Centre de Documentation Campus Montignies
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Mardi : 8h-18h30
Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Auteur ALEXIS MATHY |
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Mise au point de marquage de biomarqueurs de sénescence dans des cultures de fibroblastes humains. / ALEXIS MATHY
Titre : Mise au point de marquage de biomarqueurs de sénescence dans des cultures de fibroblastes humains. Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : ALEXIS MATHY, Auteur Année de publication : 2015 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Université de Namur Sénescence : cellules Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Résumé
Actuellement, le biomarqueur le plus utilisé pour quantifier la proportion de cellules sénescentes dans une culture cellulaire est l’activité -galactosidase associée à la sénescence (SA-βgal). Toutefois, la quantification de ce marqueur n’est pas évidente et reste relativement arbitraire. Il semble utile de combiner le test SA-βgal avec d’autres marquages de protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire et dans la réparation des dommages à l’ADN.
Nous avons réalisé des marquages de protéines exprimées lorsque les cellules sont en prolifération (Ki-67 et PCNA), de protéines impliquées dans l’arrêt du cycle cellulaire (p16 et p21) et de protéines activées par des dommages à l’ADN (H2AX). Nous avons fait ces marquages sur fibroblastes humains de derme (FHDs) jeunes (entre passages (P) P26 à P30) et sur FHDs sénescents (entre P36 et P38). Nous avons réalisé ces marquages seuls ou combinés, et effectuer la quantification. Les immunomarquages sur fibroblastes ont été mis au point avec succès. Ces marquages ont ensuite été testés sur coupe de peau humaine et sur épidermes reconstruits in vitro, mais ceux-ci nécessitent des mises au point ultérieures.
Nous avons également étudié les radeaux lipidiques dans les FHDs, d’une part en réalisant des marquages des constituants des radeaux lipidiques et d’autre part en étudiant les voies de signalisation activées suite à une perturbation des constituants des radeaux lipidiques.
Nous avons visualisé les radeaux lipidiques en suivant le marquage de sphingomyéline exogène (BODIPY-SM), le marquage de shingomyéline endogène par la lysénine et le marquage du cholestérol par la toxine-théta. Ces marquages ont été faits sur cellules vivantes.
Pour observer la perturbation de ces radeaux, nous avons réalisé des westerns blots sur les différentes formes phosphorylées du récepteur au PDGF (PDGF-R) après déplétion du cholestérol suite à un traitement des FHDs une heure avec la méthyl-béta-cyclodextrine (MβCD). L’activation de p38 et de l’EGF-R a aussi été analysée. Nous avons réalisé ces analyses dans des cultures de FHDs jeunes et sénescents. Les résultats obtenus montrent que la voie du PDGF-R n’est pas impliquée dans l’activation de p38 par la MβCD. Et si l’EGF-R n’est pas non plus activé par la MβCD, une protéine est détectée par l’anticorps anti-EGF-R 1173 dans les cellules stimulées avec la MβCD, mais à un poids nettement inférieur à celui de l’EGF-R. Des analyses complémentaires devront confirmer et identifier cette protéine.Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage : 5
I. Introduction 7
1. La sénescence 7
1. La sénescence réplicative 8
2. La sénescence induite 9
3. Biomarqueurs de sénescence 9
a. Morphologie cellulaire : 10
b. SA-β-Gal 10
c. Arrêt irréversible des divisions 10
d. Différence de l’expression des gènes et des protéines 12
e. Raccourcissement des télomères 12
f. SASP 13
2. Les radeaux lipidiques 14
a. Description d’un radeau lipidique 14
b. Les techniques d’étude des radeaux lipidiques : 15
c. Voie activée lors de la perturbation des radeaux lipidiques dans les kératinocytes : 16
II. Objectifs 18
1. Mise au point de marquage en immunofluorescence des cellules en senescence 18
2. Étude de radeaux lipidiques chez les fibroblastes jeunes et sénescents 18
1. Visualisation des radeaux lipidiques : 19
2. Étude des perturbations de ces radeaux : 19
III. Matériel et méthode 20
1. Culture cellulaire 470
1. Repiquages 470
a. Matériel : 470
b. Méthode : 21
2. Stimulation à l’EGF 22
a. Matériel : 22
b. Méthode : 512
3. Déplétion du cholestérol avec la MβCD 512
a. Matériel : 23
b. Méthode : 23
2. SA-βGal 533
a. Matériel : 24
b. Méthode : 554
3. Extraction d’ARN, rétro-transcription et PCR en temps réel 575
a. Matériel 575
b. Méthode : 596
4. Immunofluorescence 617
a. Matériel : 28
b. Méthode : 29
5. Dosage des sphingolipides 31
a. Matériel : 31
b. Méthode : 32
6. Marquage avec des sondes 32
a. Matériel : 33
b. Méthode : 33
7. Western-Blot 34
a. Matériel : 34
b. Méthode : 35
IV. Résultats : 40
1. Étude de la senescence : 40
1. SA-βGal : 40
2. RT-PCR : 40
2. Étude par Immunofluorescence des marqueurs de senescence sur cellules 41
3. Étude par Immunofluorescence des marqueurs de senescence sur coupes de peau 44
4. Visualisation des radeaux lipidiques : 44
5. Dosage de la sphingomyéline : 45
6. Étude des voies activées lors de la perturbation des lipides rafts par une déplétion du cholestérol : 46
V. Conclusion et perspective : 47
VI. Bibliographie : 48
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64092 Mise au point de marquage de biomarqueurs de sénescence dans des cultures de fibroblastes humains. [TFE / Mémoire] / ALEXIS MATHY, Auteur . - 2015.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Université de Namur Sénescence : cellules Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Résumé
Actuellement, le biomarqueur le plus utilisé pour quantifier la proportion de cellules sénescentes dans une culture cellulaire est l’activité -galactosidase associée à la sénescence (SA-βgal). Toutefois, la quantification de ce marqueur n’est pas évidente et reste relativement arbitraire. Il semble utile de combiner le test SA-βgal avec d’autres marquages de protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire et dans la réparation des dommages à l’ADN.
