Centre de Documentation Campus Montignies
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2 résultat(s) recherche sur le mot-clé 'IBMM Gosselies'
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Rôle du récepteur CD27 dans la régulation de la réponse inflammatoire associée à l’obésité / Marie Vanhollebeke
Titre : Rôle du récepteur CD27 dans la régulation de la réponse inflammatoire associée à l’obésité Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Marie Vanhollebeke, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale IBMM Gosselies Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : L’obésité touche à ce jour une grande partie de la population mondiale. Cet excès pondéral conduit au développement d’un phénomène dénommé « syndrome métabolique » augmentant les risques d’apparition du phénomène d’insulino-résistance (diabète de type 2), de maladies cardiovasculaires, de troubles hépatiques ou encore de cancers.
En conditions homéostasiques, la masse graisseuse renferme une multitude de cellules de la réponse immunitaire dite de type 2. Les fonctions effectrices de celles-ci permettent de maintenir un environnement anti-inflammatoire propice à l’homéostasie du tissu adipeux. La prise de poids engendre petit à petit des modifications quantitatives et qualitatives de ces cellules immunes ; leur nombre et la qualité de leurs fonctions diminuent au profit de l’accumulation des acteurs de la réponse immunitaire de type 1. Ces derniers instaurent un environnement inflammatoire lui-même à l’origine des pathologies sous-jacentes à l’état d’obésité.
Ce TFE traite d’une étude réalisée durant mon stage de dernière année de bachelier, menée aux côtés de Guillaume Oldenhove, d’Anaëlle Taquin et de Kevin Englebert du laboratoire d’immunobiologie de l’IBMM. Celle-ci démontre que des souris génétiquement invalidées dans l’expression du récepteur CD27 soumises à un régime hyperlipidique grossissent de manière plus modérée, présentent une plus grande sensibilité à l’insuline et de meilleures fonctions métaboliques que des rongeurs exprimant le récepteur CD27 soumis à la même alimentation. Des différences majeures dans la régulation immunitaire du tissu adipeux de ces animaux ont également été mises en évidence : malgré l’administration d’un régime riche en lipides la réponse anti-inflammatoire est maintenue chez les souris déficientes pour le récepteur CD27 a contrario des animaux qui expriment ce dernier.
L’ensemble des résultats obtenus jusqu’à présent dans le cadre de ce projet sont clairs : le récepteur CD27 joue un rôle primordial dans l’apparition de l’obésité, de l’état d’inflammation et des pathologies métaboliques qui en découlent.Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage ......................................................................................................................................... 9
Introduction ................................................................................................................................................................... 11
1. Partie théorique .................................................................................................................................................... 12
1.1. Tissu adipeux ............................................................................................................................................... 12
1.1.1. Définition générale............................................................................................................................. 12
1.1.2. Tissu adipeux blanc ............................................................................................................................ 13
1.2. Immunité ..................................................................................................................................................... 14
1.2.1. Définitions générales ......................................................................................................................... 14
1.2.2. Immunité innée .................................................................................................................................. 14
1.2.2.1. Eosinophiles .............................................................................................................................. 15
1.2.2.2. Macrophages ............................................................................................................................. 16
1.2.2.3. Cellules innées lymphoïdes (ILCs) ............................................................................................ 17
a) ILC-1 .................................................................................................................................................... 18
b) ILC-2 .................................................................................................................................................... 18
1.2.2.4. Cellules dendritiques ................................................................................................................ 18
1.2.3. Immunité adaptative.......................................................................................................................... 19
1.2.3.1. Les lymphocytes T (Ly T) ........................................................................................................... 19
a) Lymphocytes T helper de type 1 (Th1) ............................................................................................... 20
b) Lymphocytes T helper de type 2 (Th2) ............................................................................................... 20
c) Lymphocytes T helper de type 17 (Th17) .......................................................................................... 21
d) Lymphocytes T régulateurs (Treg) ..................................................................................................... 21
e) Lymphocytes T mémoires .................................................................................................................. 22
1.2.4. Immunité constitutive du tissu adipeux sain .................................................................................... 23
a) Eosinophiles ........................................................................................................................................ 24
b) Macrophages M2 ............................................................................................................................... 24
c) Cellules dendritiques .......................................................................................................................... 24
d) Lymphocytes Treg .............................................................................................................................. 25
e) Lymphocytes Th2 ................................................................................................................................ 25
