Virus du Syndrome Dysgénésique et Respiratoire du Porc (SDRP) : Méthodes virologiques et sérologiques de détection et évaluation de l’échantillonnage d’air / Maxime Keller

Public ISBD Titre : Virus du Syndrome Dysgénésique et Respiratoire du Porc (SDRP) : Méthodes virologiques et sérologiques de détection et évaluation de l’échantillonnage d’air Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Maxime Keller, Auteur ; Jenny Pouyez, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie Année de publication : 2023 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Sciensano Index. décimale : TFE TA TFE Technologie animalière Résumé : Le virus du Syndrome Dysgénésique et Respiratoire Porcin est un Arterivirus qui est assez présent dans le cheptel porcin belge, européen et international. Ce virus enveloppé a un impact économique important qui est en partie dû à une protection non-optimale avec les vaccins utilisés car de nombreux animaux vaccinés ne répondent pas correctement au vaccin. De plus, le virus a une capacité d’évolution rapide et il existe une population génétiquement et antigéniquement hétérogène, ce qui pose problème lors de la lutte contre celui-ci. Deux génotypes principaux existent (génotypes Européen et Nord-Américain) et des différences existent entre ces deux derniers et notamment dans la virulence. L’objectif principal de ce travail était d’évaluer l’échantillonnage d’air effectué avec l’appareil Coriolis® micro (de Bertin Technologies). Cet échantillonneur cyclonique a été utilisé pour évaluer la présence du virus PRRSv dans les loges de porcelets (préalablement infectés avec le virus PRRS) au centre expérimental de Machelen. Grâce à son liquide de collection polyvalent et son grand débit de filtration, le Coriolis permet de détecter toute sorte de microorganismes dont les bactéries, champignons et virus. Pour le traitement des échantillons récoltés avec le Coriolis, une étape de préparation des échantillons grâce aux tubes AMICON et une étape d’extraction seront nécessaires afin de pouvoir détecter la présence du virus PRRS grâce à une RT-PCR en temps réel. Si les résultats sont concluants pour les échantillons prélevés dans les loges des porcelets, l’appareil Coriolis pourra être utilisé par les éleveurs pour relever la présence du virus dans leur élevage porcin. Malheureusement, suite à la RT-PCR, les échantillons d’air des loges des porcelets se sont révélés en majorité négatifs et seuls quelques-uns épars se sont révélés positifs mais avec des valeurs de concentration virales assez basses. Une modification du protocole devra donc être envisagée et d’autres tests devront être effectués. Ensuite, le PRRSv peut être détecté par des méthodes de détection moléculaires (comme la RT-PCR en temps réel), virologiques (isolement sur macrophages alvéolaires pulmonaires porcins) et sérologiques (tests ELISA et test de séroneutralisation), ainsi que la préparation de cellules sanguines pour l’évaluation de la réponse immunitaire face au virus. Ces méthodes sont couramment utilisées en laboratoire afin de diagnostiquer une infection au virus PRRS. La RT-PCR en temps réel permet d’amplifier une séquence d’ARN viral en un grand nombre de fois pour en déterminer la concentration initiale, présente dans l’échantillon. La technique de l’isolement viral permet de mettre en évidence la présence du virus en observant si des effets cytopathogènes sont présents sur des cellules spécifiques après avoir mis en contact ces cellules et un échantillon. Les tests ELISA et de séroneutralisation permettent d’examiner la présence du virus à partir de sérum en mettant en évidence la présence de protéines immunitaires soit des interférons ou des anticorps. A partir de sang complet, il est possible d’isoler des cellules spécifiques, les cellules mononucléaires du sang périphérique. Ce type de cellules, qui est un des seuls à pouvoir supporter la multiplication du virus, va pouvoir être mis en contact avec des stimuli antigéniques. Si ces cellules ont déjà rencontré le virus, elles sauront produire des anticorps et ceux-ci seront alors mis en évidence grâce à une réaction immuno-enzymatique (comme les tests sérologiques). En conclusion, de plus amples études sur le virus PRRS devront être envisagées pour mieux comprendre ces mécanismes d’infection et ainsi pouvoir contrôler sa propagation car une meilleure connaissance du virus permettra de gérer au mieux son impact sur l’élevage porcin dans le monde entier. Note de contenu : Table des matières REMERCIEMENTS ....................................................................................................................... 4 INTRODUCTION GENERALE ET PRESENTATION DU LIEU DE STAGE........................................... 6 1. CONTEXTE : LE VIRUS DU SYNDROME DYSGÉNÉSIQUE ET RESPIRATOIRE PORCIN .............. 7 1.1. Caractéristiques morphologiques du virus ..................................................................... 8 1.2. Transmission virale ........................................................................................................ 10 1.3. Pathogénie .................................................................................................................... 11 1.4. Détection de la présence du virus ................................................................................. 12 1.5. Prévention et protection contre le PRRSv..................................................................... 13 2. OBJECTIFS ET STRATÉGIES ................................................................................................... 14 3. ECHANTILLONNAGE D’AIR – CORIOLIS ................................................................................ 15 3.1. Conditions d’hébergement ........................................................................................... 15 3.2. Coriolis – Principe : ........................................................................................................ 18 3.2.1. Avantages : ......................................................................................................... 18 3.2.2. Inconvénients : ................................................................................................... 19 3.2.3. Fonctionnement : ............................................................................................... 