Centre de Documentation Campus Montignies
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Auteur Myriam Belmahi |
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Titre : Mécanismes de résistance aux aminoglycosides : le rôle du polyphosphate Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Myriam Belmahi, Auteur ; Nicolas Kesteman, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : aminoglycosides polyphosphate laboratoire génétique et physiologie bactérienne institut de biologie et médecine molécule IBMM Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le développement et l’utilisation d’antibiotique à la moitié du 20e siècle constituèrent une réelle révolution, contribuant à l’augmentation de l’espérance de vie humaine. Cependant, alors la découverte d’antibiotique connu un déclin à partir des années 80, des souches de bactéries résistantes aux antibiotiques commencèrent à se répandre. Ces résistances ont rapidement constitué un problème de santé publique préoccupant la communauté scientifique et les pouvoirs publics qui investissent dans l’exploration de solutions. Cette recherche de solutions contre les bactéries résistantes est très diversifiée et comprend notamment la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, pour le traitement des maladies infectieuses, où l’étude du métabolisme du polyphosphate trouve tout son intérêt. Le polyphosphate est un polymère de phosphate inorganique dont l’étude débuta à la fin du 20e siècle. Il s’agit d’une molécule ubiquitaire liée aux origines de la vie qui a été retrouvée à la fois chez les procaryotes, les eucaryotes et les archées (bien qu’elle ait majoritairement été étudiée chez les procaryotes).
Ce polymère intervient dans un très grand nombre de mécanismes cellulaires mais a surtout souvent été associé aux mécanismes de résistance aux stress. Sa présence chez les bactéries a notamment été associée à une meilleure résistance aux antibiotiques. C’est la raison pour laquelle la synthèse du polyphosphate fait aujourd’hui l’objet d’un grand intérêt en tant que potentielle cible dans la lutte contre les infections bactériennes.
Ce projet de stage a pour but de découvrir le rôle que joue le polyphosphate dans la résistance aux aminoglycosides chez Escherichia coli. En effet, au cours de précédentes recherches, François Beaufay a découvert que l’absence de polyphosphate sensibilisait des souches d’E. coli (K-12 MG1655) à la présence de certains antibiotiques, dont les aminoglycosides (agissantcontre la fidélité de la traduction protéique) mais pas à l’exposition à d’autres antibiotiques agissant sur le blocage de la traduction (tel que le chloramphénicol). Ces observations ont alors suggéré que le polyphosphate pourrait être impliqué dans la fidélité de la traduction des
protéines. De plus, des résultats obtenus par Sarah Willems au cours de son stage à l’IBMM ont montré que les souches d’E. coli incapables de synthétiser le polyphosphate étaient plus sensibles à une exposition à la D-cyclosérine, alors qu’elles ne l’étaient pas à d’autres antibiotiques ciblant la paroi bactérienne (tels que les β-lactamines). Ces observations ont suggéré que la D-cyclosérine pourrait dès lors avoir une cible secondaire, autre que la paroi bactérienne, au niveau de laquelle le polyphosphate pourrait intervenir. Ainsi, le second objectif de ce projet est de tenter de déterminer si cette potentielle cible secondaire de la D-
cyclosérine serait la traduction protéique.Note de contenu : Table des matières
Remerciements...................................................................................................................................0
Table des matières..............................................................................................................................1
Présentation du lieu de stage..............................................................................................................4
Introduction générale .........................................................................................................................5
Partie théorique :................................................................................................................................7
Contexte général.............................................................................................................................7
1. Les antibiotiques : contexte historique ................................................................................7
2. Les antibiotiques : le revers de la médaille...........................................................................7
3. Le polyphosphate ................................................................................................................9
3.1. Origines du polyphosphate ..........................................................................................9
3.2. Rôles et fonctions biologiques du polyphosphate.......................................................10
3.2.1. Synthèse et dégradation du polyphosphate........................................................10
3.2.2. Chaperonne .......................................................................................................11
3.2.3. Rôle dans la réponse au stress............................................................................12
3.2.4. Rôle dans le manque en ressource nutritive .......................................................13
3.2.5. Rôle du polyphosphate dans la traduction bactérienne ......................................14
4. Le peptidoglycane .............................................................................................................14
4.1. Structure du peptidoglycane ......................................................................................15
4.2. Synthèse du peptidoglycane ......................................................................................16
4.2.1. Étapes cytoplasmiques de la synthèse du peptidoglycane ..................................16
4.2.2. Étapes membranaire de la synthèse du peptidoglycane .....................................16
4.2.3. Étapes périplasmique de la synthèse du peptidoglycane ....................................17
5. Antibiotiques agissant sur la synthèse de la paroi bactérienne...........................................18
5.1. Les β-lactamines ........................................................................................................18
5.2. La D-cyclosérine.........................................................................................................18
6. La synthèse protéique chez les bactéries ...........................................................................19