f) Lymphocytes T de mémoire ............................................................................................................... 25
g) ILC-2 .................................................................................................................................................... 26
1.3. Obésité ......................................................................................................................................................... 28
1.3.1. Définition ............................................................................................................................................ 28
1.3.2. Modification de la réponse immunitaire constitutive suite au phénomène d’obésité .................. 28
1.4. CD27/CD70 .................................................................................................................................................. 30
1.4.1. Récepteur CD27 ................................................................................................................................. 30
1.4.2. CD70.................................................................................................................................................... 30
8
1.4.3. Rôles de l’interaction CD27/ CD70 .................................................................................................... 31
2. Partie pratique ...................................................................................................................................................... 32
2.1. Résultats antécédents ................................................................................................................................. 32
2.2. Objectifs et stratégie ................................................................................................................................... 33
2.3. Matériel et méthodes ................................................................................................................................. 33
2.3.1. Souris : génotype et caractéristiques phénotypiques XXIII ................................................................ 33
2.3.2. Elevage des souris .............................................................................................................................. 34
2.3.2.1. Conditions SPF ........................................................................................................................... 34
2.3.2.2. Régimes alimentaires et pesées ............................................................................................... 34
2.3.3. Expérimentations réalisées ............................................................................................................... 35
2.3.3.1. Epreuve d’hyperglycémie provoquée ...................................................................................... 35
2.3.3.2. Injection de la toxine diphtérique (TD) .................................................................................... 35
2.3.3.3. Prélèvement et analyses sériques ............................................................................................ 36
2.3.3.4. Analyse cytométrique (FACS) ................................................................................................... 36
2.4. Résultats et discussion ................................................................................................................................ 39
2.4.1. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur la prise de poids et l’apparition de l’état d’obésité chez des souris alimentées par un régime hyperlipidique ................................................................................. 39
2.4.2. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur l’apparition du phénomène d’insulino-résistance occasionnée par l’état d’obésité ......................................................................................................................... 40
2.4.3. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur le risque d’apparition de maladies cardio-vasculaires 42
2.4.4. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur le développement de la stéatose hépatique sous-jacente à l’état d’obésité...................................................................................................................................... 44
2.4.5. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur le nombre et les fonctions effectrices des cellules Th2 de mémoire au sein du compartiment adipeux. ......................................................................................... 45
2.4.6. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur le nombre et les fonctions effectrices des ILC-2 résidant dans le tissu adipeux .............................................................................................................................. 48
2.4.7. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur les populations macrophagiques et éosinophiliques du tissu adipeux .................................................................................................................................................... 50
2.4.8. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur la population de cellules T régulatrices résidant dans le tissu adipeux ..................................................................................................................................................... 53
2.4.9. Etude de l’impact d’une diminution de lymphocytes T régulateurs sur les populations Th2m au sein du tissu adipeux ............................................................................................................................................ 54
Conclusion et perspectives ........................................................................................................................................... 56
Liste des figures ............................................................................................................................................................. 60
Glossaire ......................................................................................................................................................................... 63
Bibliographie .................................................................................................................................................................. 64Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=80003 Rôle du récepteur CD27 dans la régulation de la réponse inflammatoire associée à l’obésité [TFE / Mémoire] / Marie Vanhollebeke, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale IBMM Gosselies Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : L’obésité touche à ce jour une grande partie de la population mondiale. Cet excès pondéral conduit au développement d’un phénomène dénommé « syndrome métabolique » augmentant les risques d’apparition du phénomène d’insulino-résistance (diabète de type 2), de maladies cardiovasculaires, de troubles hépatiques ou encore de cancers.
