Centre de Documentation Campus Montignies
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Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Auteur SÉBASTIEN ROSAR |
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Étude de la spécificité de la Transportine chez Drosophila melanogaster / SÉBASTIEN ROSAR
Titre : Étude de la spécificité de la Transportine chez Drosophila melanogaster Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : SÉBASTIEN ROSAR, Auteur Année de publication : 2015 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale transportine IBMM Gosselies Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le processus d’expression génique est compartimenté dans les cellules eucaryotes : la transcription des gènes a lieu dans le noyau tandis que leur traduction se déroule dans le cytoplasme. Étant donné la compartimentation du génome dans un noyau, les cellules eucaryotes ont développé des mécanismes permettant à une grande variété de biomolécules de traverser la membrane nucléaire.
Les β-karyophérines constituent une classe de protéines impliquée dans le transport actif de protéines cargos entre le noyau et le cytoplasme. Selon qu’elles importent ou exportent les protéines cargos du noyau, les β-karyophérines sont appelées importines ou exportines.
La Transportine-1 chez les mammifères constitue un exemple d’importine dont le mécanisme d’import a été bien étudié. En effet, l’équipe de Lee et al. a identifié sur les cargos de la Transportine-1 des résidus critiques qui permettent leur interaction avec cette β-karyophérine. Cette identification a mené à l’établissement de règles pour prédire l’import de protéines par la Transportine-1. Ces règles définissent le consensus PY-NLS.
L’objectif de mon Travail de Fin d’Étude était de contribuer à l’étude de l’import par la Transportine chez un organisme modèle : Drosophila melanogaster. Pour cela, seize cargos candidats ont été sélectionnés, notamment sur base de la présence d’un consensus PY-NLS, afin de déterminer s’ils étaient ou non des cargos de la Transportine de drosophile.
La microscopie à fluorescence a permis d’évaluer la localisation subcellulaire des seize cargos candidats, y compris de trois candidats (ZC3H12, ZC3H15 et NUPL2) dont la localisation était non décrite à ce jour dans la littérature.
L’activité de la Transportine de drosophile a ensuite été inhibée par le peptide inhibiteur M9M qui a une très grande affinité pour cette β-karyophérine. La localisation subcellulaire de quatre cargos candidats était plus cytoplasmique dans les cellules traitées par M9M par rapport aux cellules n’ayant pas subi ce traitement. Il s’agit des cargos candidats Lark, HRB87F, ROA1 et How.
Une seconde stratégie a été de diminuer l’expression de la Transportine de drosophile par interférence ARN. La localisation subcellulaire des quatre cargos candidats précédemment cités a de nouveau été observée dans cette nouvelle condition. Ces cargos ont montré un changement de localisation cellulaire comparable à celui observé après traitement des cellules par M9M.
En conclusion, il est très probable que Lark, HRB87F, ROA1 et How soient des cargos de la Transportine. Ces cargos candidats s’ajoutent à une liste de cinq cargos déjà connu de la Transportine de drosophile : Squid, Rb97D, PABP2, Cubitus interruptus et Cabeza.
La présence d’un PY-NLS ne semble pas être un indicateur prédictif suffisant pour déterminer si oui ou non un cargo candidat est importé par La Transportine de drosophile. En effet, cette dernière est capable de prendre en charge des cargos qui ne répondent que partiellement à ce consensus. En revanche, la majorité des cargos sont des homologues de cargos de la Transportine de mammifère, ce qui indique une bonne conservation entre la Transportine de drosophile et de mammifère.
De nouveaux cargos candidats restent encore à être éprouvés afin d’étudier plus en profondeur l’influence de certaines caractéristiques sur l’import par la Transportine de drosophile.
