Centre de Documentation Campus Montignies
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Lundi : 8h-18h30
Mardi : 8h-18h30
Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
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Myélome multiple : Approche cytogénétique des anomalies récurrentes du chromosome 1 / MOERMAN Soizic
Titre : Myélome multiple : Approche cytogénétique des anomalies récurrentes du chromosome 1 Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : MOERMAN Soizic, Auteur Année de publication : 2011 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : CANCEROLOGIE , MYELOME MULTIPLE , CYTOGENETIQUE , ANOMALIES DU CHROMOSOME 1 , CARYOTYPE , HYBRIDATION IN SITU , GENOMIQUE , DIAGNOSTIC Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64909 Myélome multiple : Approche cytogénétique des anomalies récurrentes du chromosome 1 [TFE / Mémoire] / MOERMAN Soizic, Auteur . - 2011.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : CANCEROLOGIE , MYELOME MULTIPLE , CYTOGENETIQUE , ANOMALIES DU CHROMOSOME 1 , CARYOTYPE , HYBRIDATION IN SITU , GENOMIQUE , DIAGNOSTIC Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64909 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Normalisation de l'expression de gènes au sein de reins transplantés chez la souris / D'HEUR Catherine
Titre : Normalisation de l'expression de gènes au sein de reins transplantés chez la souris Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : D'HEUR Catherine, Auteur Année de publication : 2011 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : IMMUNOLOGIE , GREFFE DE REIN , ALLOGENIQUE , REJET DE GREFFE , MODELE SOURIS 2 REINS , EXPRESSION CYTOKINES , GENE REFERENT , EXPRESSION DE GENES Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64889 Normalisation de l'expression de gènes au sein de reins transplantés chez la souris [TFE / Mémoire] / D'HEUR Catherine, Auteur . - 2011.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : IMMUNOLOGIE , GREFFE DE REIN , ALLOGENIQUE , REJET DE GREFFE , MODELE SOURIS 2 REINS , EXPRESSION CYTOKINES , GENE REFERENT , EXPRESSION DE GENES Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64889 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire NOUVEAUX ANTICOAGULANTS ORAUX PAR LC-MS/MS : Précipitation des protéines et/ou SLE (Supported Liquid Extraction) / Pierre ROLLIN
Titre : NOUVEAUX ANTICOAGULANTS ORAUX PAR LC-MS/MS : Précipitation des protéines et/ou SLE (Supported Liquid Extraction) Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Pierre ROLLIN, Auteur ; Léonidas Banyihishako, Directeur de la recherche Année de publication : 2015 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale GHDC Hôpital Saint Joseph anticoagulants Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : NOUVEAUX ANTICOAGULANTS ORAUX PAR LC-MS/MS
Précipitation des protéines et/ou SLE (Supported Liquid Extraction)
Présenté par ROLLIN Pierre
Avant de pouvoir doser une molécule, il faut préparer et développer une méthode de dosage ainsi que la valider.
Pour ce travail, les molécules choisies pour être dosées sont les nouveaux anticoagulants oraux, Dabigatran, Rivaroxaban et Apixaban.
En effet, le dosage d’anticoagulants devient indispensable pour une certaine fraction de la population. Si le traitement n’est pas assez dosé, celui-ci sera inefficace. Tandis qu’un surdosage peut faciliter l’apparition d’hémorragies.
Le dosage, à proprement parlé, se réalise sur chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-MS/MS).
Il faut donc préparer chaque compartiment à pouvoir détecter et quantifier les molécules anticoagulantes.
Pour la chromatographie liquide, les paramètres de la colonne, la préparation des phases mobiles ainsi que celle du gradient de concentration sont indispensables.
Pour le spectromètre de masse, il faut déterminer les fractions des ions parents et fils et la tension au cône et l’énergie de collision.
Mais ce n’est pas tout. Il faut aussi mettre en place des méthodes de traitement et de préparation des échantillons.
Pour ce travail, deux méthodes ont été développées. Une par extraction sur un automate nommé Extrahera qui réalise une extraction liquide/liquide sur support solide, ou SLE, réalisée sur plaques de 96 puits, et une autre méthode par précipitation.
Enfin, une méthode de validation peut être mise en place. Elle permet de démontrer qu'elle correspond à l'usage pour lequel elle est prévue. Elle inclut un ensemble d’opérations nécessaires pour prouver que le protocole est suffisamment exact et fiable pour avoir confiance dans les résultats fournis.
On travaille sur la linéarité étendue, la répétabilité, la reproductibilité, la limite de détection, la limite de quantification et la suppression ou l’augmentation d’ions.
Avec tout ceci, une méthode valide et précise est prête à l’emploi.
Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage
Introduction………………………………………………………………………………………………………………………..8
Partie théorique…………………………………………………………………………………………………………………10
1. Les anticoagulants…………………………………………………………………………………………………10
1.1 Un anticoagulant………………………………………………………………………………………..10
1.2 Les nouveaux anticoagulants oraux……………………………………………………….10
2. Le préanalytique……………………………………………………………………………………………………14
2.1 La précipitation des protéines (Protein Crash)………………………………....14
2.2 La SLE………………………………………………………………………………………………………….15
2.3 L’évaporation………………………………………………………………………………………………16
2.4 La reconstitution……………………………………………………………………………………….17
2.5 La chromatographie liquide……………………………………………………………………..17
2.6 Le spectromètre de masse………………………………………………………………………17
3. La validation de méthode…………………………………………………………………………………….21
3.1 La linéarité étendue………………………………………………………………………………….21
3.2 La répétabilité…………………………………………………………………………………………..21
3.3 La reproductibilité……………………………………………………………………………………22
3.4 LOD (Limit Of Detection)……………………………………………………………………….22
3.5 LOQ (Limit Of Quantification)………………………………………………………………22
3.6 La suppression ou l’augmentation d’ions……………………………………………….22
Partie pratique………………………………………………………………………………………………………………….23
1. Le matériel et les méthodes………………………………………………………………………………23
1.1 Paramètres de réglage du spectromètre de masse…………………………..23
1.1.1 La détermination des transitions………………………………………………23
1.2 Paramètres de la chromatographie liquide………………………………………….25
1.2.1 Les paramètres de la colonne…………………………………………………….25
1.2.2 Les phases mobiles……………………………………………………………………….26
1.2.3 Le gradient de concentration…………………………………………………….26
1.3 Les standards internes……………………………………………………………………………28
1.4 La préparation et le traitement des échantillons……………………………..29
1.4.1 Précipitation : mode opératoire…………………………………………………29
1.4.2 SLE (Extrahera) : mode opératoire………………………………………….29
1.5 Evaluation de linéarité……………………………………………………………………………..30
1.5.1 La linéarité en solution........................................................…...30
1.5.2 La linéarité sur plasma reconstitué (lyophilisé)…………….……….30
1.5.3 La linéarité par rapport à SLE (Extrahera)…………………………….31
Kits commerciaux (Hyphen BioMed)……………………………………………………………………………..33
1.6 Les calibrateurs…………………………………………………………………………………………33
1.7 Les contrôles………………………………………………………………………………………………34
1.8 La répétabilité……………………………………………………………………………………………35
1.9 La reproductibilité……………………………………………………………………………………35
1.10 La limite de détection………………………………………………………………………………36
1.11 La limite de quantification………………………………………………………………………36
Résultats…………………………………………………………………………………………………………………………….37
1. Résultats de la linéarité en phase liquide (sans plasma)…………….………………..37
2. Résultats de la linéarité sur plasma reconstitué (lyophilisé)………………………38
3. Résultats de la linéarité sur plasma lyophilisé par SLE………………….…………….40
3.1 DCM/IPA 95/5……………………………………………………………………………………………….40
3.2 Acétate d’éthyle…………………………………………………………………………………………….41
3.3 TBME…………………………………………………………………………………………………………………42
3.4 DCM/IPA 90/10……………………………………………………………………………………………..43
4. La limite de linéarité…………………………………………………………………………………………….44
5. Passage des calibrateurs et des contrôles………………………………………………………46
6. La répétabilité de la méthode pour la molécule d’Apixaban………………………..49
7. La reproductibilité de la méthode…………………………………………………………………….50
8. La limite de détection………………………………………………………………………………………….51
9. La limite de quantification………………………………………………………………………………….51
10. La suppression ou l’augmentation d’ions……………………………………………………………53
Conclusion……………………………………………………………………………………………………………………………54
Glossaire……………………………………………………………………………………………………………………………..55
Bibliographie………………………………………………………………………………………………………………………56
Annexes
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64051 NOUVEAUX ANTICOAGULANTS ORAUX PAR LC-MS/MS : Précipitation des protéines et/ou SLE (Supported Liquid Extraction) [TFE / Mémoire] / Pierre ROLLIN, Auteur ; Léonidas Banyihishako, Directeur de la recherche . - 2015.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale GHDC Hôpital Saint Joseph anticoagulants Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : NOUVEAUX ANTICOAGULANTS ORAUX PAR LC-MS/MS
Précipitation des protéines et/ou SLE (Supported Liquid Extraction)
Présenté par ROLLIN Pierre
Avant de pouvoir doser une molécule, il faut préparer et développer une méthode de dosage ainsi que la valider.
Pour ce travail, les molécules choisies pour être dosées sont les nouveaux anticoagulants oraux, Dabigatran, Rivaroxaban et Apixaban.
En effet, le dosage d’anticoagulants devient indispensable pour une certaine fraction de la population. Si le traitement n’est pas assez dosé, celui-ci sera inefficace. Tandis qu’un surdosage peut faciliter l’apparition d’hémorragies.
Le dosage, à proprement parlé, se réalise sur chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-MS/MS).
Il faut donc préparer chaque compartiment à pouvoir détecter et quantifier les molécules anticoagulantes.
Pour la chromatographie liquide, les paramètres de la colonne, la préparation des phases mobiles ainsi que celle du gradient de concentration sont indispensables.
Pour le spectromètre de masse, il faut déterminer les fractions des ions parents et fils et la tension au cône et l’énergie de collision.
Mais ce n’est pas tout. Il faut aussi mettre en place des méthodes de traitement et de préparation des échantillons.
Pour ce travail, deux méthodes ont été développées. Une par extraction sur un automate nommé Extrahera qui réalise une extraction liquide/liquide sur support solide, ou SLE, réalisée sur plaques de 96 puits, et une autre méthode par précipitation.
Enfin, une méthode de validation peut être mise en place. Elle permet de démontrer qu'elle correspond à l'usage pour lequel elle est prévue. Elle inclut un ensemble d’opérations nécessaires pour prouver que le protocole est suffisamment exact et fiable pour avoir confiance dans les résultats fournis.
On travaille sur la linéarité étendue, la répétabilité, la reproductibilité, la limite de détection, la limite de quantification et la suppression ou l’augmentation d’ions.
Avec tout ceci, une méthode valide et précise est prête à l’emploi.
Note de contenu : Table des matières
Remerciements
Présentation du lieu de stage
Introduction………………………………………………………………………………………………………………………..8
Partie théorique…………………………………………………………………………………………………………………10
1. Les anticoagulants…………………………………………………………………………………………………10
1.1 Un anticoagulant………………………………………………………………………………………..10
1.2 Les nouveaux anticoagulants oraux……………………………………………………….10
2. Le préanalytique……………………………………………………………………………………………………14
2.1 La précipitation des protéines (Protein Crash)………………………………....14
2.2 La SLE………………………………………………………………………………………………………….15
2.3 L’évaporation………………………………………………………………………………………………16
2.4 La reconstitution……………………………………………………………………………………….17
2.5 La chromatographie liquide……………………………………………………………………..17
2.6 Le spectromètre de masse………………………………………………………………………17
3. La validation de méthode…………………………………………………………………………………….21
3.1 La linéarité étendue………………………………………………………………………………….21
3.2 La répétabilité…………………………………………………………………………………………..21
3.3 La reproductibilité……………………………………………………………………………………22
3.4 LOD (Limit Of Detection)……………………………………………………………………….22
3.5 LOQ (Limit Of Quantification)………………………………………………………………22
3.6 La suppression ou l’augmentation d’ions……………………………………………….22
Partie pratique………………………………………………………………………………………………………………….23
1. Le matériel et les méthodes………………………………………………………………………………23
1.1 Paramètres de réglage du spectromètre de masse…………………………..23
1.1.1 La détermination des transitions………………………………………………23
1.2 Paramètres de la chromatographie liquide………………………………………….25
1.2.1 Les paramètres de la colonne…………………………………………………….25
1.2.2 Les phases mobiles……………………………………………………………………….26
1.2.3 Le gradient de concentration…………………………………………………….26
1.3 Les standards internes……………………………………………………………………………28
1.4 La préparation et le traitement des échantillons……………………………..29
1.4.1 Précipitation : mode opératoire…………………………………………………29
1.4.2 SLE (Extrahera) : mode opératoire………………………………………….29
1.5 Evaluation de linéarité……………………………………………………………………………..30
1.5.1 La linéarité en solution........................................................…...30
1.5.2 La linéarité sur plasma reconstitué (lyophilisé)…………….……….30
1.5.3 La linéarité par rapport à SLE (Extrahera)…………………………….31
Kits commerciaux (Hyphen BioMed)……………………………………………………………………………..33
1.6 Les calibrateurs…………………………………………………………………………………………33
1.7 Les contrôles………………………………………………………………………………………………34
1.8 La répétabilité……………………………………………………………………………………………35
1.9 La reproductibilité……………………………………………………………………………………35
1.10 La limite de détection………………………………………………………………………………36
1.11 La limite de quantification………………………………………………………………………36
Résultats…………………………………………………………………………………………………………………………….37
1. Résultats de la linéarité en phase liquide (sans plasma)…………….………………..37
2. Résultats de la linéarité sur plasma reconstitué (lyophilisé)………………………38
3. Résultats de la linéarité sur plasma lyophilisé par SLE………………….…………….40
3.1 DCM/IPA 95/5……………………………………………………………………………………………….40
3.2 Acétate d’éthyle…………………………………………………………………………………………….41
3.3 TBME…………………………………………………………………………………………………………………42
3.4 DCM/IPA 90/10……………………………………………………………………………………………..43
4. La limite de linéarité…………………………………………………………………………………………….44
5. Passage des calibrateurs et des contrôles………………………………………………………46
6. La répétabilité de la méthode pour la molécule d’Apixaban………………………..49
7. La reproductibilité de la méthode…………………………………………………………………….50
8. La limite de détection………………………………………………………………………………………….51
9. La limite de quantification………………………………………………………………………………….51
10. La suppression ou l’augmentation d’ions……………………………………………………………53
Conclusion……………………………………………………………………………………………………………………………54
Glossaire……………………………………………………………………………………………………………………………..55
Bibliographie………………………………………………………………………………………………………………………56
Annexes
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64051 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Optimalisation d’une technique de cryopréservation du sperme humain / Pauline TILMANT
Titre : Optimalisation d’une technique de cryopréservation du sperme humain Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Pauline TILMANT, Auteur ; Xhristine WYNS, Directeur de la recherche Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Clinique Universitaires st Luc laboratoire d'andrologie. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Introduction générale ................................................................................................................................................. 6
Partie théorique .............................................................................................................................................................. 7
I. Historique ........................................................................................................................................................... 7
II. L’anatomie du système génital de l’homme ...................................................................................................... 7
1. Testicule .......................................................................................................................................................... 8
2. Vésicules séminales ........................................................................................................................................ 8
3. La prostate ...................................................................................................................................................... 8
III. Histologie des tubules séminifères ................................................................................................................. 9
IV. Physiologie de la spermatogenèse ............................................................................................................... 10
1. La spermatocytogenèse ................................................................................................................................ 11
2. Spermiogenèse ............................................................................................................................................. 12
V. Le sperme ......................................................................................................................................................... 12
VI. La cryopréservation ...................................................................................................................................... 13
1. Contexte ....................................................................................................................................................... 13
2. Les cryoprotectants (CP) ............................................................................................................................... 14
VII. Techniques .................................................................................................................................................... 16
1. Spermogramme ............................................................................................................................................ 16
2. Capacitation .................................................................................................................................................. 18
3. La cryopréservation du sperme .................................................................................................................... 18
4. Décongélation du sperme ............................................................................................................................. 19
VIII. Objectif de l’étude ........................................................................................................................................ 19
Partie pratique .............................................................................................................................................................. 20
I. Matériel et méthodes ....................................................................................................................................... 20
1. Plan de l’expérience ...................................................................................................................................... 20
2. Composition et prix unitaire de chaque milieu cryoprotectant ................................................................... 20
3. Spermogramme ............................................................................................................................................ 21
4. La cryopréservation du sperme frais ............................................................................................................ 23
5. Cryopréservation du sperme purifié............................................................................................................. 26
6. Décongélation ............................................................................................................................................... 30
II. Résultats et discussion ...................................................................................................................................... 31
1. Résultats ....................................................................................................................................................... 31
2. Discussion ..................................................................................................................................................... 35
Conclusion générale et perspectives ............................................................................................................................ 36
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65854 Optimalisation d’une technique de cryopréservation du sperme humain [TFE / Mémoire] / Pauline TILMANT, Auteur ; Xhristine WYNS, Directeur de la recherche . - 2017.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Clinique Universitaires st Luc laboratoire d'andrologie. Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
Introduction générale ................................................................................................................................................. 6
Partie théorique .............................................................................................................................................................. 7
I. Historique ........................................................................................................................................................... 7
II. L’anatomie du système génital de l’homme ...................................................................................................... 7
1. Testicule .......................................................................................................................................................... 8
2. Vésicules séminales ........................................................................................................................................ 8
3. La prostate ...................................................................................................................................................... 8
III. Histologie des tubules séminifères ................................................................................................................. 9
IV. Physiologie de la spermatogenèse ............................................................................................................... 10
1. La spermatocytogenèse ................................................................................................................................ 11
2. Spermiogenèse ............................................................................................................................................. 12
V. Le sperme ......................................................................................................................................................... 12
VI. La cryopréservation ...................................................................................................................................... 13
1. Contexte ....................................................................................................................................................... 13
2. Les cryoprotectants (CP) ............................................................................................................................... 14
VII. Techniques .................................................................................................................................................... 16
1. Spermogramme ............................................................................................................................................ 16
2. Capacitation .................................................................................................................................................. 18
3. La cryopréservation du sperme .................................................................................................................... 18
4. Décongélation du sperme ............................................................................................................................. 19
VIII. Objectif de l’étude ........................................................................................................................................ 19
Partie pratique .............................................................................................................................................................. 20
I. Matériel et méthodes ....................................................................................................................................... 20
1. Plan de l’expérience ...................................................................................................................................... 20
2. Composition et prix unitaire de chaque milieu cryoprotectant ................................................................... 20
3. Spermogramme ............................................................................................................................................ 21
4. La cryopréservation du sperme frais ............................................................................................................ 23
5. Cryopréservation du sperme purifié............................................................................................................. 26
6. Décongélation ............................................................................................................................................... 30
II. Résultats et discussion ...................................................................................................................................... 31
1. Résultats ....................................................................................................................................................... 31
2. Discussion ..................................................................................................................................................... 35
Conclusion générale et perspectives ............................................................................................................................ 36
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65854 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Optimalisation de la technique de quantification par RT-qPCR des ARNm sur un faible nombre de cellules / Süheda ESEN
Titre : Optimalisation de la technique de quantification par RT-qPCR des ARNm sur un faible nombre de cellules Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Süheda ESEN, Auteur ; Véronique Flamand, Directeur de la recherche ; Frédéric Paulart, Directeur de la recherche Année de publication : 2015 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale ULB Institut d'immunologie médicale IMI Gosselies Immunologie Quantification par RT-qPCR Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Technique imaginée par Kary Mullis et Michael Smith en 1985 (Prix Nobel dès 1993), la réaction en chaîne par polymérase, dit PCR pour Polymerase Chain Reaction, est une technique de biologie moléculaire qui permet l’amplification en chaîne de l’ADN/l’ADNc par réplication grâce à une enzyme, la polymérase.
Cette technique connait un grand essor dès la découverte de polymérases résistantes aux températures élevées, de Taq polymérases, qui ont permis l’automatisation de la technique pour l’usage en routine.
L’objectif de ce travail est la détection, par amplification PCR, d’ARN dans de très faible quantité d’échantillonnage cellulaire. Pour amplifier de l’ARN par la méthode PCR, il est nécessaire de rétro-transcrire l’ARN afin obtenir l’ADNc qui sera amplifié et détecté. La quantification se fait par la détection de la fluorescence à chaque cycle. L’ensemble de cette méthodologie porte le nom de RT-qPCR pour Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction.
Cette technique, très précise et sensible, fera l’objet d’une optimalisation afin de déterminer la meilleure procédure à suivre pour quantifier des profils de cytokines dans des cellules immunitaires ou des tissus enflammés à partir de très faible quantité cellulaire.Note de contenu : Table des matières
Remerciements ........................................................................................................................... .
Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 7
Introduction ................................................................................................................................ 8
Généralités ................................................................................................................................. 8
I. Introduction à l’immunologie générale .............................................................................. 9
1.1. L’immunité naturelle / innée / native ......................................................................... 9
La barrière épithéliale ....................................................................................................... 10
Les phagocytes .................................................................................................................. 10
Les cellules NK ................................................................................................................... 11
Les médiateurs solubles .................................................................................................... 11
Les protéines du système du Complément ................................................................... 12
Les cytokines ................................................................................................................. 12
1.2. Immunité acquise / spécifique / adaptative .............................................................. 14
Les lymphocytes ................................................................................................................ 14
Les lymphocytes B ......................................................................................................... 15
Les lymphocytes T ......................................................................................................... 15
II. Processus de quantification de l’expression de gènes ..................................................... 16
2.1. Extraction de l’ARN .................................................................................................... 16
Méthode par séparation de phases .................................................................................. 16
Méthode de purification sur colonne de silice ................................................................. 17
Méthode de séparation par billes magnétiques : extraction de l’ARNm ......................... 17
Méthode de lyse cellulaire ................................................................................................ 18
2.2. Concentration, pureté et qualité de l'ARN ................................................................ 18
2.3. L’enzyme de la transcription inverse ......................................................................... 20
La rétro-transcriptase AMV............................................................................................... 20
La rétro-transcriptase M-MLV........................................................................................... 20
La rétro-transcriptase M-MuLv ......................................................................................... 21
2.4. Amorces utilisées par l’enzyme de la RT ................................................................... 21
Oligo(dT)Primers ............................................................................................................... 21
Random primers................................................................................................................ 21
Specific Primers ................................................................................................................. 21
2.5. La PCR conventionnelle ............................................................................................. 22
Principe ............................................................................................................................. 22
2.6. La PCR en temps réel ................................................................................................. 23
Principe ............................................................................................................................. 23
Système de détection en temps réel ................................................................................ 25
Agent intercalant: SYBRTM Green I ................................................................................ 25
Sonde d’hydrolyse : sondes TaqmanTM ......................................................................... 27
Les sondes FRET en tandem (sondes LightCyclerTM) ..................................................... 28
2.7. Méthode de quantification ........................................................................................ 28
Quantification absolue par étalonnage avec un standard ............................................... 29
Quantification relative par comparaison des Cq .............................................................. 29
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 31
III. Matériel et méthodes ................................................................................................... 32
3.1. Système d’échantillonnage........................................................................................ 32
Les cellules MC38 .............................................................................................................. 32
Les cellules K-562 (ATCC) .................................................................................................. 32
Isoler les cellules CD45+ du foie murin par l’autoMACS après stimulation au LPS ............. 33
Principe de séparation MACS (Magnetic-activated cell sorting) .................................. 33
Matériel ......................................................................................................................... 33
Injection de LPS en intraveineuse ................................................................................. 34
Dissection de souris ....................................................................................................... 34
Digestion du foie ........................................................................................................... 34
Lyse des globules rouges ............................................................................................... 35
Marquage bille CD45+ .................................................................................................... 35
Séparation magnétique ................................................................................................. 35
3.2. Comptage cellulaires ................................................................................................. 36
Comptage manuel ............................................................................................................. 36
Cellule de Thoma ........................................................................................................... 36
Comptage avec l’automate Beckman Coulter Vi-CELL XR ................................................ 37
Comptage avec l’automate Beckman Coulter Vi-CELL XR ............................................. 37
3.3. Extraction d’ARN au TriPure et Purification sur colonne Qiagen .............................. 38
Principe d’extraction au triPure ........................................................................................ 38
Matériel ............................................................................................................................. 38
Mode opératoire ............................................................................................................... 39
Technique d’extraction ................................................................................................. 39
Technique de purification sur colonne Qiagen ............................................................. 39
3.4. Principe du NanoDrop .............................................................................................. 40
3.5. Lyse cellulaire sans extraction ................................................................................... 41
Principe ............................................................................................................................. 41
Matériel ............................................................................................................................. 41
Mode opératoire Kit Roche ............................................................................................... 41
Mode opératoire Kit Bio-Rad ............................................................................................ 42
3.6. La RT-qPCR ................................................................................................................. 43
Principe ............................................................................................................................. 43
Matériel ............................................................................................................................. 43
Mode opératoire One Step à l’aide du Kit Roche ............................................................. 44
Mode opératoire Two Steps à l’aide du Kit Bio-Rad ........................................................ 45
Préparation pour la réaction de transcription inverse ................................................. 45
Préparation de qPCR Reactions ..................................................................................... 46
IV. Résultats et discussion .................................................................................................. 47
4.1. Quantification des ARNm provenant d’une lignée cellulaire K562 ........................... 47
Comparaison des méthodes .......................................................................................... 48
Efficacité de la PCR ........................................................................................................ 52
Sources d’inefficacité des méthodes de lyse ................................................................ 54
4.2. Quantification des ARNm provenant de cellules triées ............................................ 57
Quantification de la β-actine ............................................................................................ 57
Quantification du TNF-alpha ............................................................................................. 62
Reproductibilité de la PCR One step ................................................................................. 63
Conclusion et perspectivesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64640 Optimalisation de la technique de quantification par RT-qPCR des ARNm sur un faible nombre de cellules [TFE / Mémoire] / Süheda ESEN, Auteur ; Véronique Flamand, Directeur de la recherche ; Frédéric Paulart, Directeur de la recherche . - 2015.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale ULB Institut d'immunologie médicale IMI Gosselies Immunologie Quantification par RT-qPCR Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Technique imaginée par Kary Mullis et Michael Smith en 1985 (Prix Nobel dès 1993), la réaction en chaîne par polymérase, dit PCR pour Polymerase Chain Reaction, est une technique de biologie moléculaire qui permet l’amplification en chaîne de l’ADN/l’ADNc par réplication grâce à une enzyme, la polymérase.
Cette technique connait un grand essor dès la découverte de polymérases résistantes aux températures élevées, de Taq polymérases, qui ont permis l’automatisation de la technique pour l’usage en routine.
L’objectif de ce travail est la détection, par amplification PCR, d’ARN dans de très faible quantité d’échantillonnage cellulaire. Pour amplifier de l’ARN par la méthode PCR, il est nécessaire de rétro-transcrire l’ARN afin obtenir l’ADNc qui sera amplifié et détecté. La quantification se fait par la détection de la fluorescence à chaque cycle. L’ensemble de cette méthodologie porte le nom de RT-qPCR pour Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction.
Cette technique, très précise et sensible, fera l’objet d’une optimalisation afin de déterminer la meilleure procédure à suivre pour quantifier des profils de cytokines dans des cellules immunitaires ou des tissus enflammés à partir de très faible quantité cellulaire.Note de contenu : Table des matières
Remerciements ........................................................................................................................... .
Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 7
Introduction ................................................................................................................................ 8
Généralités ................................................................................................................................. 8
I. Introduction à l’immunologie générale .............................................................................. 9
1.1. L’immunité naturelle / innée / native ......................................................................... 9
La barrière épithéliale ....................................................................................................... 10
Les phagocytes .................................................................................................................. 10
Les cellules NK ................................................................................................................... 11
Les médiateurs solubles .................................................................................................... 11
Les protéines du système du Complément ................................................................... 12
Les cytokines ................................................................................................................. 12
1.2. Immunité acquise / spécifique / adaptative .............................................................. 14
Les lymphocytes ................................................................................................................ 14
Les lymphocytes B ......................................................................................................... 15
Les lymphocytes T ......................................................................................................... 15
II. Processus de quantification de l’expression de gènes ..................................................... 16
2.1. Extraction de l’ARN .................................................................................................... 16
Méthode par séparation de phases .................................................................................. 16
Méthode de purification sur colonne de silice ................................................................. 17
Méthode de séparation par billes magnétiques : extraction de l’ARNm ......................... 17
Méthode de lyse cellulaire ................................................................................................ 18
2.2. Concentration, pureté et qualité de l'ARN ................................................................ 18
2.3. L’enzyme de la transcription inverse ......................................................................... 20
La rétro-transcriptase AMV............................................................................................... 20
La rétro-transcriptase M-MLV........................................................................................... 20
La rétro-transcriptase M-MuLv ......................................................................................... 21
2.4. Amorces utilisées par l’enzyme de la RT ................................................................... 21
Oligo(dT)Primers ............................................................................................................... 21
Random primers................................................................................................................ 21
Specific Primers ................................................................................................................. 21
2.5. La PCR conventionnelle ............................................................................................. 22
Principe ............................................................................................................................. 22
2.6. La PCR en temps réel ................................................................................................. 23
Principe ............................................................................................................................. 23
Système de détection en temps réel ................................................................................ 25
Agent intercalant: SYBRTM Green I ................................................................................ 25
Sonde d’hydrolyse : sondes TaqmanTM ......................................................................... 27
Les sondes FRET en tandem (sondes LightCyclerTM) ..................................................... 28
2.7. Méthode de quantification ........................................................................................ 28
Quantification absolue par étalonnage avec un standard ............................................... 29
Quantification relative par comparaison des Cq .............................................................. 29
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 31
III. Matériel et méthodes ................................................................................................... 32
3.1. Système d’échantillonnage........................................................................................ 32
Les cellules MC38 .............................................................................................................. 32
Les cellules K-562 (ATCC) .................................................................................................. 32
Isoler les cellules CD45+ du foie murin par l’autoMACS après stimulation au LPS ............. 33
Principe de séparation MACS (Magnetic-activated cell sorting) .................................. 33
Matériel ......................................................................................................................... 33
Injection de LPS en intraveineuse ................................................................................. 34
Dissection de souris ....................................................................................................... 34
Digestion du foie ........................................................................................................... 34
Lyse des globules rouges ............................................................................................... 35
Marquage bille CD45+ .................................................................................................... 35
Séparation magnétique ................................................................................................. 35
3.2. Comptage cellulaires ................................................................................................. 36
Comptage manuel ............................................................................................................. 36
Cellule de Thoma ........................................................................................................... 36
Comptage avec l’automate Beckman Coulter Vi-CELL XR ................................................ 37
Comptage avec l’automate Beckman Coulter Vi-CELL XR ............................................. 37
3.3. Extraction d’ARN au TriPure et Purification sur colonne Qiagen .............................. 38
Principe d’extraction au triPure ........................................................................................ 38
Matériel ............................................................................................................................. 38
Mode opératoire ............................................................................................................... 39
Technique d’extraction ................................................................................................. 39
Technique de purification sur colonne Qiagen ............................................................. 39
3.4. Principe du NanoDrop .............................................................................................. 40
3.5. Lyse cellulaire sans extraction ................................................................................... 41
Principe ............................................................................................................................. 41
Matériel ............................................................................................................................. 41
Mode opératoire Kit Roche ............................................................................................... 41
Mode opératoire Kit Bio-Rad ............................................................................................ 42
3.6. La RT-qPCR ................................................................................................................. 43
Principe ............................................................................................................................. 43
Matériel ............................................................................................................................. 43
Mode opératoire One Step à l’aide du Kit Roche ............................................................. 44
Mode opératoire Two Steps à l’aide du Kit Bio-Rad ........................................................ 45
Préparation pour la réaction de transcription inverse ................................................. 45
Préparation de qPCR Reactions ..................................................................................... 46
IV. Résultats et discussion .................................................................................................. 47
4.1. Quantification des ARNm provenant d’une lignée cellulaire K562 ........................... 47
Comparaison des méthodes .......................................................................................... 48
Efficacité de la PCR ........................................................................................................ 52
Sources d’inefficacité des méthodes de lyse ................................................................ 54
4.2. Quantification des ARNm provenant de cellules triées ............................................ 57
Quantification de la β-actine ............................................................................................ 57
Quantification du TNF-alpha ............................................................................................. 62
Reproductibilité de la PCR One step ................................................................................. 63
Conclusion et perspectivesPermalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64640 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Optimisation de la détection et de l'analyse des dommages à l'ADN et des cytokines sécrétées par des cellules sanguines / DUSSART Romain
PermalinkOptimisation de la détection de contamination aux mycoplasmes et évaluation des techniques d'élimination et de prévention / SACRE Stéphanie
PermalinkOptimisation du dosage ELISA du vaccin Stellamune mycoplasma / Louis DEBLAUWE
PermalinkOptimisation de l'élevage des daphnies (Daphnia magna) et mise en oeuvre d'un test de toxicité chronique / DESMET Claire
PermalinkOptimisation de la méthode d'évalutation de la résistance au lavage de moustiquaires traitées avec des insecticides / Diego LAGASSE DE LOCHT
PermalinkOptimisation de la méthode de titrage de Parapoxvirus ovis sur cellules BK-KL3A / Bertrand Cornet
PermalinkOptimisation d’une méthode de titrage viral par standardisation de la concentration cellulaire / Aaron Niaz
PermalinkOptimisation de méthodes phénotypique et moléculaire pour la détection de carbapénèmases / MARLIER Michaël
PermalinkOptimisation de méthodes de titrage viral : Le vaccin Rispoval RS + PI3® / Arthur Maingre
PermalinkOptimisation des ressources biologiques en vue de recherches de mutations récurrentes dans les leucémies aiguës myéloblastiques / Marie FOURREZ
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