En conditions homéostasiques, la masse graisseuse renferme une multitude de cellules de la réponse immunitaire dite de type 2. Les fonctions effectrices de celles-ci permettent de maintenir un environnement anti-inflammatoire propice à l’homéostasie du tissu adipeux. La prise de poids engendre petit à petit des modifications quantitatives et qualitatives de ces cellules immunes ; leur nombre et la qualité de leurs fonctions diminuent au profit de l’accumulation des acteurs de la réponse immunitaire de type 1. Ces derniers instaurent un environnement inflammatoire lui-même à l’origine des pathologies sous-jacentes à l’état d’obésité.
Ce TFE traite d’une étude réalisée durant mon stage de dernière année de bachelier, menée aux côtés de Guillaume Oldenhove, d’Anaëlle Taquin et de Kevin Englebert du laboratoire d’immunobiologie de l’IBMM. Celle-ci démontre que des souris génétiquement invalidées dans l’expression du récepteur CD27 soumises à un régime hyperlipidique grossissent de manière plus modérée, présentent une plus grande sensibilité à l’insuline et de meilleures fonctions métaboliques que des rongeurs exprimant le récepteur CD27 soumis à la même alimentation. Des différences majeures dans la régulation immunitaire du tissu adipeux de ces animaux ont également été mises en évidence : malgré l’administration d’un régime riche en lipides la réponse anti-inflammatoire est maintenue chez les souris déficientes pour le récepteur CD27 a contrario des animaux qui expriment ce dernier.
L’ensemble des résultats obtenus jusqu’à présent dans le cadre de ce projet sont clairs : le récepteur CD27 joue un rôle primordial dans l’apparition de l’obésité, de l’état d’inflammation et des pathologies métaboliques qui en découlent.Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage ......................................................................................................................................... 9
Introduction ................................................................................................................................................................... 11
1. Partie théorique .................................................................................................................................................... 12
1.1. Tissu adipeux ............................................................................................................................................... 12
1.1.1. Définition générale............................................................................................................................. 12
1.1.2. Tissu adipeux blanc ............................................................................................................................ 13
1.2. Immunité ..................................................................................................................................................... 14
1.2.1. Définitions générales ......................................................................................................................... 14
1.2.2. Immunité innée .................................................................................................................................. 14
1.2.2.1. Eosinophiles .............................................................................................................................. 15
1.2.2.2. Macrophages ............................................................................................................................. 16
1.2.2.3. Cellules innées lymphoïdes (ILCs) ............................................................................................ 17
a) ILC-1 .................................................................................................................................................... 18
b) ILC-2 .................................................................................................................................................... 18
1.2.2.4. Cellules dendritiques ................................................................................................................ 18
1.2.3. Immunité adaptative.......................................................................................................................... 19
1.2.3.1. Les lymphocytes T (Ly T) ........................................................................................................... 19
a) Lymphocytes T helper de type 1 (Th1) ............................................................................................... 20
b) Lymphocytes T helper de type 2 (Th2) ............................................................................................... 20
c) Lymphocytes T helper de type 17 (Th17) .......................................................................................... 21
d) Lymphocytes T régulateurs (Treg) ..................................................................................................... 21
e) Lymphocytes T mémoires .................................................................................................................. 22
1.2.4. Immunité constitutive du tissu adipeux sain .................................................................................... 23
a) Eosinophiles ........................................................................................................................................ 24
b) Macrophages M2 ............................................................................................................................... 24
c) Cellules dendritiques .......................................................................................................................... 24
d) Lymphocytes Treg .............................................................................................................................. 25
e) Lymphocytes Th2 ................................................................................................................................ 25
f) Lymphocytes T de mémoire ............................................................................................................... 25
g) ILC-2 .................................................................................................................................................... 26
1.3. Obésité ......................................................................................................................................................... 28
1.3.1. Définition ............................................................................................................................................ 28
1.3.2. Modification de la réponse immunitaire constitutive suite au phénomène d’obésité .................. 28
1.4. CD27/CD70 .................................................................................................................................................. 30
1.4.1. Récepteur CD27 ................................................................................................................................. 30