20 3.3. Echantillonnage : ........................................................................................................... 21 3.3.1. Jour 0 (15 février 2023) ...................................................................................... 21 3.3.2. Jour 3 (18 février 2023) ...................................................................................... 23 3.3.3. Jour 5 (20 février 2023) et jour 7 (22 février 2023) ........................................... 24 3.3.4. Jour 10 (25 février 2023) .................................................................................... 24 3.3.5. Jour 14 (1er mars 2023) et jour 21 (8 mars 2023) .............................................. 25 3.3.6. Mise en place pratique de l’échantillonnage à Machelen ................................. 25 3.4. Analyses au laboratoire : préparation des échantillons et RT-PCR en temps réel ....... 28 3.4.1. Préparation des échantillons d’air en vue d’une PCR ........................................ 29 3.4.2. Préparation des culots de poussières en vue d’une PCR ................................... 30 3.4.3. Extraction d’ARN avant PCR ............................................................................... 31 3.4.4. Cycle de RT-PCR en temps réel .......................................................................... 34 3.5. Résultats et discussion : ................................................................................................ 40 4. MÉTHODES DE DÉTECTION DU VIRUS PRRS ........................................................................ 45 4.1. Méthodes de détection moléculaire par RT-PCR quantitative ..................................... 45 4.2. Méthodes de détection virologique par isolement viral sur PAM ................................ 46 4.3. Méthodes de détection sérologique ............................................................................. 47 4.3.1. Tests ELISA .......................................................................................................... 47 4.3.2. Test de neutralisation virale (SN) ....................................................................... 49 4.4. Méthodes de détection immunologique : Isolement des PBMC pour stimulation antigénique (ELISPOT) .................................................................................................. 50 CONCLUSION ............................................................................................................................ 54 GLOSSAIRE ................................................................................................................................ 55 LISTE DES ABREVIATIONS ......................................................................................................... 56 BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................................................... 58 ANNEXES................................................................................................................................... 69 RESUME .................................................................................................................................... 78 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=112636 Virus du Syndrome Dysgénésique et Respiratoire du Porc (SDRP) : Méthodes virologiques et sérologiques de détection et évaluation de l’échantillonnage d’air [TFE / Mémoire] / Maxime Keller, Auteur ; Jenny Pouyez, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie, 2023. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Sciensano Index. décimale : TFE TA TFE Technologie animalière Résumé : Le virus du Syndrome Dysgénésique et Respiratoire Porcin est un Arterivirus qui est assez présent dans le cheptel porcin belge, européen et international. Ce virus enveloppé a un impact économique important qui est en partie dû à une protection non-optimale avec les vaccins utilisés car de nombreux animaux vaccinés ne répondent pas correctement au vaccin. De plus, le virus a une capacité d’évolution rapide et il existe une population génétiquement et antigéniquement hétérogène, ce qui pose problème lors de la lutte contre celui-ci. Deux génotypes principaux existent (génotypes Européen et Nord-Américain) et des différences existent entre ces deux derniers et notamment dans la virulence. L’objectif principal de ce travail était d’évaluer l’échantillonnage d’air effectué avec l’appareil Coriolis® micro (de Bertin Technologies). Cet échantillonneur cyclonique a été utilisé pour évaluer la présence du virus PRRSv dans les loges de porcelets (préalablement infectés avec le virus PRRS) au centre expérimental de Machelen. Grâce à son liquide de collection polyvalent et son grand débit de filtration, le Coriolis permet de détecter toute sorte de microorganismes dont les bactéries, champignons et virus. Pour le traitement des échantillons récoltés avec le Coriolis, une étape de préparation des échantillons grâce aux tubes AMICON et une étape d’extraction seront nécessaires afin de pouvoir détecter la présence du virus PRRS grâce à une RT-PCR en temps réel. Si les résultats sont concluants pour les échantillons prélevés dans les loges des porcelets, l’appareil Coriolis pourra être utilisé par les éleveurs pour relever la présence du virus dans leur élevage porcin. Malheureusement, suite à la RT-PCR, les échantillons d’air des loges des porcelets se sont révélés en majorité négatifs et seuls quelques-uns épars se sont révélés positifs mais avec des valeurs de concentration virales assez basses. Une modification du protocole devra donc être envisagée et d’autres tests devront être effectués. Ensuite, le PRRSv peut être détecté par des méthodes de détection moléculaires (comme la RT-PCR en temps réel), virologiques (isolement sur macrophages alvéolaires pulmonaires porcins) et sérologiques (tests ELISA et test de séroneutralisation), ainsi que la préparation de cellules sanguines pour l’évaluation de la réponse immunitaire face au virus. Ces méthodes sont couramment utilisées en laboratoire afin de diagnostiquer une infection au virus PRRS. La RT-PCR en temps réel permet d’amplifier une séquence d’ARN viral en un grand nombre de fois pour en déterminer la concentration initiale, présente dans l’échantillon. La technique de l’isolement