Centre de Documentation Campus Montignies
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Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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1 résultat(s) recherche sur le mot-clé 'laboratoire de Chimie Biologique Structurale'
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Recherche de nouveaux inhibiteurs de la phosphosérine phosphatase (SerB2) - étude des interactions de petites molécules sur l’activité et l’inhibition de SerB2 par DSF et tests enzymatiques / Simon Cheval
Titre : Recherche de nouveaux inhibiteurs de la phosphosérine phosphatase (SerB2) - étude des interactions de petites molécules sur l’activité et l’inhibition de SerB2 par DSF et tests enzymatiques Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Simon Cheval, Auteur ; Jérôme Cornil, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Unamur laboratoire de Chimie Biologique Structurale CBS Tuberculose SerB2 Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La tuberculose, une maladie infectieuse causée par une bactérie, Mycobacterium tuberculosis, est devenue un problème de santé mondiale, notamment suite à l’apparition de souches résistantes aux traitements actuels. Afin de lutter contre cette maladie, le développement de nouveaux antibiotiques et donc la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques sont fortement encouragés. Une de ces cibles thérapeutiques déjà identifiée est la voie de la sérine, une voie essentielle à la survie du pathogène.
Ce travail s’intègre dans ces recherches pour lutter contre la tuberculose en s’intéressant plus particulièrement à une enzyme de la voie de la sérine, SerB2. Selon des études précédentes, cette enzyme s’avère non seulement essentielle à la survie de la bactérie mais aussi à sa virulence dans l’organisme de son hôte. Une de ces recherches étudiant la structure de SerB2 montre la présence d’un site actif liés à deux domaines ACT régulateurs. Cette observation laisse espérer la possibilité d’inhiber cette enzyme via ces deux domaines dans le but de développer un nouveau pharmacophore (modèle de conception d’un médicament). L’objectif principal de ce TFE est donc la recherche d’inhibiteurs potentiels de SerB2 en ciblant les deux domaines ACT de l’enzyme. Cette recherche se fera à partir d’un panel d’acides aminés
et par l’intermédiaire de test DSF et enzymatiques. Il faudra produire l’enzyme, optimiser les conditions des différents tests et réaliser des screening de l’enzyme avec les acides aminés. Les domaines ciblés permettront-ils de mettre en évidence des acides aminés avec une haute interaction/inhibition de l’enzyme ? Est-ce que l’inhibition de SerB2 par des acides aminés est une piste exploitable dans la lutte contre la tuberculose ? De nombreuses perspectives sont
encore à envisager ...Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
Remerciements.............................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ...................................................................................................... 9
Chapitre I. L’université de Namur – l’Unamur .................................................................. 9
Chapitre II. Le laboratoire de Chimie Biologique Structurale – le CBS.......................... 9
I. Contexte général............................................................................................................... 10
Chapitre I. La tuberculose................................................................................................. 10
Introduction ............................................................................................................... 10
La pathologie ............................................................................................................. 10
L’agent infectieux - M. tuberculosis.......................................................................... 11
Problématique actuelle – traitement de la tuberculose et apparition de souches
résistantes ......................................................................................................................... 12
Chapitre II. Nouvelles pistes de lutte thérapeutique – la voie de la sérine..................... 13
Identification de la voie de la sérine en tant que cible thérapeutique ........................ 13
Description de la voie de la sérine............................................................................. 13
Chapitre III. Recherches préliminaires sur SerB2, une bonne cible thérapeuthique ? .... 14
SerB2, un facteur de virulence .................................................................................. 14
Structure et fonction de SerB2................................................................................... 15
Inhibiteurs connus de SerB2...................................................................................... 16
II. Objectifs et stratégie......................................................................................................... 18
III. Matériel et méthodes ..................................................................................................... 20
Chapitre I. Production, purification et caractérisation de SerB2 ...................................... 20
Etape préliminaire – préparation de différents tampons............................................ 20
Production (surexpression) de SerB2 His6 ................................................................ 20
Purification par chromatographie d’affinité IMAC, dialyse et clivage du His-tag ... 23
Caractérisation de la purification par électrophorèse SDS-PAGE et dosage au nano
drop................................................................................................................................... 24
Stockage et passage sur colonne PD10...................................................................... 26
Chapitre II. Mise au point des conditions pour test DSF et screening de 30 acides aminés
..................................................................................................................... 27
Mise au point du test DSF de SerB2 avec 10 acides aminés ..................................... 28
Screening des 30 acides aminés................................................................................. 29