1.4.2. CD70.................................................................................................................................................... 30
8
1.4.3. Rôles de l’interaction CD27/ CD70 .................................................................................................... 31
2. Partie pratique ...................................................................................................................................................... 32
2.1. Résultats antécédents ................................................................................................................................. 32
2.2. Objectifs et stratégie ................................................................................................................................... 33
2.3. Matériel et méthodes ................................................................................................................................. 33
2.3.1. Souris : génotype et caractéristiques phénotypiques XXIII ................................................................ 33
2.3.2. Elevage des souris .............................................................................................................................. 34
2.3.2.1. Conditions SPF ........................................................................................................................... 34
2.3.2.2. Régimes alimentaires et pesées ............................................................................................... 34
2.3.3. Expérimentations réalisées ............................................................................................................... 35
2.3.3.1. Epreuve d’hyperglycémie provoquée ...................................................................................... 35
2.3.3.2. Injection de la toxine diphtérique (TD) .................................................................................... 35
2.3.3.3. Prélèvement et analyses sériques ............................................................................................ 36
2.3.3.4. Analyse cytométrique (FACS) ................................................................................................... 36
2.4. Résultats et discussion ................................................................................................................................ 39
2.4.1. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur la prise de poids et l’apparition de l’état d’obésité chez des souris alimentées par un régime hyperlipidique ................................................................................. 39
2.4.2. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur l’apparition du phénomène d’insulino-résistance occasionnée par l’état d’obésité ......................................................................................................................... 40
2.4.3. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur le risque d’apparition de maladies cardio-vasculaires 42
2.4.4. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur le développement de la stéatose hépatique sous-jacente à l’état d’obésité...................................................................................................................................... 44
2.4.5. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur le nombre et les fonctions effectrices des cellules Th2 de mémoire au sein du compartiment adipeux. ......................................................................................... 45
2.4.6. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur le nombre et les fonctions effectrices des ILC-2 résidant dans le tissu adipeux .............................................................................................................................. 48
2.4.7. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur les populations macrophagiques et éosinophiliques du tissu adipeux .................................................................................................................................................... 50
2.4.8. Etude de l’influence du récepteur CD27 sur la population de cellules T régulatrices résidant dans le tissu adipeux ..................................................................................................................................................... 53
2.4.9. Etude de l’impact d’une diminution de lymphocytes T régulateurs sur les populations Th2m au sein du tissu adipeux ............................................................................................................................................ 54
Conclusion et perspectives ........................................................................................................................................... 56
Liste des figures ............................................................................................................................................................. 60
Glossaire ......................................................................................................................................................................... 63
Bibliographie .................................................................................................................................................................. 64Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=80003 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Étude de la spécificité de la Transportine chez Drosophila melanogaster / SÉBASTIEN ROSAR
Titre : Étude de la spécificité de la Transportine chez Drosophila melanogaster Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : SÉBASTIEN ROSAR, Auteur Année de publication : 2015 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale transportine IBMM Gosselies Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le processus d’expression génique est compartimenté dans les cellules eucaryotes : la transcription des gènes a lieu dans le noyau tandis que leur traduction se déroule dans le cytoplasme. Étant donné la compartimentation du génome dans un noyau, les cellules eucaryotes ont développé des mécanismes permettant à une grande variété de biomolécules de traverser la membrane nucléaire.
Les β-karyophérines constituent une classe de protéines impliquée dans le transport actif de protéines cargos entre le noyau et le cytoplasme. Selon qu’elles importent ou exportent les protéines cargos du noyau, les β-karyophérines sont appelées importines ou exportines.
La Transportine-1 chez les mammifères constitue un exemple d’importine dont le mécanisme d’import a été bien étudié. En effet, l’équipe de Lee et al. a identifié sur les cargos de la Transportine-1 des résidus critiques qui permettent leur interaction avec cette β-karyophérine. Cette identification a mené à l’établissement de règles pour prédire l’import de protéines par la Transportine-1. Ces règles définissent le consensus PY-NLS.