viral permet de mettre en évidence la présence du virus en observant si des effets cytopathogènes sont présents sur des cellules spécifiques après avoir mis en contact ces cellules et un échantillon. Les tests ELISA et de séroneutralisation permettent d’examiner la présence du virus à partir de sérum en mettant en évidence la présence de protéines immunitaires soit des interférons ou des anticorps. A partir de sang complet, il est possible d’isoler des cellules spécifiques, les cellules mononucléaires du sang périphérique. Ce type de cellules, qui est un des seuls à pouvoir supporter la multiplication du virus, va pouvoir être mis en contact avec des stimuli antigéniques. Si ces cellules ont déjà rencontré le virus, elles sauront produire des anticorps et ceux-ci seront alors mis en évidence grâce à une réaction immuno-enzymatique (comme les tests sérologiques). En conclusion, de plus amples études sur le virus PRRS devront être envisagées pour mieux comprendre ces mécanismes d’infection et ainsi pouvoir contrôler sa propagation car une meilleure connaissance du virus permettra de gérer au mieux son impact sur l’élevage porcin dans le monde entier. Note de contenu : Table des matières REMERCIEMENTS ....................................................................................................................... 4 INTRODUCTION GENERALE ET PRESENTATION DU LIEU DE STAGE........................................... 6 1. CONTEXTE : LE VIRUS DU SYNDROME DYSGÉNÉSIQUE ET RESPIRATOIRE PORCIN .............. 7 1.1. Caractéristiques morphologiques du virus ..................................................................... 8 1.2. Transmission virale ........................................................................................................ 10 1.3. Pathogénie .................................................................................................................... 11 1.4. Détection de la présence du virus ................................................................................. 12 1.5. Prévention et protection contre le PRRSv..................................................................... 13 2. OBJECTIFS ET STRATÉGIES ................................................................................................... 14 3. ECHANTILLONNAGE D’AIR – CORIOLIS ................................................................................ 15 3.1. Conditions d’hébergement ........................................................................................... 15 3.2. Coriolis – Principe : ........................................................................................................ 18 3.2.1. Avantages : ......................................................................................................... 18 3.2.2. Inconvénients : ................................................................................................... 19 3.2.3. Fonctionnement : ............................................................................................... 20 3.3. Echantillonnage : ........................................................................................................... 21 3.3.1. Jour 0 (15 février 2023) ...................................................................................... 21 3.3.2. Jour 3 (18 février 2023) ...................................................................................... 23 3.3.3. Jour 5 (20 février 2023) et jour 7 (22 février 2023) ........................................... 24 3.3.4. Jour 10 (25 février 2023) .................................................................................... 24 3.3.5. Jour 14 (1er mars 2023) et jour 21 (8 mars 2023) .............................................. 25 3.3.6. Mise en place pratique de l’échantillonnage à Machelen ................................. 25 3.4. Analyses au laboratoire : préparation des échantillons et RT-PCR en temps réel ....... 28 3.4.1. Préparation des échantillons d’air en vue d’une PCR ........................................ 29 3.4.2. Préparation des culots de poussières en vue d’une PCR ................................... 30 3.4.3. Extraction d’ARN avant PCR ............................................................................... 31 3.4.4. Cycle de RT-PCR en temps réel .......................................................................... 34 3.5. Résultats et discussion : ................................................................................................ 40 4. MÉTHODES DE DÉTECTION DU VIRUS PRRS ........................................................................ 45 4.1. Méthodes de détection moléculaire par RT-PCR quantitative ..................................... 45 4.2. Méthodes de détection virologique par isolement viral sur PAM ................................ 46 4.3. Méthodes de détection sérologique ............................................................................. 47 4.3.1. Tests ELISA .......................................................................................................... 47 4.3.2. Test de neutralisation virale (SN) ....................................................................... 49 4.4. Méthodes de détection immunologique : Isolement des PBMC pour stimulation antigénique (ELISPOT) .................................................................................................. 50 CONCLUSION ............................................................................................................................ 54 GLOSSAIRE ................................................................................................................................ 55 LISTE DES ABREVIATIONS ......................................................................................................... 56 BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................................................... 58 ANNEXES................................................................................................................................... 69 RESUME .................................................................................................................................... 78 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=112636

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