Centre de Documentation Campus Montignies
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Mercredi 9h-16h30
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1 résultat(s) recherche sur le mot-clé 'ARN : extraction, dosage'
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Mise au point de la détection du mutant EGFRvIII par PCR quantitative (RT- qPCR) / Rabi ADAMOU YAROU
Titre : Mise au point de la détection du mutant EGFRvIII par PCR quantitative (RT- qPCR) Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Rabi ADAMOU YAROU, Auteur ; Pascal Vannuffel, Directeur de la recherche Année de publication : 2015 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale IPG Gosselies Cancer : dépistage Acides nucléiques : concept Mutations génétiques // cancer Gène EGFR Réaction de polymération en chaine PCR RT-PCR ARN : extraction, dosage Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Résumé
Le cancer est en augmentation dans le monde. Etant en partie provoqué par des mutations génétiques, il est important d'analyser ces mutations afin de garantir un bon suivi et un meilleur traitement des patients. La biologie moléculaire joue un rôle primordial dans la recherche de mutations et de marqueurs moléculaires pour assurer le suivi thérapeutique des malades.
Nos expériences ont pour but de détecter la mutation EGFRvIII due à une délétion de l'exon2 à l'exon7 suivi d'un réarrangement entre l'exon 1 et 8 pouvant entre autres provoquer une tumeur dans le cerveau. Avant d'arriver à notre objectif, nous avons d'abord, testé différents kits d'extraction d'ARN à partir de tissus fixés et de RT-PCR. Suite à une comparaison de nos résultats, nous avons choisi la technique la plus sensible et plus robuste. Pour confirmer notre choix, nous avons dressé un dossier de validation au moyen de tests supplémentaires tels que la répétabilité et la reproductibilité. Suite à ces analyses, nous avons pu intégrer ces techniques dans notre recherche du variant EGFRvIII.
Après l'extraction d'ARN à partir des échantillons fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), nous avons réalisé une reverse transcription RT-PCR. L'ADNc obtenu est amplifié par PCR quantitative grâce à un Light Cycler 480. Une mise au point a été effectuée afin de choisir les amorces spécifiques, le programme de qRT-PCR et la concentration d'ARN minimale nécessaire. A ce stade, l'analyse finale "EGFRvIII" permettait uniquement un résultat qualitatif. Des courbes d'étalonnage à partir de nombre de copies connues de fragments d'ADN ont été réalisées afin d'obtenir un résultat quantitatif.
La détection du variant EGFRvIII s'est effectuée sur des échantillons cliniques. Les résultats obtenus ont montré que six patients sur vint et un testés sont porteurs de la mutation EGFRvIII . Ce résultat a été confirmé par séquençage. Toutes les séquences positives étaient identiques et portaient une délétion de l'exon2 à l'exon7.
Nos résultats étant satisfaisant, cette analyse peut être utilisée en routine au laboratoire de l'IPG.
Grâce à l'émergence des techniques et des recherches en biologie moléculaire, il est possible de développer des tests spécifiques et de plus en plus sensibles afin d'assurer le diagnostic et le suivi de patients atteint de cancer. En parallèle à ce développement, la recherche se spécialise dans la mise au point de thérapies ciblées spécifiques à certaines mutations.