6.1. La traduction bactérienne ..........................................................................................19
6.2. Déroulement de la traduction bactérienne ................................................................19
6.2.1. L’initiation de la traduction chez les procaryotes ................................................19
6.2.2. L’élongation de la traduction chez les procaryotes .............................................20
6.2.3. La terminaison de la traduction chez les procaryotes..........................................21
6.3. Les principaux acteurs de la traduction bactérienne...................................................22
6.3.1. Le ribosome .......................................................................................................22
2
7. La fidélité de la traduction .................................................................................................23
8. Les erreurs de lecture ........................................................................................................24
9. Antibiotiques agissant sur la synthèse protéique ...............................................................24
9.1. Les aminoglycosides...................................................................................................25
9.2. Mutations liées à la résistance aux aminoglycosides ..................................................26
Objectifs et stratégies ...................................................................................................................27
1. Point de départ du stage....................................................................................................27
2. Objectifs du stage ..............................................................................................................28
3. Stratégies mises en place...................................................................................................28
Partie pratique..................................................................................................................................30
Matériels et méthodes..................................................................................................................30
1. Milieux et antibiotiques utilisés .........................................................................................30
1.1. Le milieu LB................................................................................................................30
1.2. Le milieu MOPS glucose .............................................................................................30
1.3. Antibiotiques .............................................................................................................30
2. Les conditions testées........................................................................................................30
3. Protocoles utilisés pour la construction des conditions testées ..........................................31
2.1. Protocole de miniprep ...............................................................................................31
2.2. Prépapration de bactéries compétentes ....................................................................32
2.3. Protocole d’électroporation .......................................................................................33
4. Le test β-galactosidase ......................................................................................................33
3.1. Protocole initial du test β-galactosidase (réalisé en tube de 2 ml) ..............................33
3.2. Protocole finale (utilisé pour les tests en plaques 96 puits) ........................................34
Résultats et discussion ..................................................................................................................35
1. Le test β-galactosidase ......................................................................................................35
1.1. Principe du test β-galactosidase.................................................................................35
1.2. Mise au point du test β-galactosidase ........................................................................35
1.2.1. Bruit de fond trop élevé .....................................................................................35
1.2.2. Problème de reproductibilité des résultats .........................................................37
2. Analyse des résultats des tests β-galactosidase..................................................................39
2.1. Démarche d’analyses des résultats : illustrée à l’aide du pSG 34-11 ...........................39
2.1.1. Calcul de l’activité β-galactosidase (en M.U.)......................................................39
2.1.2. Calcul du taux d’erreur commise lors de la traduction ........................................42
2.2. Analyse des taux d’erreur de lectures des deux autres conditions tests......................43
2.2.1. Taux d’erreur des souches contenant le pSG 627................................................43
2.2.2. Taux d’erreur de lecture des souches avec pSG 12-6 ..........................................44
3
3. Test de la D-cyclosérine .....................................................................................................45
3.1. Création du milieu isotonique ....................................................................................45
3.2. Test β-galactosidase sur les souches exposées à la D-cyclosérine ...............................48
4. Discussions des résultats obtenus......................................................................................50
Conclusions générales et perspectives ..............................................................................................51
Liste des figures ................................................................................................................................53
Bibliographie ....................................................................................................................................56
Annexes..............................................................................................................................................0
Annexe 1.........................................................................................................................................0
Annexe 2.........................................................................................................................................0
Résumé...............................................................................................................................................0
