................. 49
VII. Western Blot ....................................................................................................... 50
a. Extraction des protéines de A. vaga ................................................................ 50
b. Extraction des protéines de cellules humaines A549 ...................................... 50
c. Dosage des protéines ....................................................................................... 51
d. Migration des protéines et transfert sur la membrane ................................... 51
e. Immunodétection ............................................................................................ 52
f. Révélation ........................................................................................................ 52
g. Renouvellement de la membrane.................................................................... 53
VIII. Ensemencement et isolement des bactéries contenues dans les cultures des
rotifères ....................................................................................................................... 53
IX. Polymerase chain reaction .................................................................................. 53
a. Lyse des bactéries ............................................................................................ 54
b. MIX PCR pour amplification d'un fragment du gène de l'ARNr 16s des
bactéries .................................................................................................................. 54
c. Programme du thermocycleur ......................................................................... 55
d. Electrophorèse sur gel d'agarose ..................................................................... 55
Résultats et discussions .................................................................................................. 57
I. Analyses du contenu en ADN des noyaux du rotifère A. vaga par cytométrie en
flux ............................................................................................................................57
a. Mise au point d'une méthode d'extraction des noyaux d'A. vaga et de
l'analyse par cytométrie en flux .............................................................................. 57
b. Détermination du contenu en ADN des différents pics observés ................... 62
c. Détermination du profil de rotifères ayant subit différents stress ................. 64
d. Détection de l'incorporation du 5-ethynyl-2′-deoxycytidine (EdC) dans l’ADN
du rotifère bdelloïde A. vaga................................................................................... 65
i. Vérification de l'intégration de l'analogue .................................................. 66
ii. Mise au point du protocole de détection de l'incorporation de l'EdC dans le
génome des rotifères par cytométrie en flux ..................................................... 68
II. Sélection d’anticorps dirigés contre les protéines impliquées dans les voies de
réparation de cassures double brin de l’ADN. ............................................................ 73
a. Sélection de l'anticorps anti-α-tubuline ........................................................... 73
i. Immunolocalisation de la tubuline chez le rotifère ..................................... 74
ii. Mise au point de l'utilisation des anticorps primaires et secondaires en
immunofluorescence .......................................................................................... 75
b. Protéines provenant de cellules humaines A549 ............................................ 75
c. Sélection des anticorps anti Rad51 et anti Ku70 ............................................ 76
III. Identification des bactéries présentes dans les cultures du rotifère A. vaga .... 81
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65843 Mise au point de méthodes relatives à l'étude de la réparation de l'ADN chez le rotifère Adineta vaga [TFE / Mémoire] / Alexia MARY, Auteur ; Matthieu TERWAGNE, Directeur de la recherche . - 2017.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Université de Namur Laboratoire d'écologie et de génétique évolutive. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage ......................................................................................... 13
Introduction .................................................................................................................... 15
Contexte général ............................................................................................................. 17
I. Les rotifères ......................................................................................................... 17
II. Taxonomie des rotifères ..................................................................................... 18
III. Morphologie d’un rotifère bdelloïde .................................................................. 21
IV. Quelques millions d’années de reproduction asexuée....................................... 24
V. Adineta vaga, porteur d’un génome particulier ................................................. 26
a. Structure particulière du génome .................................................................... 26
b. Conversion génique et transfert horizontal de gènes ..................................... 27
VI. Capacité de résistance à la dessiccation et aux irradiations ionisantes ............. 28
a. Capacité de résistance ..................................................................................... 28
b. Effets sur le génome......................................................................................... 29
VII. Mécanismes de réparation de l'ADN .................................................................. 31
Objectifs et stratégies ..................................................................................................... 37
Matériel et méthodes ..................................................................................................... 39
I. Culture, récolte et dénombrement des rotifères bdelloïdes Adineta vaga ....... 39