L’objectif de mon Travail de Fin d’Étude était de contribuer à l’étude de l’import par la Transportine chez un organisme modèle : Drosophila melanogaster. Pour cela, seize cargos candidats ont été sélectionnés, notamment sur base de la présence d’un consensus PY-NLS, afin de déterminer s’ils étaient ou non des cargos de la Transportine de drosophile.
La microscopie à fluorescence a permis d’évaluer la localisation subcellulaire des seize cargos candidats, y compris de trois candidats (ZC3H12, ZC3H15 et NUPL2) dont la localisation était non décrite à ce jour dans la littérature.
L’activité de la Transportine de drosophile a ensuite été inhibée par le peptide inhibiteur M9M qui a une très grande affinité pour cette β-karyophérine. La localisation subcellulaire de quatre cargos candidats était plus cytoplasmique dans les cellules traitées par M9M par rapport aux cellules n’ayant pas subi ce traitement. Il s’agit des cargos candidats Lark, HRB87F, ROA1 et How.
Une seconde stratégie a été de diminuer l’expression de la Transportine de drosophile par interférence ARN. La localisation subcellulaire des quatre cargos candidats précédemment cités a de nouveau été observée dans cette nouvelle condition. Ces cargos ont montré un changement de localisation cellulaire comparable à celui observé après traitement des cellules par M9M.
En conclusion, il est très probable que Lark, HRB87F, ROA1 et How soient des cargos de la Transportine. Ces cargos candidats s’ajoutent à une liste de cinq cargos déjà connu de la Transportine de drosophile : Squid, Rb97D, PABP2, Cubitus interruptus et Cabeza.
La présence d’un PY-NLS ne semble pas être un indicateur prédictif suffisant pour déterminer si oui ou non un cargo candidat est importé par La Transportine de drosophile. En effet, cette dernière est capable de prendre en charge des cargos qui ne répondent que partiellement à ce consensus. En revanche, la majorité des cargos sont des homologues de cargos de la Transportine de mammifère, ce qui indique une bonne conservation entre la Transportine de drosophile et de mammifère.
De nouveaux cargos candidats restent encore à être éprouvés afin d’étudier plus en profondeur l’influence de certaines caractéristiques sur l’import par la Transportine de drosophile.
À terme, le projet de recherche vise à rassembler assez d’éléments pour prédire de manière fiable si un cargo est importé ou non par la Transportine de drosophile.Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
Présentation de l’institution de stage ............................................................................... 1
Contexte général ............................................................................................................... 2
Introduction ................................................................................................................... 2
Superfamille des β-karyophérines ................................................................................. 3
Transport nucléo-cytoplasmique des protéines ......................................................... 3
Caractéristiques générales des β-karyophérines ........................................................ 3
Distinction des β-karyophérines en importines et exportines .................................... 5
Description des Transportines humaines (hTRN1 et hTRN2) ......................................... 7
Introduction................................................................................................................ 7
Les cargos de la Transportine 1 .................................................................................. 7
Structure tridimensionnelle de la Transportine ....................................................... 10
La famille des Transportines ..................................................................................... 11
Comparaison de la Transportine de Drosophila melanogaster (dTRN) avec la Transportine humaine (hTRN) ...................................................................................... 12
Introduction.............................................................................................................. 12
Expériences de similarité de spécificité de transport de cargos par la Transportine de Drosophila melanogaster..................................................................................... 14
Bilan sur les connaissances actuelles de l’import médié par la Transportine de drosophile................................................................................................................. 15
Objectifs et stratégies ..................................................................................................... 16
Matériel et méthodes ...................................................................................................... 18
Introduction ................................................................................................................. 18
Culture cellulaire .......................................................................................................... 18
Western blot ................................................................................................................ 18
Page | ii
Transfection de plasmides inductibles au cuivre ......................................................... 19
