Titre : |
NOUVEAUX ANTICOAGULANTS ORAUX PAR LC-MS/MS : Précipitation des protéines et/ou SLE (Supported Liquid Extraction) |
Type de document : |
TFE / Mémoire |
Auteurs : |
Pierre ROLLIN, Auteur ; Léonidas Banyihishako, Directeur de la recherche |
Année de publication : |
2015 |
Note générale : |
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. |
Langues : |
Français (fre) |
Mots-clés : |
biologie médicale GHDC Hôpital Saint Joseph anticoagulants |
Index. décimale : |
TFE Bio Med TFE Biologie médicale |
Résumé : |
NOUVEAUX ANTICOAGULANTS ORAUX PAR LC-MS/MS
Précipitation des protéines et/ou SLE (Supported Liquid Extraction)
Présenté par ROLLIN Pierre
Avant de pouvoir doser une molécule, il faut préparer et développer une méthode de dosage ainsi que la valider.
Pour ce travail, les molécules choisies pour être dosées sont les nouveaux anticoagulants oraux, Dabigatran, Rivaroxaban et Apixaban.
En effet, le dosage d’anticoagulants devient indispensable pour une certaine fraction de la population. Si le traitement n’est pas assez dosé, celui-ci sera inefficace. Tandis qu’un surdosage peut faciliter l’apparition d’hémorragies.
Le dosage, à proprement parlé, se réalise sur chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-MS/MS).
Il faut donc préparer chaque compartiment à pouvoir détecter et quantifier les molécules anticoagulantes.
Pour la chromatographie liquide, les paramètres de la colonne, la préparation des phases mobiles ainsi que celle du gradient de concentration sont indispensables.
Pour le spectromètre de masse, il faut déterminer les fractions des ions parents et fils et la tension au cône et l’énergie de collision.
Mais ce n’est pas tout. Il faut aussi mettre en place des méthodes de traitement et de préparation des échantillons.
Pour ce travail, deux méthodes ont été développées. Une par extraction sur un automate nommé Extrahera qui réalise une extraction liquide/liquide sur support solide, ou SLE, réalisée sur plaques de 96 puits, et une autre méthode par précipitation.
Enfin, une méthode de validation peut être mise en place. Elle permet de démontrer qu'elle correspond à l'usage pour lequel elle est prévue. Elle inclut un ensemble d’opérations nécessaires pour prouver que le protocole est suffisamment exact et fiable pour avoir confiance dans les résultats fournis.
On travaille sur la linéarité étendue, la répétabilité, la reproductibilité, la limite de détection, la limite de quantification et la suppression ou l’augmentation d’ions.
Avec tout ceci, une méthode valide et précise est prête à l’emploi.
|
Note de contenu : |
Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage
Introduction………………………………………………………………………………………………………………………..8
Partie théorique…………………………………………………………………………………………………………………10
1. Les anticoagulants…………………………………………………………………………………………………10
1.1 Un anticoagulant………………………………………………………………………………………..10
1.2 Les nouveaux anticoagulants oraux……………………………………………………….10
2. Le préanalytique……………………………………………………………………………………………………14
2.1 La précipitation des protéines (Protein Crash)………………………………....14
2.2 La SLE………………………………………………………………………………………………………….15
2.3 L’évaporation………………………………………………………………………………………………16
2.4 La reconstitution……………………………………………………………………………………….17
2.5 La chromatographie liquide……………………………………………………………………..17
2.6 Le spectromètre de masse………………………………………………………………………17
3. La validation de méthode…………………………………………………………………………………….21
3.1 La linéarité étendue………………………………………………………………………………….21
3.2 La répétabilité…………………………………………………………………………………………..21
3.3 La reproductibilité……………………………………………………………………………………22
3.4 LOD (Limit Of Detection)……………………………………………………………………….22
3.5 LOQ (Limit Of Quantification)………………………………………………………………22
3.6 La suppression ou l’augmentation d’ions……………………………………………….22
Partie pratique………………………………………………………………………………………………………………….23
1. Le matériel et les méthodes………………………………………………………………………………23
1.1 Paramètres de réglage du spectromètre de masse…………………………..23
1.1.1 La détermination des transitions………………………………………………23
1.2 Paramètres de la chromatographie liquide………………………………………….25
1.2.1 Les paramètres de la colonne…………………………………………………….25
1.2.2 Les phases mobiles……………………………………………………………………….26
1.2.3 Le gradient de concentration…………………………………………………….26
1.3 Les standards internes……………………………………………………………………………28
1.4 La préparation et le traitement des échantillons……………………………..29
1.4.1 Précipitation : mode opératoire…………………………………………………29
1.4.2 SLE (Extrahera) : mode opératoire………………………………………….29
1.5 Evaluation de linéarité……………………………………………………………………………..30
1.5.1 La linéarité en solution........................................................…...30
1.5.2 La linéarité sur plasma reconstitué (lyophilisé)…………….……….30
1.5.3 La linéarité par rapport à SLE (Extrahera)…………………………….31
Kits commerciaux (Hyphen BioMed)……………………………………………………………………………..33
1.6 Les calibrateurs…………………………………………………………………………………………33
1.7 Les contrôles………………………………………………………………………………………………34
1.8 La répétabilité……………………………………………………………………………………………35
1.9 La reproductibilité……………………………………………………………………………………35
1.10 La limite de détection………………………………………………………………………………36
1.11 La limite de quantification………………………………………………………………………36
Résultats…………………………………………………………………………………………………………………………….37
1. Résultats de la linéarité en phase liquide (sans plasma)…………….………………..37
2. Résultats de la linéarité sur plasma reconstitué (lyophilisé)………………………38
3. Résultats de la linéarité sur plasma lyophilisé par SLE………………….…………….40
3.1 DCM/IPA 95/5……………………………………………………………………………………………….40
3.2 Acétate d’éthyle…………………………………………………………………………………………….41
3.3 TBME…………………………………………………………………………………………………………………42
3.4 DCM/IPA 90/10……………………………………………………………………………………………..43
4. La limite de linéarité…………………………………………………………………………………………….44
5. Passage des calibrateurs et des contrôles………………………………………………………46
6. La répétabilité de la méthode pour la molécule d’Apixaban………………………..49
7. La reproductibilité de la méthode…………………………………………………………………….50
8. La limite de détection………………………………………………………………………………………….51
9. La limite de quantification………………………………………………………………………………….51
10. La suppression ou l’augmentation d’ions……………………………………………………………53
Conclusion……………………………………………………………………………………………………………………………54
Glossaire……………………………………………………………………………………………………………………………..55
Bibliographie………………………………………………………………………………………………………………………56
Annexes
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Permalink : |
./index.php?lvl=notice_display&id=64051 |
NOUVEAUX ANTICOAGULANTS ORAUX PAR LC-MS/MS : Précipitation des protéines et/ou SLE (Supported Liquid Extraction) [TFE / Mémoire] / Pierre ROLLIN, Auteur ; Léonidas Banyihishako, Directeur de la recherche . - 2015. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français ( fre)
Mots-clés : |
biologie médicale GHDC Hôpital Saint Joseph anticoagulants |
Index. décimale : |
TFE Bio Med TFE Biologie médicale |
Résumé : |
NOUVEAUX ANTICOAGULANTS ORAUX PAR LC-MS/MS
Précipitation des protéines et/ou SLE (Supported Liquid Extraction)
Présenté par ROLLIN Pierre
Avant de pouvoir doser une molécule, il faut préparer et développer une méthode de dosage ainsi que la valider.
Pour ce travail, les molécules choisies pour être dosées sont les nouveaux anticoagulants oraux, Dabigatran, Rivaroxaban et Apixaban.
En effet, le dosage d’anticoagulants devient indispensable pour une certaine fraction de la population. Si le traitement n’est pas assez dosé, celui-ci sera inefficace. Tandis qu’un surdosage peut faciliter l’apparition d’hémorragies.
Le dosage, à proprement parlé, se réalise sur chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-MS/MS).
Il faut donc préparer chaque compartiment à pouvoir détecter et quantifier les molécules anticoagulantes.
Pour la chromatographie liquide, les paramètres de la colonne, la préparation des phases mobiles ainsi que celle du gradient de concentration sont indispensables.
Pour le spectromètre de masse, il faut déterminer les fractions des ions parents et fils et la tension au cône et l’énergie de collision.
Mais ce n’est pas tout. Il faut aussi mettre en place des méthodes de traitement et de préparation des échantillons.
Pour ce travail, deux méthodes ont été développées. Une par extraction sur un automate nommé Extrahera qui réalise une extraction liquide/liquide sur support solide, ou SLE, réalisée sur plaques de 96 puits, et une autre méthode par précipitation.
Enfin, une méthode de validation peut être mise en place. Elle permet de démontrer qu'elle correspond à l'usage pour lequel elle est prévue. Elle inclut un ensemble d’opérations nécessaires pour prouver que le protocole est suffisamment exact et fiable pour avoir confiance dans les résultats fournis.
On travaille sur la linéarité étendue, la répétabilité, la reproductibilité, la limite de détection, la limite de quantification et la suppression ou l’augmentation d’ions.
Avec tout ceci, une méthode valide et précise est prête à l’emploi.
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Note de contenu : |
Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage
Introduction………………………………………………………………………………………………………………………..8
Partie théorique…………………………………………………………………………………………………………………10
1. Les anticoagulants…………………………………………………………………………………………………10
1.1 Un anticoagulant………………………………………………………………………………………..10
1.2 Les nouveaux anticoagulants oraux……………………………………………………….10
2. Le préanalytique……………………………………………………………………………………………………14
2.1 La précipitation des protéines (Protein Crash)………………………………....14
2.2 La SLE………………………………………………………………………………………………………….15
2.3 L’évaporation………………………………………………………………………………………………16
2.4 La reconstitution……………………………………………………………………………………….17
2.5 La chromatographie liquide……………………………………………………………………..17
2.6 Le spectromètre de masse………………………………………………………………………17
3. La validation de méthode…………………………………………………………………………………….21
3.1 La linéarité étendue………………………………………………………………………………….21
3.2 La répétabilité…………………………………………………………………………………………..21
3.3 La reproductibilité……………………………………………………………………………………22
3.4 LOD (Limit Of Detection)……………………………………………………………………….22
3.5 LOQ (Limit Of Quantification)………………………………………………………………22
3.6 La suppression ou l’augmentation d’ions……………………………………………….22
Partie pratique………………………………………………………………………………………………………………….23
1. Le matériel et les méthodes………………………………………………………………………………23
1.1 Paramètres de réglage du spectromètre de masse…………………………..23
1.1.1 La détermination des transitions………………………………………………23
1.2 Paramètres de la chromatographie liquide………………………………………….25
1.2.1 Les paramètres de la colonne…………………………………………………….25
1.2.2 Les phases mobiles……………………………………………………………………….26
1.2.3 Le gradient de concentration…………………………………………………….26
1.3 Les standards internes……………………………………………………………………………28
1.4 La préparation et le traitement des échantillons……………………………..29
1.4.1 Précipitation : mode opératoire…………………………………………………29
1.4.2 SLE (Extrahera) : mode opératoire………………………………………….29
1.5 Evaluation de linéarité……………………………………………………………………………..30
1.5.1 La linéarité en solution........................................................…...30
1.5.2 La linéarité sur plasma reconstitué (lyophilisé)…………….……….30
1.5.3 La linéarité par rapport à SLE (Extrahera)…………………………….31
Kits commerciaux (Hyphen BioMed)……………………………………………………………………………..33
1.6 Les calibrateurs…………………………………………………………………………………………33
1.7 Les contrôles………………………………………………………………………………………………34
1.8 La répétabilité……………………………………………………………………………………………35
1.9 La reproductibilité……………………………………………………………………………………35
1.10 La limite de détection………………………………………………………………………………36
1.11 La limite de quantification………………………………………………………………………36
Résultats…………………………………………………………………………………………………………………………….37
1. Résultats de la linéarité en phase liquide (sans plasma)…………….………………..37
2. Résultats de la linéarité sur plasma reconstitué (lyophilisé)………………………38
3. Résultats de la linéarité sur plasma lyophilisé par SLE………………….…………….40
3.1 DCM/IPA 95/5……………………………………………………………………………………………….40
3.2 Acétate d’éthyle…………………………………………………………………………………………….41
3.3 TBME…………………………………………………………………………………………………………………42
3.4 DCM/IPA 90/10……………………………………………………………………………………………..43
4. La limite de linéarité…………………………………………………………………………………………….44
5. Passage des calibrateurs et des contrôles………………………………………………………46
6. La répétabilité de la méthode pour la molécule d’Apixaban………………………..49
7. La reproductibilité de la méthode…………………………………………………………………….50
8. La limite de détection………………………………………………………………………………………….51
9. La limite de quantification………………………………………………………………………………….51
10. La suppression ou l’augmentation d’ions……………………………………………………………53
Conclusion……………………………………………………………………………………………………………………………54
Glossaire……………………………………………………………………………………………………………………………..55
Bibliographie………………………………………………………………………………………………………………………56
Annexes
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