Centre de Documentation Campus Montignies
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Lundi : 8h-18h30
Mardi : 8h-18h30
Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Auteur SANDY RIGOT |
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CONTRÔLE DE QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE D’UNE LIGNÉE CELLULAIRE VERO ET ÉVALUATION DE SA SENSIBILITÉ AU VIRUS DE L’ORF / SANDY RIGOT
Titre : CONTRÔLE DE QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE D’UNE LIGNÉE CELLULAIRE VERO ET ÉVALUATION DE SA SENSIBILITÉ AU VIRUS DE L’ORF Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : SANDY RIGOT, Auteur ; Rudiger Raue, Directeur de la recherche Année de publication : 2015 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Zoetis Virus de l'ORF Lignée cellulaire Vero Cultures cellulaires Virologie Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La culture cellulaire est à la base de nombreuses applications dans le domaine de la recherche et de l’industrie. Afin de pouvoir garantir l’exactitude des résultats expérimentaux ou la qualité d’une production, les lignées cellulaires utilisées doivent être certifiées exemptes de contamination.
Au cours de mon stage au sein du département de Recherche et Développement de la société pharmaceutique Zoetis, j’ai été amenée à amplifier des cellules Vero provenant de l’American Type Culture Collection (ATCC) afin d’en réaliser des banques de réserve et de travail, et à en réaliser le contrôle de qualité microbiologique suivant les recommandations de la Pharmacopée Européenne. Dans cette optique, la contamination par des mycoplasmes a été testée par PCR en temps réel, alors que la présence d’autres bactéries, de levures ou de champignons a été vérifiée par un test de stérilité. Au terme de l’expérience, les résultats obtenus ont montré l’absence de tout microorganisme précité.
La lignée cellulaire étant certifiée saine, nous avons voulu de plus vérifier la permissivité des cellules à deux souches de Parapoxvirus ovis, appelées D1701-B et D1701-V. La méthode de coloration immunohistochimique a montré des plages de lyse uniquement pour D1701-V. Ce résultat était attendu puisque D1701-V est une souche dérivée de D1701-B conçue spécifiquement pour proliférer dans les cellules Vero.
Enfin, dans le cadre des recherches effectuées au sein du laboratoire sur D1701-V (excellent candidat pour la création de vaccins recombinants), nous avons comparé l’efficacité de la propagation de la souche dans notre lignée d’intérêt avec deux autres lignées Vero (en provenance du Friedrich Loeffler Institute en Allemagne et du laboratoire de contrôle qualité de Zoetis). Après titrage de la souche pour les trois lignées et ce à des multiplicités d’infection de 0,5 et de 5, il s’est avéré que la lignée provenant de l’ATCC montrait une plus grande efficacité que les deux autres pour la multiplication virale.
En conclusion, nous avons obtenu une lignée cellulaire exempte de contamination et très efficace pour la prolifération de la souche D1701-V de Parapoxvirus ovis. Cette lignée pourra donc servir à la mise au point d’une méthode de titrage viral par culture cellulaire ainsi qu’à d’autres projets futurs au sein du département. De plus, elle pourra éventuellement remplacer l’utilisation des cellules Vero provenant du laboratoire QC pour la recherche sur D1701-V.Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage ...................................................................................................... 6
Introduction générale.................................................................................................................... 7
Partie théorique .............................................................................................................................. 8
1. La culture cellulaire ...............................................................................................................8
1.1. Définition .........................................................................................................................8
1.2. Types de cultures cellulaires ............................................................................................8
1.3. Applications .....................................................................................................................9
1.4. Historique de la lignée cellulaire Vero ............................................................................9
2. La contamination des cultures cellulaires ............................................................................10
2.1. Types de contamination .................................................................................................10
2.1.1. Contamination chimique ........................................................................................10
2.1.2. Contamination biologique ......................................................................................10
2.2. Techniques aseptiques ...................................................................................................11
2.3. Contamination par les mycoplasmes .............................................................................11
2.3.1. Caractéristiques ......................................................................................................11
2.3.2. Sources de mycoplasmes dans les cultures cellulaires ...........................................12
2.3.3. Effets de la contamination sur les cellules .............................................................12
2.3.4. Détection des mycoplasmes ...................................................................................13
2.3.4.1. Méthodes de détection et recommandations de la Pharmacopée Européenne .13
2.3.4.2. Principe de la PCR en temps réel .....................................................................14
2.3.5. Elimination des mycoplasmes ................................................................................17
2.4. Contamination par les bactéries, levures ou champignons ............................................18
2.4.1. Visualisation de la contamination ..........................................................................18
2.4.2. Détection de la contamination par le test de stérilité ..............................................18
2.4.3. Elimination de la contamination.............................................................................19
3. Virologie : utilisation de deux souches de Parapoxvirus ovis .............................................19
Partie pratique .............................................................................................................................. 21
1. Objectifs et stratégie.............................................................................................................21
2. Matériel et méthodes ............................................................................................................22
2.1. Création de la « Master Cell Bank » (MCB) et de la « Working Cell Bank » (WCB) .22
2.1.1. Matériel et réactifs ..................................................................................................22