Chapitre III. Mise au point des conditions pour test phosphatase et screening des ligands
sélectionnés avec SerB2 ....................................................................................................... 29
Détermination de la concentration en acide aminé.................................................... 30
Screening des acides aminés...................................................................................... 30
Chapitre IV. essais de cristallogenèse sur SerB2............................................................. 31
Recherche des conditions de cristallisation ............................................................... 32
Reproduction et optimisation des cristaux................................................................. 32
Analyse cristallographique ........................................................................................ 32
IV. Résultats et discussion................................................................................................... 33
Chapitre I. Surexpression et purification de SerB2 .......................................................... 33
Conclusion intermédiaire........................................................................................... 36
Chapitre II. DSF – optimisation et résultats du screening.............................................. 37
Condition 1 : choix du tampon et du colorant ........................................................... 38
Condition 2 : optimisation de la concentration en enzyme ....................................... 40
Condition 3 : optimisation de la concentration du colorant Syp Orange................... 41
Condition 4 : optimisation de la concentration en acide aminé................................. 42
Conclusion intermédiaire et résumé des conditions sélectionnées ............................ 43
Screening des acides aminés par DSF ....................................................................... 44
Chapitre III. Test phosphatase – optimisation et screening ............................................. 45
Optimisation du test phosphatase .............................................................................. 45
Screening des 30 acides aminés par test phosphatase ............................................... 46
Conclusions intermédiaires........................................................................................ 47
Chapitre IV. Cristallogenèse ............................................................................................ 48
1ère tentative d’obtention de cristaux ......................................................................... 48
Optimisation des conditions de cristallisation ........................................................... 49
Analyse cristallographique ........................................................................................ 49
Conclusions générales et perspectives ..................................................................................... 50
Bibliographie............................................................................................................................ 52
Annexes ........................................................................................................................................
Annexe 1 – kit cbs screen md1-104 .........................................................................................
Annexe 2 – protocole du test phosphatase ...............................................................................
Annexe 3 – Screening DSF des différents acides aminés à une concentration de 100 μM .....
Annexe 4 – conditions d’optimisation de cristallisation ..........................................................
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100296 Recherche de nouveaux inhibiteurs de la phosphosérine phosphatase (SerB2) - étude des interactions de petites molécules sur l’activité et l’inhibition de SerB2 par DSF et tests enzymatiques [TFE / Mémoire] / Simon Cheval, Auteur ; Jérôme Cornil, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur
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Mots-clés : Unamur laboratoire de Chimie Biologique Structurale CBS Tuberculose SerB2 Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La tuberculose, une maladie infectieuse causée par une bactérie, Mycobacterium tuberculosis, est devenue un problème de santé mondiale, notamment suite à l’apparition de souches résistantes aux traitements actuels. Afin de lutter contre cette maladie, le développement de nouveaux antibiotiques et donc la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques sont fortement encouragés. Une de ces cibles thérapeutiques déjà identifiée est la voie de la sérine, une voie essentielle à la survie du pathogène.
Ce travail s’intègre dans ces recherches pour lutter contre la tuberculose en s’intéressant plus particulièrement à une enzyme de la voie de la sérine, SerB2. Selon des études précédentes, cette enzyme s’avère non seulement essentielle à la survie de la bactérie mais aussi à sa virulence dans l’organisme de son hôte. Une de ces recherches étudiant la structure de SerB2 montre la présence d’un site actif liés à deux domaines ACT régulateurs. Cette observation laisse espérer la possibilité d’inhiber cette enzyme via ces deux domaines dans le but de développer un nouveau pharmacophore (modèle de conception d’un médicament). L’objectif principal de ce TFE est donc la recherche d’inhibiteurs potentiels de SerB2 en ciblant les deux domaines ACT de l’enzyme. Cette recherche se fera à partir d’un panel d’acides aminés
et par l’intermédiaire de test DSF et enzymatiques. Il faudra produire l’enzyme, optimiser les conditions des différents tests et réaliser des screening de l’enzyme avec les acides aminés. Les domaines ciblés permettront-ils de mettre en évidence des acides aminés avec une haute interaction/inhibition de l’enzyme ? Est-ce que l’inhibition de SerB2 par des acides aminés est une piste exploitable dans la lutte contre la tuberculose ? De nombreuses perspectives sont
encore à envisager ...Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
Remerciements.............................................................................................................................
