Centre de Documentation Campus Montignies
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Vendredi : 8h-16h30
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Mise au point de la fluorimétrie différentielle à balayage sur l’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine en vue de réaliser un criblage d’inhibiteurs / DARLENE DE GROOTE
Titre : Mise au point de la fluorimétrie différentielle à balayage sur l’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine en vue de réaliser un criblage d’inhibiteurs Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : DARLENE DE GROOTE, Auteur Année de publication : 2015 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Université de Namur. laboratoire de Chimie Biologique et Structurale CBS Protéine Indoléamine 2,3-dioxygénase humaine // cancer Hido Fluorimétrie différentielle à balayage Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : L’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine (hIDO) est une enzyme impliquée dans le métabolisme du tryptophane. Elle constitue une cible thérapeutique intéressante car elle permet aux cellules cancéreuses de développer des mécanismes de résistance face au système immunitaire.
Dès lors, cette enzyme fait l’objet de nombreuses recherches à l’Université de Namur. Ce travail de fin d’études est ainsi composé de deux parties : la mise au point d’un protocole de production et purification d’hIDO possédant une étiquette de 6 histidines clivable en vue de sa cristallisation ainsi que la mise au point de la fluorimétrie différentielle à balayage sur cette enzyme, afin de mettre en évidence une interaction enzyme-inhibiteur.
D’une part, nous allons mettre au point le protocole de production et de purification d’hIDO possédant une étiquette de 6 histidines clivable. Des cellules d’Escherichia coli BL21 (DE3) transformées avec un plasmide codant pour hIDO permettent la production de l’enzyme. La purification est réalisée par FPLC (fast protein liquid chromatography) à l’aide d’une colonne d’affinité au nickel (IMAC ou immobilized metal affinity chromatography). Nous avons obtenu 2,2 mg de protéine purifiée pour une culture de 200 ml. Des tests d’activité enzymatique ont révélés que les lots d’enzyme purifiée étaient inactifs. Suite à cela, des modifications ont été apportées au niveau du protocole (modification de la concentration en IPTG, du temps et de la température d’induction, du protocole de lyse et changement de précurseur), mais celles-ci n’ont pas permis d’obtenir de l’enzyme active.
D’autre part, la sélection d’inhibiteurs d’hIDO par tests d’inhibition enzymatique ont permis la mise au point de la technique de fluorimétrie différentielle à balayage (DSF ou differential scanning fluorimetry). Nous avons choisi le 4-phénylthiazole-2-thiol (C33) ainsi que le 4-phénylimidazole (PIM). Cette technique est à priori rapide, universelle, bon marché et est basée sur l’utilisation de la fluorescence pour étudier l’effet d’un inhibiteur sur la stabilité de la protéine. La mise au point de cette méthode sur hIDO a permis de montrer une différence significative sur la stabilité de la protéine à l’aide du protocole « Protein Thermal Shift TM Dye Kit », appliqué sur des stocks d’enzyme actifs disponibles au laboratoire. De plus, celui-ci est reproductible et nécessite peu d’enzyme et de réactifs.Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Introduction ................................................................................................................................ 8
Contexte général ........................................................................................................................ 9
1. La fluorimétrie différentielle à balayage ........................................................................ 9
2. L’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine .................................................................... 11 Métabolisme du tryptophane ................................................................................ 11
Intérêt thérapeutique ............................................................................................ 13
Choix du modèle protéique ................................................................................... 14
Inhibiteurs .............................................................................................................. 15
Caractéristiques ..................................................................................................... 16
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 17
Matériel et méthodes .............................................................................................................. 19
1. Techniques de biologie moléculaire ............................................................................ 19 Matériel biologique ................................................................................................ 19
Plasmide pET-15b-hIDO .................................................................................. 19
Cellules d’Escherichia coli (DH10b et BL21) ................................................... 19
Transformation bactérienne .................................................................................. 20
2. Techniques d’étude de protéines ................................................................................ 20 Mise en culture et surexpression ........................................................................... 20
Pré-culture ...................................................................................................... 20
Culture ............................................................................................................ 20
Induction ......................................................................................................... 21
Lyse bactérienne ............................................................................................. 21
Lyse par sonication .................................................................................... 22
Lyse à la presse de French ......................................................................... 22
Protocole ................................................................................................... 22
Purification ............................................................................................................. 22
Principe de la séparation ................................................................................ 23
Protocole......................................................................................................... 24
Electrophorèse SDS-page ....................................................................................... 25
Principe ........................................................................................................... 25
Protocole......................................................................................................... 26