a. Culture du rotifère bdelloïde Adineta vaga ..................................................... 39
b. Culture de rotifères bdelloïde Adineta vaga marqués constitutivement au 5-
ethynyl-2′-deoxycytidine (EdC) ................................................................................ 39
c. Récolte des rotifères A. vaga ........................................................................... 39
d. Dénombrement des rotifères A. vaga ............................................................. 40
II. Milieux, tampons et solutions............................................................................. 40
a. Eau de source naturelle de Spa© .................................................................... 40
b. Extraits de laitue autoclavés ............................................................................ 40
c. Tampons et solutions ....................................................................................... 41
i. Solutions et tampons pour l'immunofluorescence et gel d'électrophorèse41
ii. Solutions et tampons d'extraction des noyaux d'A.vaga ............................ 42
iii. Tampon de lyse pour l'extraction protéique totale de cellules humaines .. 43
iv. Solutions et tampons pour le Western Blot ................................................ 44
III. Dessiccation de rotifères bdelloides A. vaga ...................................................... 45
IV. Irradiations ionisantes aux protons des rotifères bdelloïdes A. vaga ................ 45
V. Microscopie ......................................................................................................... 46
a. Observation d'A. vaga en microscopie optique classique .............................. 46
b. Observation d'A. vaga en microscopie à fluorescence .................................... 46
i. Préparation des lames ................................................................................. 46
ii. Caractéristiques des microscopes utilisés ................................................... 48
VI. Cytométrie en flux ............................................................................................... 48
a. Préparation des échantillons ........................................................................... 48
b. Analyse des échantillons .................................................................................. 49
VII. Western Blot ....................................................................................................... 50
a. Extraction des protéines de A. vaga ................................................................ 50
b. Extraction des protéines de cellules humaines A549 ...................................... 50
c. Dosage des protéines ....................................................................................... 51
d. Migration des protéines et transfert sur la membrane ................................... 51
e. Immunodétection ............................................................................................ 52
f. Révélation ........................................................................................................ 52
g. Renouvellement de la membrane.................................................................... 53
VIII. Ensemencement et isolement des bactéries contenues dans les cultures des
rotifères ....................................................................................................................... 53
IX. Polymerase chain reaction .................................................................................. 53
a. Lyse des bactéries ............................................................................................ 54
b. MIX PCR pour amplification d'un fragment du gène de l'ARNr 16s des
bactéries .................................................................................................................. 54
c. Programme du thermocycleur ......................................................................... 55
d. Electrophorèse sur gel d'agarose ..................................................................... 55
Résultats et discussions .................................................................................................. 57
I. Analyses du contenu en ADN des noyaux du rotifère A. vaga par cytométrie en
flux ............................................................................................................................57
a. Mise au point d'une méthode d'extraction des noyaux d'A. vaga et de
l'analyse par cytométrie en flux .............................................................................. 57
b. Détermination du contenu en ADN des différents pics observés ................... 62
c. Détermination du profil de rotifères ayant subit différents stress ................. 64
d. Détection de l'incorporation du 5-ethynyl-2′-deoxycytidine (EdC) dans l’ADN
du rotifère bdelloïde A. vaga................................................................................... 65
i. Vérification de l'intégration de l'analogue .................................................. 66
ii. Mise au point du protocole de détection de l'incorporation de l'EdC dans le
génome des rotifères par cytométrie en flux ..................................................... 68
II. Sélection d’anticorps dirigés contre les protéines impliquées dans les voies de
réparation de cassures double brin de l’ADN. ............................................................ 73
a. Sélection de l'anticorps anti-α-tubuline ........................................................... 73
i. Immunolocalisation de la tubuline chez le rotifère ..................................... 74
ii. Mise au point de l'utilisation des anticorps primaires et secondaires en
immunofluorescence .......................................................................................... 75
b. Protéines provenant de cellules humaines A549 ............................................ 75
c. Sélection des anticorps anti Rad51 et anti Ku70 ............................................ 76
III. Identification des bactéries présentes dans les cultures du rotifère A. vaga .... 81
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