2.1.2. Préparation des milieux ..........................................................................................23
2.1.2.1. Milieu de maintenance .....................................................................................23
2.1.2.2. Milieu de congélation .......................................................................................23
2.1.3. Décongélation des cellules .....................................................................................23
2.1.4. Comptage cellulaire ................................................................................................23
2.1.4.1. Principe .............................................................................................................23
2.1.4.2. Méthode ............................................................................................................24
2.1.5. Passage des cellules ................................................................................................25
2.1.5.1. Principe .............................................................................................................25
2.1.5.2. Méthode ............................................................................................................25
2.1.6. Congélation des cellules (cryopréservation) ..........................................................26
2.1.6.1. Principe .............................................................................................................26
2.1.6.2. Méthode ............................................................................................................26
2.2. Détection de la contamination par les bactéries, levures ou champignons ....................27
2.2.1. Test de stérilité .......................................................................................................27
2.2.1.1. Matériel et réactifs ............................................................................................27
2.2.1.2. Principe et méthode ..........................................................................................27
2.2.2. Test de promotion de la croissance ........................................................................28
2.2.2.1. Matériel et réactifs ............................................................................................28
2.2.2.2. Principe et méthode ..........................................................................................29
2.3. Détection de la contamination par les mycoplasmes .....................................................30
2.3.1. Extraction de l’ADN des mycoplasmes .................................................................30
2.3.1.1. Matériel et réactifs ............................................................................................30
2.3.1.2. Méthode ............................................................................................................31
2.3.2. PCR en temps réel ..................................................................................................32
2.3.2.1. Matériel et réactifs ............................................................................................32
2.3.2.2. Méthode ............................................................................................................33
2.4. Virologie ........................................................................................................................35
2.4.1. Matériel et réactifs ..................................................................................................35
2.4.2. Comparaison de l’infection des cellules Vero ATCC par les virus D1701-V et D1701-B ...............................................................................................................................35
2.4.2.1. Inoculation des 2 souches virales sur les cellules Vero ATCC ........................35
2.4.2.2. Coloration immunohistochimique des plages de lyse ......................................36
2.4.3. Comparaison de l’infectivité du D1701-V sur différentes lignées cellulaires Vero….. ................................................................................................................................37
2.4.3.1. Inoculation des différentes lignées cellulaires Vero .........................................37
2.4.3.2. Titrage du virus par le calcul du nombre de plages de lyse sur cellules Vero ATCC…. ..........................................................................................................................37
3. Résultats et discussion .........................................................................................................38
3.1. Création de la « Master Cell Bank » et de la « Working Cell Bank » ...........................38
3.2. Détection de la contamination par des bactéries, levures ou champignons ...................39
3.2.1. Vérification de la stérilité de l’environnement de travail durant le test de stérilité39
3.2.2. Inoculation des différents milieux de culture .........................................................39
3.2.3. Test de promotion de la croissance ........................................................................40
3.2.4. Test de stérilité .......................................................................................................41
3.3. Détection de la contamination par des mycoplasmes ....................................................43
3.4. Virologie ........................................................................................................................46
3.4.1. Comparaison de l’infection des cellules Vero ATCC par les souches du virus de l’orf D1701-B et D1701-V ...................................................................................................46
3.4.2. Comparaison de l’infectivité de la souche D1701-V sur différentes lignées cellulaires Vero ....................................................................................................................47
Conclusion générale et perspectives ....................................................................................... 50
Liste des abréviations ................................................................................................................. 51
Bibliographie ................................................................................................................................ 53Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65173 CONTRÔLE DE QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE D’UNE LIGNÉE CELLULAIRE VERO ET ÉVALUATION DE SA SENSIBILITÉ AU VIRUS DE L’ORF [TFE / Mémoire] / SANDY RIGOT, Auteur ; Rudiger Raue, Directeur de la recherche . - 2015.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Zoetis Virus de l'ORF Lignée cellulaire Vero Cultures cellulaires Virologie Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La culture cellulaire est à la base de nombreuses applications dans le domaine de la recherche et de l’industrie. Afin de pouvoir garantir l’exactitude des résultats expérimentaux ou la qualité d’une production, les lignées cellulaires utilisées doivent être certifiées exemptes de contamination.