À terme, le projet de recherche vise à rassembler assez d’éléments pour prédire de manière fiable si un cargo est importé ou non par la Transportine de drosophile.Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
Présentation de l’institution de stage ............................................................................... 1
Contexte général ............................................................................................................... 2
Introduction ................................................................................................................... 2
Superfamille des β-karyophérines ................................................................................. 3
Transport nucléo-cytoplasmique des protéines ......................................................... 3
Caractéristiques générales des β-karyophérines ........................................................ 3
Distinction des β-karyophérines en importines et exportines .................................... 5
Description des Transportines humaines (hTRN1 et hTRN2) ......................................... 7
Introduction................................................................................................................ 7
Les cargos de la Transportine 1 .................................................................................. 7
Structure tridimensionnelle de la Transportine ....................................................... 10
La famille des Transportines ..................................................................................... 11
Comparaison de la Transportine de Drosophila melanogaster (dTRN) avec la Transportine humaine (hTRN) ...................................................................................... 12
Introduction.............................................................................................................. 12
Expériences de similarité de spécificité de transport de cargos par la Transportine de Drosophila melanogaster..................................................................................... 14
Bilan sur les connaissances actuelles de l’import médié par la Transportine de drosophile................................................................................................................. 15
Objectifs et stratégies ..................................................................................................... 16
Matériel et méthodes ...................................................................................................... 18
Introduction ................................................................................................................. 18
Culture cellulaire .......................................................................................................... 18
Western blot ................................................................................................................ 18
Page | ii
Transfection de plasmides inductibles au cuivre ......................................................... 19
Fixation des lamelles couvre-objet et installation sur lame pour la microscopie à fluorescence ................................................................................................................. 20
Microscopie à fluorescence ......................................................................................... 21
Préparation d’ARN double brin (dsRNA) ...................................................................... 23
Traitement des cellules S2 au dsRNA ........................................................................... 24
Extraction d’ARN des cellules S2 .................................................................................. 24
Production d’ADN complémentaire (cDNA) à partir d’ARN par rétrotranscription...... 25
PCR quantitative en temps réel (RT-QPCR) .................................................................. 26
Résultats et discussion .................................................................................................... 29
Sélection de cargos candidats ...................................................................................... 29
Construction de plasmides ........................................................................................... 30
Vérification de l’expression des fusions cherry-cargo ................................................. 31
Effet de l’inhibition de la Transportine par expression du peptide M9M sur la localisation des cargos candidats ................................................................................. 34
Effet de l’inhibition de l’expression de la Transportine par interférence ARN sur la localisation des cargos candidats ................................................................................. 43
Principe de l’interférence ARN ................................................................................. 43
Mise en oeuvre de l’interférence ARN dans les cellules S2 de Drosophile ................ 45
Vérification de l’inhibition de l’expression des gènes-cibles par PCR quantitative en temps réel ................................................................................................................ 47
Effet sur la localisation des cargos candidats ........................................................... 51
Conclusion et perspectives .............................................................................................. 57
Liste des abréviations ...................................................................................................... 59
Bibliographie ................................................................................................................... 61
Annexes ........................................................................................................................... 64Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64240 Étude de la spécificité de la Transportine chez Drosophila melanogaster [TFE / Mémoire] / SÉBASTIEN ROSAR, Auteur . - 2015.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale transportine IBMM Gosselies Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le processus d’expression génique est compartimenté dans les cellules eucaryotes : la transcription des gènes a lieu dans le noyau tandis que leur traduction se déroule dans le cytoplasme. Étant donné la compartimentation du génome dans un noyau, les cellules eucaryotes ont développé des mécanismes permettant à une grande variété de biomolécules de traverser la membrane nucléaire.
Les β-karyophérines constituent une classe de protéines impliquée dans le transport actif de protéines cargos entre le noyau et le cytoplasme. Selon qu’elles importent ou exportent les protéines cargos du noyau, les β-karyophérines sont appelées importines ou exportines.
La Transportine-1 chez les mammifères constitue un exemple d’importine dont le mécanisme d’import a été bien étudié. En effet, l’équipe de Lee et al. a identifié sur les cargos de la Transportine-1 des résidus critiques qui permettent leur interaction avec cette β-karyophérine. Cette identification a mené à l’établissement de règles pour prédire l’import de protéines par la Transportine-1. Ces règles définissent le consensus PY-NLS.
L’objectif de mon Travail de Fin d’Étude était de contribuer à l’étude de l’import par la Transportine chez un organisme modèle : Drosophila melanogaster. Pour cela, seize cargos candidats ont été sélectionnés, notamment sur base de la présence d’un consensus PY-NLS, afin de déterminer s’ils étaient ou non des cargos de la Transportine de drosophile.
La microscopie à fluorescence a permis d’évaluer la localisation subcellulaire des seize cargos candidats, y compris de trois candidats (ZC3H12, ZC3H15 et NUPL2) dont la localisation était non décrite à ce jour dans la littérature.
L’activité de la Transportine de drosophile a ensuite été inhibée par le peptide inhibiteur M9M qui a une très grande affinité pour cette β-karyophérine. La localisation subcellulaire de quatre cargos candidats était plus cytoplasmique dans les cellules traitées par M9M par rapport aux cellules n’ayant pas subi ce traitement. Il s’agit des cargos candidats Lark, HRB87F, ROA1 et How.