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100295 Mécanismes de résistance aux aminoglycosides : le rôle du polyphosphate [TFE / Mémoire] / Myriam Belmahi, Auteur ; Nicolas Kesteman, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur
Langues : Français (fre)
Mots-clés : aminoglycosides polyphosphate laboratoire génétique et physiologie bactérienne institut de biologie et médecine molécule IBMM Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le développement et l’utilisation d’antibiotique à la moitié du 20e siècle constituèrent une réelle révolution, contribuant à l’augmentation de l’espérance de vie humaine. Cependant, alors la découverte d’antibiotique connu un déclin à partir des années 80, des souches de bactéries résistantes aux antibiotiques commencèrent à se répandre. Ces résistances ont rapidement constitué un problème de santé publique préoccupant la communauté scientifique et les pouvoirs publics qui investissent dans l’exploration de solutions. Cette recherche de solutions contre les bactéries résistantes est très diversifiée et comprend notamment la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, pour le traitement des maladies infectieuses, où l’étude du métabolisme du polyphosphate trouve tout son intérêt. Le polyphosphate est un polymère de phosphate inorganique dont l’étude débuta à la fin du 20e siècle. Il s’agit d’une molécule ubiquitaire liée aux origines de la vie qui a été retrouvée à la fois chez les procaryotes, les eucaryotes et les archées (bien qu’elle ait majoritairement été étudiée chez les procaryotes).
Ce polymère intervient dans un très grand nombre de mécanismes cellulaires mais a surtout souvent été associé aux mécanismes de résistance aux stress. Sa présence chez les bactéries a notamment été associée à une meilleure résistance aux antibiotiques. C’est la raison pour laquelle la synthèse du polyphosphate fait aujourd’hui l’objet d’un grand intérêt en tant que potentielle cible dans la lutte contre les infections bactériennes.
Ce projet de stage a pour but de découvrir le rôle que joue le polyphosphate dans la résistance aux aminoglycosides chez Escherichia coli. En effet, au cours de précédentes recherches, François Beaufay a découvert que l’absence de polyphosphate sensibilisait des souches d’E. coli (K-12 MG1655) à la présence de certains antibiotiques, dont les aminoglycosides (agissantcontre la fidélité de la traduction protéique) mais pas à l’exposition à d’autres antibiotiques agissant sur le blocage de la traduction (tel que le chloramphénicol). Ces observations ont alors suggéré que le polyphosphate pourrait être impliqué dans la fidélité de la traduction des
protéines. De plus, des résultats obtenus par Sarah Willems au cours de son stage à l’IBMM ont montré que les souches d’E. coli incapables de synthétiser le polyphosphate étaient plus sensibles à une exposition à la D-cyclosérine, alors qu’elles ne l’étaient pas à d’autres antibiotiques ciblant la paroi bactérienne (tels que les β-lactamines). Ces observations ont suggéré que la D-cyclosérine pourrait dès lors avoir une cible secondaire, autre que la paroi bactérienne, au niveau de laquelle le polyphosphate pourrait intervenir. Ainsi, le second objectif de ce projet est de tenter de déterminer si cette potentielle cible secondaire de la D-
cyclosérine serait la traduction protéique.Note de contenu : Table des matières
Remerciements...................................................................................................................................0
Table des matières..............................................................................................................................1
Présentation du lieu de stage..............................................................................................................4
Introduction générale .........................................................................................................................5
Partie théorique :................................................................................................................................7
Contexte général.............................................................................................................................7
1. Les antibiotiques : contexte historique ................................................................................7
2. Les antibiotiques : le revers de la médaille...........................................................................7
3. Le polyphosphate ................................................................................................................9
3.1. Origines du polyphosphate ..........................................................................................9
3.2. Rôles et fonctions biologiques du polyphosphate.......................................................10
3.2.1. Synthèse et dégradation du polyphosphate........................................................10
3.2.2. Chaperonne .......................................................................................................11
3.2.3. Rôle dans la réponse au stress............................................................................12
3.2.4. Rôle dans le manque en ressource nutritive .......................................................13
3.2.5. Rôle du polyphosphate dans la traduction bactérienne ......................................14
4. Le peptidoglycane .............................................................................................................14
4.1. Structure du peptidoglycane ......................................................................................15
4.2. Synthèse du peptidoglycane ......................................................................................16
4.2.1. Étapes cytoplasmiques de la synthèse du peptidoglycane ..................................16
4.2.2. Étapes membranaire de la synthèse du peptidoglycane .....................................16
4.2.3. Étapes périplasmique de la synthèse du peptidoglycane ....................................17
5. Antibiotiques agissant sur la synthèse de la paroi bactérienne...........................................18
5.1. Les β-lactamines ........................................................................................................18
5.2. La D-cyclosérine.........................................................................................................18
6. La synthèse protéique chez les bactéries ...........................................................................19