Note de contenu : Table de matière
Remerciements
Introduction ..............................................................................................................9
Partie théorique......................................................................................................10
1. Les acides nucléiques .........................................................................................10
1.1 Définition......................................................................................................10
1.2 Structure.......................................................................................................10
1.3 ADN...............................................................................................................11
1.4 ARN...............................................................................................................12
1.5 Le gène..........................................................................................................13
2. Les mutations génétiques...................................................................................14
2.1 Les mutations chromosomiques...................................................................15
2.2 Les mutations ponctuelles............................................................................16
3. Le gène EGFR.......................................................................................................18
4. Dossier de validation..........................................................................................20
4.1 La précision...................................................................................................20
4.2 L'exactitude...................................................................................................21
4.3 La limite de détection...................................................................................21
4.4 La sensibilité..................................................................................................21
4.5 La spécificité..................................................................................................21
4.6 L a robustesse...............................................................................................21
5. Extraction d'ARN.................................................................................................21
6. La PCR..................................................................................................................22
7. La RT-PCR.............................................................................................................24
8. PCR en temps réel ou Réal time PCR..................................................................25
8.1 SYBR Green...................................................................................................25
8.2 La sonde Taqman..........................................................................................27
9. Le séquençage.....................................................................................................28
9.1 Séquençage Sanger.......................................................................................28
9.2 Séquençage automatique.............................................................................29
Partie pratique.........................................................................................................30
1. Préparation des lames........................................................................................30
1.1 Principe.........................................................................................................30
1.2 Découpe des blocs en paraffine et étalement sur des lames.......................30
1.2.1 Matériels et réactifs.................................................................................30
1.2.2 Mode opératoire.....................................................................................30
2. Extraction d'ARN à partir de FFPE......................................................................32
2.1 Kit QIAGEN : miRNeasy FFPE.........................................................................32
2.1.1 Matériels et réactifs.................................................................................32
2.1.2 Mode opératoire.....................................................................................32
2.2 Kit Life technologies : RecoverAll Total nucleic acid isolation.......................34
2.1.1 Matériels et réactifs.................................................................................34
2.1.2 Mode opératoire.....................................................................................34
3. Dosage fluorimétrique d'ARN sur le lecteur Qubit 2.0......................................38
3.1 Matériels et réactifs......................................................................................38
3.2 Mode opératoire...........................................................................................39
4. La transcription inverse......................................................................................40
4.1 RT-PCR M-MLV..............................................................................................40
4.1.1 Matériels et réactifs.................................................................................40
4.1.2 Mode opératoire.....................................................................................40
4.2 Super Script Vilo............................................................................................41
4.2.1 Matériels et réactifs.................................................................................41
4.2.2 Mode opératoire.....................................................................................42
5. PCR......................................................................................................................43
5.1 Matériels et réactifs......................................................................................43
5.2 Mode opératoire...........................................................................................43
6. qPCR sur LightCycler 480....................................................................................45
6.1 Matériels et réactifs......................................................................................45
6.2 Mode opératoire...........................................................................................45
7. Electrophorèse sur gel d'agarose.......................................................................46
7.1 Matériels et réactifs......................................................................................46
7.2 Mode opératoire...........................................................................................47
8. Séquençage.........................................................................................................48
8.1 Les étapes du séquençage............................................................................48
8.1.1 Purification du produit PCR par chimie AMPure.....................................48
8.1.2 Séquençage..............................................................................................48
8.1.3 Purification des séquences par chimie CleanSEQ....................................48
8.1.4 Injection sur séquenceur ABi Prism 3730................................................49
Résultats et interprétations.................................................................................50
1. Comparaison de kits d'extraction et de RT-PCR.................................................50
1.1 Kit d'extraction : miRNeasy FFPE kit Vs RecoverAll Total nucleic Acid isolation..........................................................................................................................50
1.2 RT-PCR Super Script Vilo Vs RT-PCR M-MLV.................................................52
1.2.1 Résultats RT-M-MLV................................................................................53
1.2.2 Résultats RT Vilo......................................................................................53
1.3 Validation.....................................................................................................55
1.3.1 Précision : répétabilité et reproductibilité de l'extraction d'ARN............55
1.3.2 Précision : reproductibilité de la RT-PCR.................................................56
1.3.3 Répétabilité.............................................................................................57
2. EGFRvIII...............................................................................................................58
2.1 Mise au point de la PCR................................................................................59
2.1.1 Choix des primers....................................................................................59
2.1.2 Mise au point de la qPCR.........................................................................60
2.1.2.1 Concentration en primers..................................................................60
2.1.2.2 Choix de température........................................................................61
2.1.2.3 qPCR à 56°C .......................................................................................61
2.1.2.4 Test de nouveau primers inférieur à 100 pb......................................62
2.1.3 Courbes d'étalonnage pour analyse "EGFRvIII".......................................62
2.1.4 Limite de détection en fonction de la quantité en ARN dans la RT.........64
2.1.5 Test sur des échantillons cliniques..........................................................65
2.1.6 PCR multiplex...........................................................................................66
2.1.7 Confirmation des cas cliniques positifs par séquençage.........................67
2.1.8 Autres cas cliniques.................................................................................69
Conclusion.................................................................................................................70
Liste des figures.......................................................................................................71
Bibliographie............................................................................................................73
Annexe
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65421 Mise au point de la détection du mutant EGFRvIII par PCR quantitative (RT- qPCR) [TFE / Mémoire] / Rabi ADAMOU YAROU, Auteur ; Pascal Vannuffel, Directeur de la recherche . - 2015.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale IPG Gosselies Cancer : dépistage Acides nucléiques : concept Mutations génétiques // cancer Gène EGFR Réaction de polymération en chaine PCR RT-PCR ARN : extraction, dosage Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Résumé
Le cancer est en augmentation dans le monde. Etant en partie provoqué par des mutations génétiques, il est important d'analyser ces mutations afin de garantir un bon suivi et un meilleur traitement des patients. La biologie moléculaire joue un rôle primordial dans la recherche de mutations et de marqueurs moléculaires pour assurer le suivi thérapeutique des malades.