Une seconde stratégie a été de diminuer l’expression de la Transportine de drosophile par interférence ARN. La localisation subcellulaire des quatre cargos candidats précédemment cités a de nouveau été observée dans cette nouvelle condition. Ces cargos ont montré un changement de localisation cellulaire comparable à celui observé après traitement des cellules par M9M.
En conclusion, il est très probable que Lark, HRB87F, ROA1 et How soient des cargos de la Transportine. Ces cargos candidats s’ajoutent à une liste de cinq cargos déjà connu de la Transportine de drosophile : Squid, Rb97D, PABP2, Cubitus interruptus et Cabeza.
La présence d’un PY-NLS ne semble pas être un indicateur prédictif suffisant pour déterminer si oui ou non un cargo candidat est importé par La Transportine de drosophile. En effet, cette dernière est capable de prendre en charge des cargos qui ne répondent que partiellement à ce consensus. En revanche, la majorité des cargos sont des homologues de cargos de la Transportine de mammifère, ce qui indique une bonne conservation entre la Transportine de drosophile et de mammifère.
De nouveaux cargos candidats restent encore à être éprouvés afin d’étudier plus en profondeur l’influence de certaines caractéristiques sur l’import par la Transportine de drosophile.
À terme, le projet de recherche vise à rassembler assez d’éléments pour prédire de manière fiable si un cargo est importé ou non par la Transportine de drosophile.Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES
Présentation de l’institution de stage ............................................................................... 1
Contexte général ............................................................................................................... 2
Introduction ................................................................................................................... 2
Superfamille des β-karyophérines ................................................................................. 3
Transport nucléo-cytoplasmique des protéines ......................................................... 3
Caractéristiques générales des β-karyophérines ........................................................ 3
Distinction des β-karyophérines en importines et exportines .................................... 5
Description des Transportines humaines (hTRN1 et hTRN2) ......................................... 7
Introduction................................................................................................................ 7
Les cargos de la Transportine 1 .................................................................................. 7
Structure tridimensionnelle de la Transportine ....................................................... 10
La famille des Transportines ..................................................................................... 11
Comparaison de la Transportine de Drosophila melanogaster (dTRN) avec la Transportine humaine (hTRN) ...................................................................................... 12
Introduction.............................................................................................................. 12
Expériences de similarité de spécificité de transport de cargos par la Transportine de Drosophila melanogaster..................................................................................... 14
Bilan sur les connaissances actuelles de l’import médié par la Transportine de drosophile................................................................................................................. 15
Objectifs et stratégies ..................................................................................................... 16
Matériel et méthodes ...................................................................................................... 18
Introduction ................................................................................................................. 18
Culture cellulaire .......................................................................................................... 18
Western blot ................................................................................................................ 18
Page | ii
Transfection de plasmides inductibles au cuivre ......................................................... 19
Fixation des lamelles couvre-objet et installation sur lame pour la microscopie à fluorescence ................................................................................................................. 20
Microscopie à fluorescence ......................................................................................... 21
Préparation d’ARN double brin (dsRNA) ...................................................................... 23
Traitement des cellules S2 au dsRNA ........................................................................... 24
Extraction d’ARN des cellules S2 .................................................................................. 24
Production d’ADN complémentaire (cDNA) à partir d’ARN par rétrotranscription...... 25
PCR quantitative en temps réel (RT-QPCR) .................................................................. 26
Résultats et discussion .................................................................................................... 29
Sélection de cargos candidats ...................................................................................... 29
Construction de plasmides ........................................................................................... 30
Vérification de l’expression des fusions cherry-cargo ................................................. 31
Effet de l’inhibition de la Transportine par expression du peptide M9M sur la localisation des cargos candidats ................................................................................. 34
Effet de l’inhibition de l’expression de la Transportine par interférence ARN sur la localisation des cargos candidats ................................................................................. 43
Principe de l’interférence ARN ................................................................................. 43
Mise en oeuvre de l’interférence ARN dans les cellules S2 de Drosophile ................ 45
Vérification de l’inhibition de l’expression des gènes-cibles par PCR quantitative en temps réel ................................................................................................................ 47
Effet sur la localisation des cargos candidats ........................................................... 51
Conclusion et perspectives .............................................................................................. 57
Liste des abréviations ...................................................................................................... 59
Bibliographie ................................................................................................................... 61
Annexes ........................................................................................................................... 64Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64240 Exemplaires
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