Au cours de mon stage au sein du département de Recherche et Développement de la société pharmaceutique Zoetis, j’ai été amenée à amplifier des cellules Vero provenant de l’American Type Culture Collection (ATCC) afin d’en réaliser des banques de réserve et de travail, et à en réaliser le contrôle de qualité microbiologique suivant les recommandations de la Pharmacopée Européenne. Dans cette optique, la contamination par des mycoplasmes a été testée par PCR en temps réel, alors que la présence d’autres bactéries, de levures ou de champignons a été vérifiée par un test de stérilité. Au terme de l’expérience, les résultats obtenus ont montré l’absence de tout microorganisme précité.
La lignée cellulaire étant certifiée saine, nous avons voulu de plus vérifier la permissivité des cellules à deux souches de Parapoxvirus ovis, appelées D1701-B et D1701-V. La méthode de coloration immunohistochimique a montré des plages de lyse uniquement pour D1701-V. Ce résultat était attendu puisque D1701-V est une souche dérivée de D1701-B conçue spécifiquement pour proliférer dans les cellules Vero.
Enfin, dans le cadre des recherches effectuées au sein du laboratoire sur D1701-V (excellent candidat pour la création de vaccins recombinants), nous avons comparé l’efficacité de la propagation de la souche dans notre lignée d’intérêt avec deux autres lignées Vero (en provenance du Friedrich Loeffler Institute en Allemagne et du laboratoire de contrôle qualité de Zoetis). Après titrage de la souche pour les trois lignées et ce à des multiplicités d’infection de 0,5 et de 5, il s’est avéré que la lignée provenant de l’ATCC montrait une plus grande efficacité que les deux autres pour la multiplication virale.
En conclusion, nous avons obtenu une lignée cellulaire exempte de contamination et très efficace pour la prolifération de la souche D1701-V de Parapoxvirus ovis. Cette lignée pourra donc servir à la mise au point d’une méthode de titrage viral par culture cellulaire ainsi qu’à d’autres projets futurs au sein du département. De plus, elle pourra éventuellement remplacer l’utilisation des cellules Vero provenant du laboratoire QC pour la recherche sur D1701-V.Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage ...................................................................................................... 6
Introduction générale.................................................................................................................... 7
Partie théorique .............................................................................................................................. 8
1. La culture cellulaire ...............................................................................................................8
1.1. Définition .........................................................................................................................8
1.2. Types de cultures cellulaires ............................................................................................8
1.3. Applications .....................................................................................................................9
1.4. Historique de la lignée cellulaire Vero ............................................................................9
2. La contamination des cultures cellulaires ............................................................................10
2.1. Types de contamination .................................................................................................10
2.1.1. Contamination chimique ........................................................................................10
2.1.2. Contamination biologique ......................................................................................10
2.2. Techniques aseptiques ...................................................................................................11
2.3. Contamination par les mycoplasmes .............................................................................11
2.3.1. Caractéristiques ......................................................................................................11
2.3.2. Sources de mycoplasmes dans les cultures cellulaires ...........................................12
2.3.3. Effets de la contamination sur les cellules .............................................................12
2.3.4. Détection des mycoplasmes ...................................................................................13
2.3.4.1. Méthodes de détection et recommandations de la Pharmacopée Européenne .13
2.3.4.2. Principe de la PCR en temps réel .....................................................................14
2.3.5. Elimination des mycoplasmes ................................................................................17
2.4. Contamination par les bactéries, levures ou champignons ............................................18
2.4.1. Visualisation de la contamination ..........................................................................18
2.4.2. Détection de la contamination par le test de stérilité ..............................................18
2.4.3. Elimination de la contamination.............................................................................19
3. Virologie : utilisation de deux souches de Parapoxvirus ovis .............................................19
Partie pratique .............................................................................................................................. 21
1. Objectifs et stratégie.............................................................................................................21
2. Matériel et méthodes ............................................................................................................22
2.1. Création de la « Master Cell Bank » (MCB) et de la « Working Cell Bank » (WCB) .22
2.1.1. Matériel et réactifs ..................................................................................................22
2.1.2. Préparation des milieux ..........................................................................................23
2.1.2.1. Milieu de maintenance .....................................................................................23