Nos expériences ont pour but de détecter la mutation EGFRvIII due à une délétion de l'exon2 à l'exon7 suivi d'un réarrangement entre l'exon 1 et 8 pouvant entre autres provoquer une tumeur dans le cerveau. Avant d'arriver à notre objectif, nous avons d'abord, testé différents kits d'extraction d'ARN à partir de tissus fixés et de RT-PCR. Suite à une comparaison de nos résultats, nous avons choisi la technique la plus sensible et plus robuste. Pour confirmer notre choix, nous avons dressé un dossier de validation au moyen de tests supplémentaires tels que la répétabilité et la reproductibilité. Suite à ces analyses, nous avons pu intégrer ces techniques dans notre recherche du variant EGFRvIII.
Après l'extraction d'ARN à partir des échantillons fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), nous avons réalisé une reverse transcription RT-PCR. L'ADNc obtenu est amplifié par PCR quantitative grâce à un Light Cycler 480. Une mise au point a été effectuée afin de choisir les amorces spécifiques, le programme de qRT-PCR et la concentration d'ARN minimale nécessaire. A ce stade, l'analyse finale "EGFRvIII" permettait uniquement un résultat qualitatif. Des courbes d'étalonnage à partir de nombre de copies connues de fragments d'ADN ont été réalisées afin d'obtenir un résultat quantitatif.
La détection du variant EGFRvIII s'est effectuée sur des échantillons cliniques. Les résultats obtenus ont montré que six patients sur vint et un testés sont porteurs de la mutation EGFRvIII . Ce résultat a été confirmé par séquençage. Toutes les séquences positives étaient identiques et portaient une délétion de l'exon2 à l'exon7.
Nos résultats étant satisfaisant, cette analyse peut être utilisée en routine au laboratoire de l'IPG.
Grâce à l'émergence des techniques et des recherches en biologie moléculaire, il est possible de développer des tests spécifiques et de plus en plus sensibles afin d'assurer le diagnostic et le suivi de patients atteint de cancer. En parallèle à ce développement, la recherche se spécialise dans la mise au point de thérapies ciblées spécifiques à certaines mutations.