Fixation des lamelles couvre-objet et installation sur lame pour la microscopie à fluorescence ................................................................................................................. 20
Microscopie à fluorescence ......................................................................................... 21
Préparation d’ARN double brin (dsRNA) ...................................................................... 23
Traitement des cellules S2 au dsRNA ........................................................................... 24
Extraction d’ARN des cellules S2 .................................................................................. 24
Production d’ADN complémentaire (cDNA) à partir d’ARN par rétrotranscription...... 25
PCR quantitative en temps réel (RT-QPCR) .................................................................. 26
Résultats et discussion .................................................................................................... 29
Sélection de cargos candidats ...................................................................................... 29
Construction de plasmides ........................................................................................... 30
Vérification de l’expression des fusions cherry-cargo ................................................. 31
Effet de l’inhibition de la Transportine par expression du peptide M9M sur la localisation des cargos candidats ................................................................................. 34
Effet de l’inhibition de l’expression de la Transportine par interférence ARN sur la localisation des cargos candidats ................................................................................. 43
Principe de l’interférence ARN ................................................................................. 43
Mise en oeuvre de l’interférence ARN dans les cellules S2 de Drosophile ................ 45
Vérification de l’inhibition de l’expression des gènes-cibles par PCR quantitative en temps réel ................................................................................................................ 47
Effet sur la localisation des cargos candidats ........................................................... 51
Conclusion et perspectives .............................................................................................. 57
Liste des abréviations ...................................................................................................... 59
Bibliographie ................................................................................................................... 61
Annexes ........................................................................................................................... 64Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64240 Étude de la spécificité de la Transportine chez Drosophila melanogaster [TFE / Mémoire] / SÉBASTIEN ROSAR, Auteur . - 2015.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale transportine IBMM Gosselies Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le processus d’expression génique est compartimenté dans les cellules eucaryotes : la transcription des gènes a lieu dans le noyau tandis que leur traduction se déroule dans le cytoplasme. Étant donné la compartimentation du génome dans un noyau, les cellules eucaryotes ont développé des mécanismes permettant à une grande variété de biomolécules de traverser la membrane nucléaire.
Les β-karyophérines constituent une classe de protéines impliquée dans le transport actif de protéines cargos entre le noyau et le cytoplasme. Selon qu’elles importent ou exportent les protéines cargos du noyau, les β-karyophérines sont appelées importines ou exportines.
La Transportine-1 chez les mammifères constitue un exemple d’importine dont le mécanisme d’import a été bien étudié. En effet, l’équipe de Lee et al. a identifié sur les cargos de la Transportine-1 des résidus critiques qui permettent leur interaction avec cette β-karyophérine. Cette identification a mené à l’établissement de règles pour prédire l’import de protéines par la Transportine-1. Ces règles définissent le consensus PY-NLS.
L’objectif de mon Travail de Fin d’Étude était de contribuer à l’étude de l’import par la Transportine chez un organisme modèle : Drosophila melanogaster. Pour cela, seize cargos candidats ont été sélectionnés, notamment sur base de la présence d’un consensus PY-NLS, afin de déterminer s’ils étaient ou non des cargos de la Transportine de drosophile.
La microscopie à fluorescence a permis d’évaluer la localisation subcellulaire des seize cargos candidats, y compris de trois candidats (ZC3H12, ZC3H15 et NUPL2) dont la localisation était non décrite à ce jour dans la littérature.
L’activité de la Transportine de drosophile a ensuite été inhibée par le peptide inhibiteur M9M qui a une très grande affinité pour cette β-karyophérine. La localisation subcellulaire de quatre cargos candidats était plus cytoplasmique dans les cellules traitées par M9M par rapport aux cellules n’ayant pas subi ce traitement. Il s’agit des cargos candidats Lark, HRB87F, ROA1 et How.
Une seconde stratégie a été de diminuer l’expression de la Transportine de drosophile par interférence ARN. La localisation subcellulaire des quatre cargos candidats précédemment cités a de nouveau été observée dans cette nouvelle condition. Ces cargos ont montré un changement de localisation cellulaire comparable à celui observé après traitement des cellules par M9M.