Dialyse .................................................................................................................... 26
Principe ........................................................................................................... 27
Protocole......................................................................................................... 27
Détermination de la concentration protéique ...................................................... 28
Principe ........................................................................................................... 28
Protocole......................................................................................................... 28
Tests enzymatiques ................................................................................................ 29
Principe ........................................................................................................... 29
Protocole......................................................................................................... 29
3. Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) ................................................................ 30 Principe .................................................................................................................. 30
Protocole ................................................................................................................ 31
Résultats et discussion ............................................................................................................. 32
1. Partie 1 : production et purification enzymatique ....................................................... 32 Culture cellulaire .................................................................................................... 32
Induction à l’IPTG ................................................................................................... 32
Lyse cellulaire ......................................................................................................... 33
Purification ............................................................................................................. 35
Caractérisation ....................................................................................................... 37
Quantification ................................................................................................. 37
Détermination de l’activité .................................................................................... 38
Test d’activité enzymatique............................................................................ 38
Rapport de l’absorbance 400/280 nm ............................................................ 40
Optimisation de la production et purification ....................................................... 41
Conclusion de la partie 1 ........................................................................................ 42
2. Partie 2 : mise au point de la DSF ................................................................................. 44 Tests d’inhibition enzymatique .............................................................................. 44
Spectres UV-visible des composés ......................................................................... 45
Protocoles utilisés .................................................................................................. 47
Premier Protocole inspiré de la littérature .................................................... 47
Protocole ................................................................................................... 47
Résultats et discussion .............................................................................. 48
Second protocole inspiré d’un kit ................................................................... 50
Protocole ................................................................................................... 50
Résultats et discussion .............................................................................. 50
Influence de la concentration en inhibiteur .............................................. 51
Comparaison des deux méthodes .................................................................. 53
Conclusion de la partie 2 ........................................................................................ 54
Conclusion et perspectives ....................................................................................................... 55
Table des abréviations.............................................................................................................. 56
Références bibliographiques .................................................................................................... 58
Table des annexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64032 Mise au point de la fluorimétrie différentielle à balayage sur l’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine en vue de réaliser un criblage d’inhibiteurs [TFE / Mémoire] / DARLENE DE GROOTE, Auteur . - 2015.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Université de Namur. laboratoire de Chimie Biologique et Structurale CBS Protéine Indoléamine 2,3-dioxygénase humaine // cancer Hido Fluorimétrie différentielle à balayage Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : L’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine (hIDO) est une enzyme impliquée dans le métabolisme du tryptophane. Elle constitue une cible thérapeutique intéressante car elle permet aux cellules cancéreuses de développer des mécanismes de résistance face au système immunitaire.
Dès lors, cette enzyme fait l’objet de nombreuses recherches à l’Université de Namur. Ce travail de fin d’études est ainsi composé de deux parties : la mise au point d’un protocole de production et purification d’hIDO possédant une étiquette de 6 histidines clivable en vue de sa cristallisation ainsi que la mise au point de la fluorimétrie différentielle à balayage sur cette enzyme, afin de mettre en évidence une interaction enzyme-inhibiteur.
D’une part, nous allons mettre au point le protocole de production et de purification d’hIDO possédant une étiquette de 6 histidines clivable. Des cellules d’Escherichia coli BL21 (DE3) transformées avec un plasmide codant pour hIDO permettent la production de l’enzyme. La purification est réalisée par FPLC (fast protein liquid chromatography) à l’aide d’une colonne d’affinité au nickel (IMAC ou immobilized metal affinity chromatography). Nous avons obtenu 2,2 mg de protéine purifiée pour une culture de 200 ml. Des tests d’activité enzymatique ont révélés que les lots d’enzyme purifiée étaient inactifs. Suite à cela, des modifications ont été apportées au niveau du protocole (modification de la concentration en IPTG, du temps et de la température d’induction, du protocole de lyse et changement de précurseur), mais celles-ci n’ont pas permis d’obtenir de l’enzyme active.
