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ABONDANCE ET ACTIVITE DU FACTEUR DE TRANSCRIPTION HIF-1 DANS DIFFERENTES CONDITIONS D’HYPOXIE / Wiâme BEN EL MOSTAPHA

Public ISBD Titre : ABONDANCE ET ACTIVITE DU FACTEUR DE TRANSCRIPTION HIF-1 DANS DIFFERENTES CONDITIONS D’HYPOXIE Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Wiâme BEN EL MOSTAPHA, Auteur ; Guillaume Van Beersel, Directeur de la recherche Année de publication : 2015 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  Université de Namur  Cellules souches cancéreuses  Sein : cancer Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage ........................................................................................................7 Introduction générale ...................................................................................................................9 1. Introduction théorique ......................................................................................................... 11 1.1. Le sein .......................................................................................................................... 11 1.1.1. Structure du sein................................................................................................... 11 1.1.2. Cellules souches .................................................................................................... 13 1.1.3. Tumeur du sein .................................................................................................... 14 1.1.3.1. Généralités.................................................................................................... 14 1.1.3.2. Cellules souches cancéreuses ........................................................................ 16 1.2. Hypoxie ........................................................................................................................ 17 1.3. Facteur Inductible par l'Hypoxie (HIF) ........................................................................... 18 1.3.1. Généralités ........................................................................................................... 18 1.3.2. Rôle de HIF-1 en hypoxie....................................................................................... 19 1.3.3. HIF-1α ................................................................................................................... 20 1.3.4. Régulation du facteur HIF-1α ................................................................................ 21 1.3.4.1. Mécanisme de dégradation ........................................................................... 21 1.3.4.2. Mécanisme de stabilisation hypoxique .......................................................... 22 2. Objectifs............................................................................................................................... 23 3. Matériel et méthodes .......................................................................................................... 23 3.1. Culture cellulaire .......................................................................................................... 23 3.1.1. Lignée cellulaire utilisée ........................................................................................ 23 3.1.2. Culture cellulaire ................................................................................................... 24 3.2. Extraction de protéines et dosage................................................................................. 25 3.2.1. Extraction des protéines ....................................................................................... 25 3.2.2. Dosage protéique avec le réactif de Pierce ............................................................ 26 3.2.2.1. Principe ......................................................................................................... 26 3.2.2.2. Protocole ...................................................................................................... 27 3.3. Western blot ................................................................................................................ 28 3.3.1. Préparation des échantillons ................................................................................. 28 3.3.2. Préparation du gel polyacrylamide ........................................................................ 28 3.3.3. Chargement des protéines et électrophorèse ....................................................... 29 3.3.4. Transfert semi-humide .......................................................................................... 30 3.3.5. Incubation de la membrane avec les anticorps primaires et secondaires ............... 31 3.3.5.1. Fluorescence ................................................................................................. 31 3.3.5.2. Chémiluminescence ...................................................................................... 32 3.3.6. Révélation et quantification .................................................................................. 33 3.3.6.1. Fluorescence ................................................................................................. 33 3.3.6.2. Chémiluminescence ...................................................................................... 34 3.4. PCR quantitative en temps réel (RT-PCR) ...................................................................... 34 3.4.1. Principe ................................................................................................................ 34 3.4.2. Extraction d’ARN ................................................................................................... 35 3.4.3. Transcription inverse ............................................................................................ 36 3.4.4. PCR en temps réel (RT-PCR) .................................................................................. 37 3.4.5. Analyse des résultats ............................................................................................ 38 4. Résultats et discussion ......................................................................................................... 39 4.1. Détection de la protéine HIF-1α .................................................................................... 39 4.1.1. Western blot « classique » et fluorescent .............................................................. 39 4.2. Analyse de l’expression de gènes cibles de HIF-1 .......................................................... 48 4.2.1. Expression du gène SOX2 ...................................................................................... 48 4.2.2. Expression du gène NDRG1B ................................................................................. 49 Conclusions et perspectives ........................................................................................................ 51 Liste des abréviations .................................................................................................................. 