6.1. La traduction bactérienne ..........................................................................................19
6.2. Déroulement de la traduction bactérienne ................................................................19
6.2.1. L’initiation de la traduction chez les procaryotes ................................................19
6.2.2. L’élongation de la traduction chez les procaryotes .............................................20
6.2.3. La terminaison de la traduction chez les procaryotes..........................................21
6.3. Les principaux acteurs de la traduction bactérienne...................................................22
6.3.1. Le ribosome .......................................................................................................22
2
7. La fidélité de la traduction .................................................................................................23
8. Les erreurs de lecture ........................................................................................................24
9. Antibiotiques agissant sur la synthèse protéique ...............................................................24
9.1. Les aminoglycosides...................................................................................................25
9.2. Mutations liées à la résistance aux aminoglycosides ..................................................26
Objectifs et stratégies ...................................................................................................................27
1. Point de départ du stage....................................................................................................27
2. Objectifs du stage ..............................................................................................................28
3. Stratégies mises en place...................................................................................................28
Partie pratique..................................................................................................................................30
Matériels et méthodes..................................................................................................................30
1. Milieux et antibiotiques utilisés .........................................................................................30
1.1. Le milieu LB................................................................................................................30
1.2. Le milieu MOPS glucose .............................................................................................30
1.3. Antibiotiques .............................................................................................................30
2. Les conditions testées........................................................................................................30
3. Protocoles utilisés pour la construction des conditions testées ..........................................31
2.1. Protocole de miniprep ...............................................................................................31
2.2. Prépapration de bactéries compétentes ....................................................................32
2.3. Protocole d’électroporation .......................................................................................33
4. Le test β-galactosidase ......................................................................................................33
3.1. Protocole initial du test β-galactosidase (réalisé en tube de 2 ml) ..............................33
3.2. Protocole finale (utilisé pour les tests en plaques 96 puits) ........................................34
Résultats et discussion ..................................................................................................................35
1. Le test β-galactosidase ......................................................................................................35
1.1. Principe du test β-galactosidase.................................................................................35
1.2. Mise au point du test β-galactosidase ........................................................................35
1.2.1. Bruit de fond trop élevé .....................................................................................35
1.2.2. Problème de reproductibilité des résultats .........................................................37
2. Analyse des résultats des tests β-galactosidase..................................................................39
2.1. Démarche d’analyses des résultats : illustrée à l’aide du pSG 34-11 ...........................39
2.1.1. Calcul de l’activité β-galactosidase (en M.U.)......................................................39
2.1.2. Calcul du taux d’erreur commise lors de la traduction ........................................42
2.2. Analyse des taux d’erreur de lectures des deux autres conditions tests......................43
2.2.1. Taux d’erreur des souches contenant le pSG 627................................................43
2.2.2. Taux d’erreur de lecture des souches avec pSG 12-6 ..........................................44
3
3. Test de la D-cyclosérine .....................................................................................................45
3.1. Création du milieu isotonique ....................................................................................45
3.2. Test β-galactosidase sur les souches exposées à la D-cyclosérine ...............................48
4. Discussions des résultats obtenus......................................................................................50
Conclusions générales et perspectives ..............................................................................................51
Liste des figures ................................................................................................................................53
Bibliographie ....................................................................................................................................56
Annexes..............................................................................................................................................0
Annexe 1.........................................................................................................................................0
Annexe 2.........................................................................................................................................0
Résumé...............................................................................................................................................0
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