Nous avons réalisé des marquages de protéines exprimées lorsque les cellules sont en prolifération (Ki-67 et PCNA), de protéines impliquées dans l’arrêt du cycle cellulaire (p16 et p21) et de protéines activées par des dommages à l’ADN (H2AX). Nous avons fait ces marquages sur fibroblastes humains de derme (FHDs) jeunes (entre passages (P) P26 à P30) et sur FHDs sénescents (entre P36 et P38). Nous avons réalisé ces marquages seuls ou combinés, et effectuer la quantification. Les immunomarquages sur fibroblastes ont été mis au point avec succès. Ces marquages ont ensuite été testés sur coupe de peau humaine et sur épidermes reconstruits in vitro, mais ceux-ci nécessitent des mises au point ultérieures.
Nous avons également étudié les radeaux lipidiques dans les FHDs, d’une part en réalisant des marquages des constituants des radeaux lipidiques et d’autre part en étudiant les voies de signalisation activées suite à une perturbation des constituants des radeaux lipidiques.
Nous avons visualisé les radeaux lipidiques en suivant le marquage de sphingomyéline exogène (BODIPY-SM), le marquage de shingomyéline endogène par la lysénine et le marquage du cholestérol par la toxine-théta. Ces marquages ont été faits sur cellules vivantes.
Pour observer la perturbation de ces radeaux, nous avons réalisé des westerns blots sur les différentes formes phosphorylées du récepteur au PDGF (PDGF-R) après déplétion du cholestérol suite à un traitement des FHDs une heure avec la méthyl-béta-cyclodextrine (MβCD). L’activation de p38 et de l’EGF-R a aussi été analysée. Nous avons réalisé ces analyses dans des cultures de FHDs jeunes et sénescents. Les résultats obtenus montrent que la voie du PDGF-R n’est pas impliquée dans l’activation de p38 par la MβCD. Et si l’EGF-R n’est pas non plus activé par la MβCD, une protéine est détectée par l’anticorps anti-EGF-R 1173 dans les cellules stimulées avec la MβCD, mais à un poids nettement inférieur à celui de l’EGF-R. Des analyses complémentaires devront confirmer et identifier cette protéine.Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage : 5
I. Introduction 7
1. La sénescence 7
1. La sénescence réplicative 8
2. La sénescence induite 9
3. Biomarqueurs de sénescence 9
a. Morphologie cellulaire : 10
b. SA-β-Gal 10
c. Arrêt irréversible des divisions 10
d. Différence de l’expression des gènes et des protéines 12
e. Raccourcissement des télomères 12
f. SASP 13
2. Les radeaux lipidiques 14
a. Description d’un radeau lipidique 14
b. Les techniques d’étude des radeaux lipidiques : 15
c. Voie activée lors de la perturbation des radeaux lipidiques dans les kératinocytes : 16
II. Objectifs 18
1. Mise au point de marquage en immunofluorescence des cellules en senescence 18
2. Étude de radeaux lipidiques chez les fibroblastes jeunes et sénescents 18
1. Visualisation des radeaux lipidiques : 19
2. Étude des perturbations de ces radeaux : 19
III. Matériel et méthode 20
1. Culture cellulaire 470
1. Repiquages 470
a. Matériel : 470
b. Méthode : 21
2. Stimulation à l’EGF 22
a. Matériel : 22
b. Méthode : 512
3. Déplétion du cholestérol avec la MβCD 512
a. Matériel : 23
b. Méthode : 23
2. SA-βGal 533
a. Matériel : 24
b. Méthode : 554
3. Extraction d’ARN, rétro-transcription et PCR en temps réel 575
a. Matériel 575
b. Méthode : 596
4. Immunofluorescence 617
a. Matériel : 28
b. Méthode : 29
5. Dosage des sphingolipides 31
a. Matériel : 31
b. Méthode : 32
6. Marquage avec des sondes 32
a. Matériel : 33
b. Méthode : 33
7. Western-Blot 34
a. Matériel : 34
b. Méthode : 35
IV. Résultats : 40
1. Étude de la senescence : 40
1. SA-βGal : 40
2. RT-PCR : 40
2. Étude par Immunofluorescence des marqueurs de senescence sur cellules 41
3. Étude par Immunofluorescence des marqueurs de senescence sur coupes de peau 44
4. Visualisation des radeaux lipidiques : 44
5. Dosage de la sphingomyéline : 45
6. Étude des voies activées lors de la perturbation des lipides rafts par une déplétion du cholestérol : 46
V. Conclusion et perspective : 47
VI. Bibliographie : 48
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64092 Exemplaires
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