53 Bibliographie ............................................................................................................................... 55 ABONDANCE ET ACTIVITE DU FACTEUR DE TRANSCRIPTION HIF-1 DANS DIFFERENTES CONDITIONS D’HYPOXIE [TFE / Mémoire] / Wiâme BEN EL MOSTAPHA, Auteur ; Guillaume Van Beersel, Directeur de la recherche . - 2015. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  Université de Namur  Cellules souches cancéreuses  Sein : cancer Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage ........................................................................................................7 Introduction générale ...................................................................................................................9 1. Introduction théorique ......................................................................................................... 11 1.1. Le sein .......................................................................................................................... 11 1.1.1. Structure du sein................................................................................................... 11 1.1.2. Cellules souches .................................................................................................... 13 1.1.3. Tumeur du sein .................................................................................................... 14 1.1.3.1. Généralités.................................................................................................... 14 1.1.3.2. Cellules souches cancéreuses ........................................................................ 16 1.2. Hypoxie ........................................................................................................................ 17 1.3. Facteur Inductible par l'Hypoxie (HIF) ........................................................................... 18 1.3.1. Généralités ........................................................................................................... 18 1.3.2. Rôle de HIF-1 en hypoxie....................................................................................... 19 1.3.3. HIF-1α ................................................................................................................... 20 1.3.4. Régulation du facteur HIF-1α ................................................................................ 21 1.3.4.1. Mécanisme de dégradation ........................................................................... 21 1.3.4.2. Mécanisme de stabilisation hypoxique .......................................................... 22 2. Objectifs............................................................................................................................... 23 3. Matériel et méthodes .......................................................................................................... 23 3.1. Culture cellulaire .......................................................................................................... 23 3.1.1. Lignée cellulaire utilisée ........................................................................................ 23 3.1.2. Culture cellulaire ................................................................................................... 24 3.2. Extraction de protéines et dosage................................................................................. 25 3.2.1. Extraction des protéines ....................................................................................... 25 3.2.2. Dosage protéique avec le réactif de Pierce ............................................................ 26 3.2.2.1. Principe ......................................................................................................... 26 3.2.2.2. Protocole ...................................................................................................... 27 3.3. Western blot ................................................................................................................ 28 3.3.1. Préparation des échantillons ................................................................................. 28 3.3.2. Préparation du gel polyacrylamide ........................................................................ 28 3.3.3. Chargement des protéines et électrophorèse ....................................................... 29 3.3.4. Transfert semi-humide .......................................................................................... 30 3.3.5. Incubation de la membrane avec les anticorps primaires et secondaires ............... 31 3.3.5.1. Fluorescence ................................................................................................. 31 3.3.5.2. Chémiluminescence ...................................................................................... 32 3.3.6. Révélation et quantification .................................................................................. 33 3.3.6.1. Fluorescence ................................................................................................. 33 3.3.6.2. Chémiluminescence ...................................................................................... 34 3.4. PCR quantitative en temps réel (RT-PCR) ...................................................................... 34 3.4.1. Principe ................................................................................................................ 34 3.4.2. Extraction d’ARN ................................................................................................... 35 3.4.3. Transcription inverse ............................................................................................ 36 3.4.4. PCR en temps réel (RT-PCR) .................................................................................. 37 3.4.5. Analyse des résultats ............................................................................................ 38 4. Résultats et discussion ......................................................................................................... 39 4.1. Détection de la protéine HIF-1α .................................................................................... 39 4.1.1. Western blot « classique » et fluorescent .............................................................. 39 4.2. Analyse de l’expression de gènes cibles de HIF-1 .......................................................... 48 4.2.1. Expression du gène SOX2 ...................................................................................... 48 4.2.2. Expression du gène NDRG1B ................................................................................. 49 Conclusions et perspectives ........................................................................................................ 51 Liste des abréviations .................................................................................................................. 53 Bibliographie ............................................................................................................................... 55

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