Présentation du lieu de stage ...................................................................................................... 9
Chapitre I. L’université de Namur – l’Unamur .................................................................. 9
Chapitre II. Le laboratoire de Chimie Biologique Structurale – le CBS.......................... 9
I. Contexte général............................................................................................................... 10
Chapitre I. La tuberculose................................................................................................. 10
Introduction ............................................................................................................... 10
La pathologie ............................................................................................................. 10
L’agent infectieux - M. tuberculosis.......................................................................... 11
Problématique actuelle – traitement de la tuberculose et apparition de souches
résistantes ......................................................................................................................... 12
Chapitre II. Nouvelles pistes de lutte thérapeutique – la voie de la sérine..................... 13
Identification de la voie de la sérine en tant que cible thérapeutique ........................ 13
Description de la voie de la sérine............................................................................. 13
Chapitre III. Recherches préliminaires sur SerB2, une bonne cible thérapeuthique ? .... 14
SerB2, un facteur de virulence .................................................................................. 14
Structure et fonction de SerB2................................................................................... 15
Inhibiteurs connus de SerB2...................................................................................... 16
II. Objectifs et stratégie......................................................................................................... 18
III. Matériel et méthodes ..................................................................................................... 20
Chapitre I. Production, purification et caractérisation de SerB2 ...................................... 20
Etape préliminaire – préparation de différents tampons............................................ 20
Production (surexpression) de SerB2 His6 ................................................................ 20
Purification par chromatographie d’affinité IMAC, dialyse et clivage du His-tag ... 23
Caractérisation de la purification par électrophorèse SDS-PAGE et dosage au nano
drop................................................................................................................................... 24
Stockage et passage sur colonne PD10...................................................................... 26
Chapitre II. Mise au point des conditions pour test DSF et screening de 30 acides aminés
..................................................................................................................... 27
Mise au point du test DSF de SerB2 avec 10 acides aminés ..................................... 28
Screening des 30 acides aminés................................................................................. 29
Chapitre III. Mise au point des conditions pour test phosphatase et screening des ligands
sélectionnés avec SerB2 ....................................................................................................... 29
Détermination de la concentration en acide aminé.................................................... 30
Screening des acides aminés...................................................................................... 30
Chapitre IV. essais de cristallogenèse sur SerB2............................................................. 31
Recherche des conditions de cristallisation ............................................................... 32
Reproduction et optimisation des cristaux................................................................. 32
Analyse cristallographique ........................................................................................ 32
IV. Résultats et discussion................................................................................................... 33
Chapitre I. Surexpression et purification de SerB2 .......................................................... 33
Conclusion intermédiaire........................................................................................... 36
Chapitre II. DSF – optimisation et résultats du screening.............................................. 37
Condition 1 : choix du tampon et du colorant ........................................................... 38
Condition 2 : optimisation de la concentration en enzyme ....................................... 40
Condition 3 : optimisation de la concentration du colorant Syp Orange................... 41
Condition 4 : optimisation de la concentration en acide aminé................................. 42
Conclusion intermédiaire et résumé des conditions sélectionnées ............................ 43
Screening des acides aminés par DSF ....................................................................... 44
Chapitre III. Test phosphatase – optimisation et screening ............................................. 45
Optimisation du test phosphatase .............................................................................. 45
Screening des 30 acides aminés par test phosphatase ............................................... 46
Conclusions intermédiaires........................................................................................ 47
Chapitre IV. Cristallogenèse ............................................................................................ 48
1ère tentative d’obtention de cristaux ......................................................................... 48
Optimisation des conditions de cristallisation ........................................................... 49
Analyse cristallographique ........................................................................................ 49
Conclusions générales et perspectives ..................................................................................... 50
Bibliographie............................................................................................................................ 52
Annexes ........................................................................................................................................
Annexe 1 – kit cbs screen md1-104 .........................................................................................
Annexe 2 – protocole du test phosphatase ...............................................................................
Annexe 3 – Screening DSF des différents acides aminés à une concentration de 100 μM .....
Annexe 4 – conditions d’optimisation de cristallisation ..........................................................
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