D’autre part, la sélection d’inhibiteurs d’hIDO par tests d’inhibition enzymatique ont permis la mise au point de la technique de fluorimétrie différentielle à balayage (DSF ou differential scanning fluorimetry). Nous avons choisi le 4-phénylthiazole-2-thiol (C33) ainsi que le 4-phénylimidazole (PIM). Cette technique est à priori rapide, universelle, bon marché et est basée sur l’utilisation de la fluorescence pour étudier l’effet d’un inhibiteur sur la stabilité de la protéine. La mise au point de cette méthode sur hIDO a permis de montrer une différence significative sur la stabilité de la protéine à l’aide du protocole « Protein Thermal Shift TM Dye Kit », appliqué sur des stocks d’enzyme actifs disponibles au laboratoire. De plus, celui-ci est reproductible et nécessite peu d’enzyme et de réactifs.Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Introduction ................................................................................................................................ 8
Contexte général ........................................................................................................................ 9
1. La fluorimétrie différentielle à balayage ........................................................................ 9
2. L’indoléamine 2,3-dioxygénase humaine .................................................................... 11 Métabolisme du tryptophane ................................................................................ 11
Intérêt thérapeutique ............................................................................................ 13
Choix du modèle protéique ................................................................................... 14
Inhibiteurs .............................................................................................................. 15
Caractéristiques ..................................................................................................... 16
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 17
Matériel et méthodes .............................................................................................................. 19
1. Techniques de biologie moléculaire ............................................................................ 19 Matériel biologique ................................................................................................ 19
Plasmide pET-15b-hIDO .................................................................................. 19
Cellules d’Escherichia coli (DH10b et BL21) ................................................... 19
Transformation bactérienne .................................................................................. 20
2. Techniques d’étude de protéines ................................................................................ 20 Mise en culture et surexpression ........................................................................... 20
Pré-culture ...................................................................................................... 20
Culture ............................................................................................................ 20
Induction ......................................................................................................... 21
Lyse bactérienne ............................................................................................. 21
Lyse par sonication .................................................................................... 22
Lyse à la presse de French ......................................................................... 22
Protocole ................................................................................................... 22
Purification ............................................................................................................. 22
Principe de la séparation ................................................................................ 23
Protocole......................................................................................................... 24
Electrophorèse SDS-page ....................................................................................... 25
Principe ........................................................................................................... 25
Protocole......................................................................................................... 26
Dialyse .................................................................................................................... 26
Principe ........................................................................................................... 27
Protocole......................................................................................................... 27
Détermination de la concentration protéique ...................................................... 28
Principe ........................................................................................................... 28
Protocole......................................................................................................... 28
Tests enzymatiques ................................................................................................ 29
Principe ........................................................................................................... 29
Protocole......................................................................................................... 29
3. Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) ................................................................ 30 Principe .................................................................................................................. 30
Protocole ................................................................................................................ 31
Résultats et discussion ............................................................................................................. 32
1. Partie 1 : production et purification enzymatique ....................................................... 32 Culture cellulaire .................................................................................................... 32
Induction à l’IPTG ................................................................................................... 32
Lyse cellulaire ......................................................................................................... 33
Purification ............................................................................................................. 35
Caractérisation ....................................................................................................... 37
Quantification ................................................................................................. 37
Détermination de l’activité .................................................................................... 38
Test d’activité enzymatique............................................................................ 38
Rapport de l’absorbance 400/280 nm ............................................................ 40
Optimisation de la production et purification ....................................................... 41
Conclusion de la partie 1 ........................................................................................ 42
2. Partie 2 : mise au point de la DSF ................................................................................. 44 Tests d’inhibition enzymatique .............................................................................. 44
Spectres UV-visible des composés ......................................................................... 45
Protocoles utilisés .................................................................................................. 47
Premier Protocole inspiré de la littérature .................................................... 47
Protocole ................................................................................................... 47
Résultats et discussion .............................................................................. 48
Second protocole inspiré d’un kit ................................................................... 50
Protocole ................................................................................................... 50
Résultats et discussion .............................................................................. 50
Influence de la concentration en inhibiteur .............................................. 51
Comparaison des deux méthodes .................................................................. 53
Conclusion de la partie 2 ........................................................................................ 54
Conclusion et perspectives ....................................................................................................... 55
Table des abréviations.............................................................................................................. 56
Références bibliographiques .................................................................................................... 58
Table des annexesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64032 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Etudes structurale et enzymatique de l’indoléamine 2, 3- dioxygénase / DAVID CALOMNE
Titre : Etudes structurale et enzymatique de l’indoléamine 2, 3- dioxygénase Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : DAVID CALOMNE, Auteur Année de publication : 2013 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : BIOLOGIE MÉDICALE INDOLEAMINE 2,3-DIOXYGENASE L-TRYPTOPHANE hIDO THERMOTRANSFORMATION CULTURE BACTÉRIENNE LYSE CELLULAIRE CHROMATOGRAPHIE : D’AFFINITÉ, ECHANGEUSE IONIQUE,D'EXCLUSION IMAC ELECTROPHORESE DIALYSE Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65247 Etudes structurale et enzymatique de l’indoléamine 2, 3- dioxygénase [TFE / Mémoire] / DAVID CALOMNE, Auteur . - 2013.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : BIOLOGIE MÉDICALE INDOLEAMINE 2,3-DIOXYGENASE L-TRYPTOPHANE hIDO THERMOTRANSFORMATION CULTURE BACTÉRIENNE LYSE CELLULAIRE CHROMATOGRAPHIE : D’AFFINITÉ, ECHANGEUSE IONIQUE,D'EXCLUSION IMAC ELECTROPHORESE DIALYSE Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65247 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire