Centre de Documentation Campus Montignies
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Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Auteur Yohan Kellner |
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Expression des protéines E2 et C recombinantes du virus BVDV dans un système de cellules de mammifères in vitro / Yohan Kellner
Titre : Expression des protéines E2 et C recombinantes du virus BVDV dans un système de cellules de mammifères in vitro Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Yohan Kellner, Auteur ; Bernard Couvreur, Directeur de la recherche Année de publication : 2015 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale ASBL CULTURE IN VIVO Nivelles Maladie : bovins BVDV Diarrhée bovine virales Virus Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Résumé
Le BVDV (Bovin Viral Diarrhea Virus) est responsable de la diarrhée bovine virale. Les virus BVDV comprend deux espèces qui sont le BVDV1 et le BVDV2. Ces deux espèces induisent la même pathologie. Le BVDV infecte les bovins via les fluides des bovins infectés ou par transmission transplacentaire. Les bovins adultes infectés n’ont généralement peu de symptômes mais certaines souches virulentes du BVDV2 induisent une thrombocytopénie. Les iPi (animal ayant développé une immunotolérance) possèdent une souche BVDV non cytopathogène qui mute en BVDV cytopathogène, ce qui induit la maladie des muqueuses mortelle pour le veau.
Diverses mesures préventives ont été développées : isolement des bovins infectés, abattage, vaccination des bovins. Les vaccins à ADN montrent leur efficacité par la synthèse des protéines E2 du virus. Cette protéine est immunogène mais les deux espèces du virus BVDV synthétisent une E2 différente. Dans son génome, le virus BVDV contient la protéine de nucléocapside C qui est peu immunogène et ne varie pas selon les souches.
Au début, l’objectif était de construire un plasmide pCDNA3 recombinant gD-E2.1-E2.2, gD-E2.2-E2.1, C-E2, gD-E2.2t et gD2.1t. Les constructions génétiques de départ étaient gD-E2.1, gD-E2.2; la détection de la protéine E2 par les réactifs sérologiques disponibles au laboratoire ne peut pas se faire car ces réactifs ont une réactivité trop faible pour être utilisés. D’autres constructions ont été choisies : E2.1-gfp, E2.2-gfp, C-gfp et gD-gfp. Ces plasmides ont été choisis pour la synthèse d’une protéine fusion E2.1-GFP, E2.2-GFP, gD-GFP et C-GFP car le MCS se situe en aval du gène de la gfp, ce qui permet à la cellule de synthétiser une protéine fusion. La protéine fusion E2-GFP permettra de mettre en évidence la localisation de la protéine E2. La protéine fusion C-GFP permettra de vérifier son excrétion et la création d’une pseudo-particule. La détection des protéines fusions se fera par microscopie à fluorescence. La conception de la stratégie de clonage se fait par simulation informatique. La stratégie de clonage se porte sur la production d’insert par PCR. La fabrication du vecteur se fait par double digestion de pEGFP-N1 par restriction enzymatique.
Un essai de clonage du gène E2.2 dans pEGFP-N1 a été réalisé. Malheureusement aucun plasmide recombinant n’a été retenu. Le projet devrait être poursuivi en améliorant les conditions de PCR et les conditions de clonages. Les gènes viraux E2 et C mais non gD peuvent être amplifiés par PCR.Note de contenu : Table des matières :
REMERCIEMENTS ________________________________________________ 4
ASBL « CULTURE IN VIVO » _____________________________________ 5
INTRODUCTION : _________________________________________________ 6
1. PARTIE THÉORIQUE _________________________________________ 8
1.1. Flaviviridae _____________________________________________________ 8
1.2. Virus BVDV ____________________________________________________ 10
a. La pathologie du virus BVDV ______________________________________ 10
b. Génome viral __________________________________________________ 12
c. Cycle du virus __________________________________________________ 13
d. Traduction du génome viral _______________________________________ 14
1.3. Diagnostic du virus BVDV ________________________________________ 16
1.4. Prise en charge des cas positifs ____________________________________ 17
1.5. Prévention du virus BVDV ________________________________________ 17
1.6. Présentation des plasmides utilisés ________________________________ 19
2. PARTIE PRATIQUE _________________________________________ 20
2.1. Objectif et stratégie _____________________________________________ 20
2.2. Réactifs particuliers _____________________________________________ 21
2.3. Matériels et méthodes __________________________________________ 22
a. Culture cellulaire________________________________________________ 22
i) Passage de cellule. ____________________________________________ 22
ii) Transfection _________________________________________________ 23
iii) Mode opératoire _____________________________________________ 25
b. Microscopie fluorescente _________________________________________ 25
c. Programmes de bioinformatique ___________________________________ 26
d. Biologie moléculaire _____________________________________________ 27
i) PCR (polymerase chain reaction) _________________________________ 27
ii) Électrophorèse sur gel d’agarose _________________________________ 31
iii) Préparation des produits PCR à insérer dans le vecteur. _______________ 31
iv) Préparation du plasmide vecteur pEGFP-N1 ________________________ 32
v) Ligation _____________________________________________________ 32
vi) Transformation bactérienne. ____________________________________ 33
vii) Miniprep ____________________________________________________ 33
2.4. Résultats expérimentaux _________________________________________ 34
a. Vérification des plasmides contenant les différents gènes E2 et le plasmide pEGFP-N1. _________________________________________________________ 34
i) Plasmide pEGFP-N1 : __________________________________________ 34
ii) Tests sérologiques ____________________________________________ 36
b. Clonage des gènes viraux _________________________________________ 40
i) Conception des amorces PCR ____________________________________ 41
ii) PCR des gènes E2, C et gD ______________________________________ 42
iii) Préparation du plasmide vecteur pEGFP-N1 par HindIII et BamHI _______ 45
iv) Préparation du plasmide vecteur _________________________________ 46
v) Transformation des bactéries TG1 avec le produit de ligation __________ 48Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65488 Expression des protéines E2 et C recombinantes du virus BVDV dans un système de cellules de mammifères in vitro [TFE / Mémoire] / Yohan Kellner, Auteur ; Bernard Couvreur, Directeur de la recherche . - 2015.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale ASBL CULTURE IN VIVO Nivelles Maladie : bovins BVDV Diarrhée bovine virales Virus Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Résumé
Le BVDV (Bovin Viral Diarrhea Virus) est responsable de la diarrhée bovine virale. Les virus BVDV comprend deux espèces qui sont le BVDV1 et le BVDV2. Ces deux espèces induisent la même pathologie. Le BVDV infecte les bovins via les fluides des bovins infectés ou par transmission transplacentaire. Les bovins adultes infectés n’ont généralement peu de symptômes mais certaines souches virulentes du BVDV2 induisent une thrombocytopénie. Les iPi (animal ayant développé une immunotolérance) possèdent une souche BVDV non cytopathogène qui mute en BVDV cytopathogène, ce qui induit la maladie des muqueuses mortelle pour le veau.
Diverses mesures préventives ont été développées : isolement des bovins infectés, abattage, vaccination des bovins. Les vaccins à ADN montrent leur efficacité par la synthèse des protéines E2 du virus. Cette protéine est immunogène mais les deux espèces du virus BVDV synthétisent une E2 différente. Dans son génome, le virus BVDV contient la protéine de nucléocapside C qui est peu immunogène et ne varie pas selon les souches.
Au début, l’objectif était de construire un plasmide pCDNA3 recombinant gD-E2.1-E2.2, gD-E2.2-E2.1, C-E2, gD-E2.2t et gD2.1t. Les constructions génétiques de départ étaient gD-E2.1, gD-E2.2; la détection de la protéine E2 par les réactifs sérologiques disponibles au laboratoire ne peut pas se faire car ces réactifs ont une réactivité trop faible pour être utilisés. D’autres constructions ont été choisies : E2.1-gfp, E2.2-gfp, C-gfp et gD-gfp. Ces plasmides ont été choisis pour la synthèse d’une protéine fusion E2.1-GFP, E2.2-GFP, gD-GFP et C-GFP car le MCS se situe en aval du gène de la gfp, ce qui permet à la cellule de synthétiser une protéine fusion. La protéine fusion E2-GFP permettra de mettre en évidence la localisation de la protéine E2. La protéine fusion C-GFP permettra de vérifier son excrétion et la création d’une pseudo-particule. La détection des protéines fusions se fera par microscopie à fluorescence. La conception de la stratégie de clonage se fait par simulation informatique. La stratégie de clonage se porte sur la production d’insert par PCR. La fabrication du vecteur se fait par double digestion de pEGFP-N1 par restriction enzymatique.
Un essai de clonage du gène E2.2 dans pEGFP-N1 a été réalisé. Malheureusement aucun plasmide recombinant n’a été retenu. Le projet devrait être poursuivi en améliorant les conditions de PCR et les conditions de clonages. Les gènes viraux E2 et C mais non gD peuvent être amplifiés par PCR.Note de contenu : Table des matières :
REMERCIEMENTS ________________________________________________ 4
ASBL « CULTURE IN VIVO » _____________________________________ 5
INTRODUCTION : _________________________________________________ 6
1. PARTIE THÉORIQUE _________________________________________ 8
1.1. Flaviviridae _____________________________________________________ 8
1.2. Virus BVDV ____________________________________________________ 10
a. La pathologie du virus BVDV ______________________________________ 10
b. Génome viral __________________________________________________ 12
c. Cycle du virus __________________________________________________ 13
d. Traduction du génome viral _______________________________________ 14
1.3. Diagnostic du virus BVDV ________________________________________ 16
1.4. Prise en charge des cas positifs ____________________________________ 17
1.5. Prévention du virus BVDV ________________________________________ 17
1.6. Présentation des plasmides utilisés ________________________________ 19
2. PARTIE PRATIQUE _________________________________________ 20
2.1. Objectif et stratégie _____________________________________________ 20
2.2. Réactifs particuliers _____________________________________________ 21
2.3. Matériels et méthodes __________________________________________ 22
a. Culture cellulaire________________________________________________ 22
i) Passage de cellule. ____________________________________________ 22
ii) Transfection _________________________________________________ 23
iii) Mode opératoire _____________________________________________ 25
b. Microscopie fluorescente _________________________________________ 25
c. Programmes de bioinformatique ___________________________________ 26
d. Biologie moléculaire _____________________________________________ 27
i) PCR (polymerase chain reaction) _________________________________ 27
ii) Électrophorèse sur gel d’agarose _________________________________ 31
iii) Préparation des produits PCR à insérer dans le vecteur. _______________ 31
iv) Préparation du plasmide vecteur pEGFP-N1 ________________________ 32
v) Ligation _____________________________________________________ 32
vi) Transformation bactérienne. ____________________________________ 33
vii) Miniprep ____________________________________________________ 33
2.4. Résultats expérimentaux _________________________________________ 34
a. Vérification des plasmides contenant les différents gènes E2 et le plasmide pEGFP-N1. _________________________________________________________ 34
i) Plasmide pEGFP-N1 : __________________________________________ 34
ii) Tests sérologiques ____________________________________________ 36
b. Clonage des gènes viraux _________________________________________ 40
i) Conception des amorces PCR ____________________________________ 41
ii) PCR des gènes E2, C et gD ______________________________________ 42
iii) Préparation du plasmide vecteur pEGFP-N1 par HindIII et BamHI _______ 45
iv) Préparation du plasmide vecteur _________________________________ 46
v) Transformation des bactéries TG1 avec le produit de ligation __________ 48Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65488 Exemplaires
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