2.1.2.2. Milieu de congélation .......................................................................................23
2.1.3. Décongélation des cellules .....................................................................................23
2.1.4. Comptage cellulaire ................................................................................................23
2.1.4.1. Principe .............................................................................................................23
2.1.4.2. Méthode ............................................................................................................24
2.1.5. Passage des cellules ................................................................................................25
2.1.5.1. Principe .............................................................................................................25
2.1.5.2. Méthode ............................................................................................................25
2.1.6. Congélation des cellules (cryopréservation) ..........................................................26
2.1.6.1. Principe .............................................................................................................26
2.1.6.2. Méthode ............................................................................................................26
2.2. Détection de la contamination par les bactéries, levures ou champignons ....................27
2.2.1. Test de stérilité .......................................................................................................27
2.2.1.1. Matériel et réactifs ............................................................................................27
2.2.1.2. Principe et méthode ..........................................................................................27
2.2.2. Test de promotion de la croissance ........................................................................28
2.2.2.1. Matériel et réactifs ............................................................................................28
2.2.2.2. Principe et méthode ..........................................................................................29
2.3. Détection de la contamination par les mycoplasmes .....................................................30
2.3.1. Extraction de l’ADN des mycoplasmes .................................................................30
2.3.1.1. Matériel et réactifs ............................................................................................30
2.3.1.2. Méthode ............................................................................................................31
2.3.2. PCR en temps réel ..................................................................................................32
2.3.2.1. Matériel et réactifs ............................................................................................32
2.3.2.2. Méthode ............................................................................................................33
2.4. Virologie ........................................................................................................................35
2.4.1. Matériel et réactifs ..................................................................................................35
2.4.2. Comparaison de l’infection des cellules Vero ATCC par les virus D1701-V et D1701-B ...............................................................................................................................35
2.4.2.1. Inoculation des 2 souches virales sur les cellules Vero ATCC ........................35
2.4.2.2. Coloration immunohistochimique des plages de lyse ......................................36
2.4.3. Comparaison de l’infectivité du D1701-V sur différentes lignées cellulaires Vero….. ................................................................................................................................37
2.4.3.1. Inoculation des différentes lignées cellulaires Vero .........................................37
2.4.3.2. Titrage du virus par le calcul du nombre de plages de lyse sur cellules Vero ATCC…. ..........................................................................................................................37
3. Résultats et discussion .........................................................................................................38
3.1. Création de la « Master Cell Bank » et de la « Working Cell Bank » ...........................38
3.2. Détection de la contamination par des bactéries, levures ou champignons ...................39
3.2.1. Vérification de la stérilité de l’environnement de travail durant le test de stérilité39
3.2.2. Inoculation des différents milieux de culture .........................................................39
3.2.3. Test de promotion de la croissance ........................................................................40
3.2.4. Test de stérilité .......................................................................................................41
3.3. Détection de la contamination par des mycoplasmes ....................................................43
3.4. Virologie ........................................................................................................................46
3.4.1. Comparaison de l’infection des cellules Vero ATCC par les souches du virus de l’orf D1701-B et D1701-V ...................................................................................................46
3.4.2. Comparaison de l’infectivité de la souche D1701-V sur différentes lignées cellulaires Vero ....................................................................................................................47
Conclusion générale et perspectives ....................................................................................... 50
Liste des abréviations ................................................................................................................. 51
Bibliographie ................................................................................................................................ 53Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65173 Exemplaires
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