En conclusion, il est très probable que Lark, HRB87F, ROA1 et How soient des cargos de la Transportine. Ces cargos candidats s’ajoutent à une liste de cinq cargos déjà connu de la Transportine de drosophile : Squid, Rb97D, PABP2, Cubitus interruptus et Cabeza.
La présence d’un PY-NLS ne semble pas être un indicateur prédictif suffisant pour déterminer si oui ou non un cargo candidat est importé par La Transportine de drosophile. En effet, cette dernière est capable de prendre en charge des cargos qui ne répondent que partiellement à ce consensus. En revanche, la majorité des cargos sont des homologues de cargos de la Transportine de mammifère, ce qui indique une bonne conservation entre la Transportine de drosophile et de mammifère.
De nouveaux cargos candidats restent encore à être éprouvés afin d’étudier plus en profondeur l’influence de certaines caractéristiques sur l’import par la Transportine de drosophile.
À terme, le projet de recherche vise à rassembler assez d’éléments pour prédire de manière fiable si un cargo est importé ou non par la Transportine de drosophile.Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
Présentation de l’institution de stage ............................................................................... 1
Contexte général ............................................................................................................... 2
Introduction ................................................................................................................... 2
Superfamille des β-karyophérines ................................................................................. 3
Transport nucléo-cytoplasmique des protéines ......................................................... 3
Caractéristiques générales des β-karyophérines ........................................................ 3
Distinction des β-karyophérines en importines et exportines .................................... 5
Description des Transportines humaines (hTRN1 et hTRN2) ......................................... 7
Introduction................................................................................................................ 7
Les cargos de la Transportine 1 .................................................................................. 7
Structure tridimensionnelle de la Transportine ....................................................... 10
La famille des Transportines ..................................................................................... 11
Comparaison de la Transportine de Drosophila melanogaster (dTRN) avec la Transportine humaine (hTRN) ...................................................................................... 12
Introduction.............................................................................................................. 12
Expériences de similarité de spécificité de transport de cargos par la Transportine de Drosophila melanogaster..................................................................................... 14
Bilan sur les connaissances actuelles de l’import médié par la Transportine de drosophile................................................................................................................. 15
Objectifs et stratégies ..................................................................................................... 16
Matériel et méthodes ...................................................................................................... 18
Introduction ................................................................................................................. 18
Culture cellulaire .......................................................................................................... 18
Western blot ................................................................................................................ 18
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Transfection de plasmides inductibles au cuivre ......................................................... 19
Fixation des lamelles couvre-objet et installation sur lame pour la microscopie à fluorescence ................................................................................................................. 20
Microscopie à fluorescence ......................................................................................... 21
Préparation d’ARN double brin (dsRNA) ...................................................................... 23
Traitement des cellules S2 au dsRNA ........................................................................... 24
Extraction d’ARN des cellules S2 .................................................................................. 24
Production d’ADN complémentaire (cDNA) à partir d’ARN par rétrotranscription...... 25
PCR quantitative en temps réel (RT-QPCR) .................................................................. 26
Résultats et discussion .................................................................................................... 29
Sélection de cargos candidats ...................................................................................... 29
Construction de plasmides ........................................................................................... 30
Vérification de l’expression des fusions cherry-cargo ................................................. 31
Effet de l’inhibition de la Transportine par expression du peptide M9M sur la localisation des cargos candidats ................................................................................. 34
Effet de l’inhibition de l’expression de la Transportine par interférence ARN sur la localisation des cargos candidats ................................................................................. 43
Principe de l’interférence ARN ................................................................................. 43
Mise en oeuvre de l’interférence ARN dans les cellules S2 de Drosophile ................ 45
Vérification de l’inhibition de l’expression des gènes-cibles par PCR quantitative en temps réel ................................................................................................................ 47
Effet sur la localisation des cargos candidats ........................................................... 51
Conclusion et perspectives .............................................................................................. 57
Liste des abréviations ...................................................................................................... 59
Bibliographie ................................................................................................................... 61
Annexes ........................................................................................................................... 64Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64240 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire