Evaluation d’une méthode PCR pour la détection simultanée d’Aspergillus spp. et de Mucorales / Hugo Dachet

Public ISBD Titre : Evaluation d’une méthode PCR pour la détection simultanée d’Aspergillus spp. et de Mucorales Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Hugo Dachet ; Isabel Montesinos Hernández María, Directeur de la recherche ; Nicolas Kesteman, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2024 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les champignons du genre Aspergillus spp. et ceux de l’ordre des Mucorales spp. sont des micro-organismes de l’environnement pouvant provoquer, chez les personnes immunodéprimées, différents types de pathologies en fonction de leur localisation, allant des pneumopathies à des infections fongiques invasives plus graves. Lorsque ces infections se développent chez ces personnes immunodéficientes, la prise en charge rapide avec un traitement adapté est essentielle dans le pronostic de guérison. En effet, les formes les plus graves de ces types de maladies peuvent devenir mortelles pour cette population à risque. Le diagnostic précoce permettra la mise en place d’un plan adapté à la situation. Malheureusement, ces agents pathogènes ne sont pas toujours les plus facile à mettre en évidence, et ce, en lien avec le fait que les techniques utilisées pour la réalisation de ce diagnostic prennent du temps. De nouvelles méthodes permettant d’obtenir une détection rapide des champignons, provenant de la biologie moléculaire (PCR), voient le jour. Ces techniques permettent d’obtenir un diagnostic fiable et plus rapide que certaines méthodes conventionnelles telles que la culture ou l’anatomopathologie. La réalisation de ce travail de fin d’études se base sur l’évaluation du kit de PCR en temps réel, MycoGENIE® Aspergillus species - Mucorales species, de la firme Ademtech.Une vérification complète de cette méthode est réalisée dans ce projet, elle reprend l’étude de plusieurs paramètres comme, l’exactitude, la reproductibilité, la performance de la méthode ou encore une comparaison avec un autre kit PCR. Ce projet utilise des prélèvements dont la majeure partie provient du CHU UCL Godinne, cette évaluation est réalisée à l’aide de plusieurs automates comprenant l’ELITech InGenius de la firme ELITech ainsi que le thermocycleur CFX96 de la firme Biorad. Le but de ce travail est de pouvoir déterminer si ce kit PCR de la firme ademtech, permet de détecter les différents agents pathogènes responsables de ces maladies, et également de pouvoir confirmer la suspicion de maladies pour établir un diagnostic. Concernant l’étude réalisée sur ce kit, les résultats obtenus sont concluants, tous les objectifs pour lesquels il a été évalué sont atteints. De manière générale, les outils de biologie moléculaire utilisés pour la recherche des infections fongiques permettent d’obtenir de bons résultats, leur développement reste un atout dans le diagnostic de ces pathologies. Note de contenu : Table des matières PRESENTATION DE L’ETABLISSEMENT ............................................................................................................. 7 INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................................................. 8 CONTEXTE GENERAL ....................................................................................................................................... 9 1. INFECTIONS A ASPERGILLUS SPP. ........................................................................................................... 9 1.1. ASPERGILLUS SPP. – GENERALITES ................................................................................................................ 9 1.2. L’ASPERGILLOSE – PATHOLOGIE ................................................................................................................. 10 1.3. ASPERGILLUS FUMIGATUS ......................................................................................................................... 12 1.4. DIAGNOSTIC DE L’ASPERGILLOSE ................................................................................................................. 14 1.4.1. Analyses par le laboratoire de microbiologie ................................................................................ 15 1.4.2. Biologie moléculaire ...................................................................................................................... 16 1.5. TRAITEMENTS CONTRE L’ASPERGILLOSE ........................................................................................................ 17 2. INFECTIONS AUX MUCORALES ............................................................................................................. 19 2.1. LES MUCORALES – GENERALITES ................................................................................................................ 19 2.2. LES MUCORMYCOSES – PATHOLOGIES ........................................................................................................ 20 2.2.1. Formes cliniques ............................................................................................................................ 20 2.3. DIAGNOSTIC DES MUCORMYCOSES .............................................................................................................. 21 2.3.1. Diagnostic radiologique ................................................................................................................. 22 2.3.2. Diagnostic microbiologique ........................................................................................................... 23 2.3.3. Diagnostic par Biologie moléculaire .............................................................................................. 25 2.4. TRAITEMENTS CONTRE LES MUCORMYCOSES ................................................................................................. 26 3. LA PCR EN TEMPS REEL ........................................................................................................................ 27 3.1. PRINCIPE ............................................................................................................................................... 27 3.2. METHODES DE DETECTION ........................................................................................................................ 27 3.2.1. Agent se liant à l’ADN double brin – SYBR Green 1 ....................................................................... 28 3.2.2. Sondes fluorescentes – Taqman .................................................................................................... 29 3.3. CYCLE SEUIL (TRESHOLD) .......................................................................................................................... 31 OBJECTIFS ET STRATEGIE ............................................................................................................................... 32 MATERIEL ET METHODES .............................................................................................................................. 33 1. MATERIEL ............................................................................................................................................ 33 1.1. ELITECH-ELITE INGENIUS ........................................................................................................................ 33 1.1.1. ELITech-ELITe InGenius – Présentation de l’automate .................................................................. 33 1.1.2. ELITech-ELITe InGenius – Structure de l’automate ........................................................................ 34 1.1.3. ELITech-ELITe InGenius – Extraction kit ELITe InGenius SP1000 .................................................... 35 1.1.4. ELITech-ELITe InGenius – ELITe InGenius SP200 Consumables Set ................................................ 37 1.2. BIORAD CFX96 – THERMOCYCLEUR ........................................................................................................... 37 1.3. ADEMTECH-MYCOGENIE® ASPERGILLUS SPECIES - MUCORALES SPECIES .......................................................... 38 1.3.1. Ademtech-MycoGENIE® - Présentation du kit ............................................................................... 38 1.3.2. Ademtech-MycoGENIE® - Principe du kit ....................................................................................... 39 1.3.3. Ademtech-MycoGENIE® - Protocole du kit .................................................................................... 39 1.3.4. Ademtech-MycoGENIE® - Validation et interprétation ................................................................. 40 1.4. ECHANTILLONS ....................................................................................................................................... 41 2. MÉTHODES .......................................................................................................................................... 43 2.1. PROTOCOLE – EXTRACTION D’ADN SUR ELITECH INGENIUS............................................................................ 43 2.1.1. Extraction à partir de cultures d’Aspergillus spp. et de Mucorales spp. ........................................ 43 2.1.2. Extraction à partir d’un sérum ou d’un LBA ................................................................................... 44 2.2. PROTOCOLE – PCR SETUP ET PCR .............................................................................................................. 45 RESULTATS ET DISCUSSION ........................................................................................................................... 46 1. ETUDE DE L’EXACTITUDE ...................................................................................................................... 46 1.1. EXACTITUDE – ASPERGILLUS ...................................................................................................................... 46 1.2. EXACTITUDE – MUCORALES ...................................................................................................................... 48 1.3. SPECIFICITE DE LA PCR – ASPERGILLUS ET MUCORALES .................................................................................. 49 2. ETUDE DE LA REPRODUCTIBILITE.......................................................................................................... 50 2.1. REPRODUCTIBILITE – ASPERGILLUS.............................................................................................................. 50 2.2. REPRODUCTIBILITE – MUCORALES .............................................................................................................. 52 3. ETUDE DE LA PERFORMANCE DE LA PCR .............................................................................................. 53 3.1. SENSIBILITE, SPECIFICITE, VPN ET VPP – ASPERGILLUS ................................................................................... 53 4. COMPARAISON DE METHODES ............................................................................................................ 55 CONCLUSION GENERALE ............................................................................................................................... 57 LISTE DES FIGURES ........................................................................................................................................ 59 LISTE DES TABLEAUX ..................................................................................................................................... 60 BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................................................. 61 ANNEXES ...................................................................................................................................................... 66 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=119420 Evaluation d’une méthode PCR pour la détection simultanée d’Aspergillus spp. et de Mucorales [TFE / Mémoire] / Hugo Dachet ; Isabel Montesinos Hernández María, Directeur de la recherche ; Nicolas Kesteman, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2024. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les champignons du genre Aspergillus spp. et ceux de l’ordre des Mucorales spp. sont des micro-organismes de l’environnement pouvant provoquer, chez les personnes immunodéprimées, différents types de pathologies en fonction de leur localisation, allant des pneumopathies à des infections fongiques invasives plus graves. Lorsque ces infections se développent chez ces personnes immunodéficientes, la prise en charge rapide avec un traitement adapté est essentielle dans le pronostic de guérison. En effet, les formes les plus graves de ces types de maladies peuvent devenir mortelles pour cette population à risque. Le diagnostic précoce permettra la mise en place d’un plan adapté à la situation. Malheureusement, ces agents pathogènes ne sont pas toujours les plus facile à mettre en évidence, et ce, en lien avec le fait que les techniques utilisées pour la réalisation de ce diagnostic prennent du temps. De nouvelles méthodes permettant d’obtenir une détection rapide des champignons, provenant de la biologie moléculaire (PCR), voient le jour. Ces techniques permettent d’obtenir un diagnostic fiable et plus rapide que certaines méthodes conventionnelles telles que la culture ou l’anatomopathologie. La réalisation de ce travail de fin d’études se base sur l’évaluation du kit de PCR en temps réel, MycoGENIE® Aspergillus species - Mucorales species, de la firme Ademtech.Une vérification complète de cette méthode est réalisée dans ce projet, elle reprend l’étude de plusieurs paramètres comme, l’exactitude, la reproductibilité, la performance de la méthode ou encore une comparaison avec un autre kit PCR. Ce projet utilise des prélèvements dont la majeure partie provient du CHU UCL Godinne, cette évaluation est réalisée à l’aide de plusieurs automates comprenant l’ELITech InGenius de la firme ELITech ainsi que le thermocycleur CFX96 de la firme Biorad. Le but de ce travail est de pouvoir déterminer si ce kit PCR de la firme ademtech, permet de détecter les différents agents pathogènes responsables de ces maladies, et également de pouvoir confirmer la suspicion de maladies pour établir un diagnostic. Concernant l’étude réalisée sur ce kit, les résultats obtenus sont concluants, tous les objectifs pour lesquels il a été évalué sont atteints. De manière générale, les outils de biologie moléculaire utilisés pour la recherche des infections fongiques permettent d’obtenir de bons résultats, leur développement reste un atout dans le diagnostic de ces pathologies. Note de contenu : Table des matières PRESENTATION DE L’ETABLISSEMENT ............................................................................................................. 7 INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................................................. 8 CONTEXTE GENERAL ....................................................................................................................................... 9 1. INFECTIONS A ASPERGILLUS SPP. ........................................................................................................... 9 1.1. ASPERGILLUS SPP. – GENERALITES ................................................................................................................ 9 1.2. L’ASPERGILLOSE – PATHOLOGIE ................................................................................................................. 10 1.3. ASPERGILLUS FUMIGATUS ......................................................................................................................... 12 1.4. DIAGNOSTIC DE L’ASPERGILLOSE ................................................................................................................. 14 1.4.1. Analyses par le laboratoire de microbiologie ................................................................................ 15 1.4.2. Biologie moléculaire ...................................................................................................................... 16 1.5. TRAITEMENTS CONTRE L’ASPERGILLOSE ........................................................................................................ 17 2. INFECTIONS AUX MUCORALES ............................................................................................................. 19 2.1. LES MUCORALES – GENERALITES ................................................................................................................ 19 2.2. LES MUCORMYCOSES – PATHOLOGIES ........................................................................................................ 20 2.2.1. Formes cliniques ............................................................................................................................ 20 2.3. DIAGNOSTIC DES MUCORMYCOSES .............................................................................................................. 21 2.3.1. Diagnostic radiologique ................................................................................................................. 22 2.3.2. Diagnostic microbiologique ........................................................................................................... 23 2.3.3. Diagnostic par Biologie moléculaire .............................................................................................. 25 2.4. TRAITEMENTS CONTRE LES MUCORMYCOSES ................................................................................................. 26 3. LA PCR EN TEMPS REEL ........................................................................................................................ 27 3.1. PRINCIPE ............................................................................................................................................... 27 3.2. METHODES DE DETECTION ........................................................................................................................ 27 3.2.1. Agent se liant à l’ADN double brin – SYBR Green 1 ....................................................................... 28 3.2.2. Sondes fluorescentes – Taqman .................................................................................................... 29 3.3. CYCLE SEUIL (TRESHOLD) .......................................................................................................................... 31 OBJECTIFS ET STRATEGIE ............................................................................................................................... 32 MATERIEL ET METHODES .............................................................................................................................. 33 1. MATERIEL ............................................................................................................................................ 33 1.1. ELITECH-ELITE INGENIUS ........................................................................................................................ 33 1.1.1. ELITech-ELITe InGenius – Présentation de l’automate .................................................................. 33 1.1.2. ELITech-ELITe InGenius – Structure de l’automate ........................................................................ 34 1.1.3. ELITech-ELITe InGenius – Extraction kit ELITe InGenius SP1000 .................................................... 35 1.1.4. ELITech-ELITe InGenius – ELITe InGenius SP200 Consumables Set ................................................ 37 1.2. BIORAD CFX96 – THERMOCYCLEUR ........................................................................................................... 37 1.3. ADEMTECH-MYCOGENIE® ASPERGILLUS SPECIES - MUCORALES SPECIES .......................................................... 38 1.3.1. Ademtech-MycoGENIE® - Présentation du kit ............................................................................... 38 1.3.2. Ademtech-MycoGENIE® - Principe du kit ....................................................................................... 39 1.3.3. Ademtech-MycoGENIE® - Protocole du kit .................................................................................... 39 1.3.4. Ademtech-MycoGENIE® - Validation et interprétation ................................................................. 40 1.4. ECHANTILLONS ....................................................................................................................................... 41 2. MÉTHODES .......................................................................................................................................... 43 2.1. PROTOCOLE – EXTRACTION D’ADN SUR ELITECH INGENIUS............................................................................ 43 2.1.1. Extraction à partir de cultures d’Aspergillus spp. et de Mucorales spp. ........................................ 43 2.1.2. Extraction à partir d’un sérum ou d’un LBA ................................................................................... 44 2.2. PROTOCOLE – PCR SETUP ET PCR .............................................................................................................. 45 RESULTATS ET DISCUSSION ........................................................................................................................... 46 1. ETUDE DE L’EXACTITUDE ...................................................................................................................... 46 1.1. EXACTITUDE – ASPERGILLUS ...................................................................................................................... 46 1.2. EXACTITUDE – MUCORALES ...................................................................................................................... 48 1.3. SPECIFICITE DE LA PCR – ASPERGILLUS ET MUCORALES .................................................................................. 49 2. ETUDE DE LA REPRODUCTIBILITE.......................................................................................................... 50 2.1. REPRODUCTIBILITE – ASPERGILLUS.............................................................................................................. 50 2.2. REPRODUCTIBILITE – MUCORALES .............................................................................................................. 52 3. ETUDE DE LA PERFORMANCE DE LA PCR .............................................................................................. 53 3.1. SENSIBILITE, SPECIFICITE, VPN ET VPP – ASPERGILLUS ................................................................................... 53 4. COMPARAISON DE METHODES ............................................................................................................ 55 CONCLUSION GENERALE ............................................................................................................................... 57 LISTE DES FIGURES ........................................................................................................................................ 59 LISTE DES TABLEAUX ..................................................................................................................................... 60 BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................................................. 61 ANNEXES ...................................................................................................................................................... 66 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=119420

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