Note de contenu : Table de matière
Remerciements
Introduction ..............................................................................................................9
Partie théorique......................................................................................................10
1. Les acides nucléiques .........................................................................................10
1.1 Définition......................................................................................................10
1.2 Structure.......................................................................................................10
1.3 ADN...............................................................................................................11
1.4 ARN...............................................................................................................12
1.5 Le gène..........................................................................................................13
2. Les mutations génétiques...................................................................................14
2.1 Les mutations chromosomiques...................................................................15
2.2 Les mutations ponctuelles............................................................................16
3. Le gène EGFR.......................................................................................................18
4. Dossier de validation..........................................................................................20
4.1 La précision...................................................................................................20
4.2 L'exactitude...................................................................................................21
4.3 La limite de détection...................................................................................21
4.4 La sensibilité..................................................................................................21
4.5 La spécificité..................................................................................................21
4.6 L a robustesse...............................................................................................21
5. Extraction d'ARN.................................................................................................21
6. La PCR..................................................................................................................22
7. La RT-PCR.............................................................................................................24
8. PCR en temps réel ou Réal time PCR..................................................................25
8.1 SYBR Green...................................................................................................25
8.2 La sonde Taqman..........................................................................................27
9. Le séquençage.....................................................................................................28
9.1 Séquençage Sanger.......................................................................................28
9.2 Séquençage automatique.............................................................................29
Partie pratique.........................................................................................................30
1. Préparation des lames........................................................................................30
1.1 Principe.........................................................................................................30
1.2 Découpe des blocs en paraffine et étalement sur des lames.......................30
1.2.1 Matériels et réactifs.................................................................................30
1.2.2 Mode opératoire.....................................................................................30
2. Extraction d'ARN à partir de FFPE......................................................................32
2.1 Kit QIAGEN : miRNeasy FFPE.........................................................................32
2.1.1 Matériels et réactifs.................................................................................32
2.1.2 Mode opératoire.....................................................................................32
2.2 Kit Life technologies : RecoverAll Total nucleic acid isolation.......................34
2.1.1 Matériels et réactifs.................................................................................34
2.1.2 Mode opératoire.....................................................................................34
3. Dosage fluorimétrique d'ARN sur le lecteur Qubit 2.0......................................38
3.1 Matériels et réactifs......................................................................................38
3.2 Mode opératoire...........................................................................................39
4. La transcription inverse......................................................................................40
4.1 RT-PCR M-MLV..............................................................................................40
4.1.1 Matériels et réactifs.................................................................................40
4.1.2 Mode opératoire.....................................................................................40
4.2 Super Script Vilo............................................................................................41
4.2.1 Matériels et réactifs.................................................................................41
4.2.2 Mode opératoire.....................................................................................42
5. PCR......................................................................................................................43
5.1 Matériels et réactifs......................................................................................43
5.2 Mode opératoire...........................................................................................43
6. qPCR sur LightCycler 480....................................................................................45
6.1 Matériels et réactifs......................................................................................45
6.2 Mode opératoire...........................................................................................45
7. Electrophorèse sur gel d'agarose.......................................................................46
7.1 Matériels et réactifs......................................................................................46
7.2 Mode opératoire...........................................................................................47
8. Séquençage.........................................................................................................48
8.1 Les étapes du séquençage............................................................................48
8.1.1 Purification du produit PCR par chimie AMPure.....................................48
8.1.2 Séquençage..............................................................................................48
8.1.3 Purification des séquences par chimie CleanSEQ....................................48
8.1.4 Injection sur séquenceur ABi Prism 3730................................................49
Résultats et interprétations.................................................................................50
1. Comparaison de kits d'extraction et de RT-PCR.................................................50
1.1 Kit d'extraction : miRNeasy FFPE kit Vs RecoverAll Total nucleic Acid isolation..........................................................................................................................50
1.2 RT-PCR Super Script Vilo Vs RT-PCR M-MLV.................................................52
1.2.1 Résultats RT-M-MLV................................................................................53
1.2.2 Résultats RT Vilo......................................................................................53
1.3 Validation.....................................................................................................55
1.3.1 Précision : répétabilité et reproductibilité de l'extraction d'ARN............55
1.3.2 Précision : reproductibilité de la RT-PCR.................................................56
1.3.3 Répétabilité.............................................................................................57
2. EGFRvIII...............................................................................................................58
2.1 Mise au point de la PCR................................................................................59
2.1.1 Choix des primers....................................................................................59
2.1.2 Mise au point de la qPCR.........................................................................60
2.1.2.1 Concentration en primers..................................................................60
2.1.2.2 Choix de température........................................................................61
2.1.2.3 qPCR à 56°C .......................................................................................61
2.1.2.4 Test de nouveau primers inférieur à 100 pb......................................62
2.1.3 Courbes d'étalonnage pour analyse "EGFRvIII".......................................62
2.1.4 Limite de détection en fonction de la quantité en ARN dans la RT.........64
2.1.5 Test sur des échantillons cliniques..........................................................65
2.1.6 PCR multiplex...........................................................................................66
2.1.7 Confirmation des cas cliniques positifs par séquençage.........................67
2.1.8 Autres cas cliniques.................................................................................69
Conclusion.................................................................................................................70
Liste des figures.......................................................................................................71
Bibliographie............................................................................................................73
Annexe
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