Les infections virales respiratoires en début de vie : Suivi de l'infection et de la vaccination et impact de la supplémentation maternelle en probiotiques / Zoé Leloup

Public ISBD Titre : Les infections virales respiratoires en début de vie : Suivi de l'infection et de la vaccination et impact de la supplémentation maternelle en probiotiques Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Zoé Leloup ; Véronique Flamand, Promoteur du mémoire ; Manuel Constant, Promoteur du mémoire Editeur : Montignies-sur-Sambre : Haute Ecole Louvain en Hainaut Année de publication : 2023 Importance : 67p. Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur . Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Au cours des premiers stades de la vie d'un nouveau-né, son système immunitaire est en plein développement. Les protections fournies par la mère, que ce soit à travers le placenta ou l'allaitement, commencent à diminuer, et la capacité de défense du nouveau-né n'est pas encore pleinement développée. Le premier objectif de ce travail de fin d'études est de mettre au point un modèle d'infection des nouveau-nés murins par le Pneumovirus et d'étudier les effets de la supplémentation maternelle en probiotiques (Lactobacillus rhamnosus et Bifidobacterium lactis) sur les nouveau-nés infectés. Pour ce faire, nous mesurons la charge virale dans les poumons des nouveau-nés prélevés à l'aide de la technique de RT-qPCR. Cependant, les résultats obtenus ne sont pas conformes à nos attentes. En effet, les deux souches de probiotiques ont des effets opposés : l'une augmente la charge virale dans les poumons, tandis que l'autre la diminue. Pour de futures expériences, il serait intéressant d'adapter le modèle afin de mesurer la charge virale dans le nez des nouveau-nés infectés plutôt que dans les poumons. Le deuxième objectif de notre étude est de développer un vaccin à partir d'une protéine de l'Influenza virus A, connue sous le nom d'hémagglutinine. Nous souhaitons comparer la réponse humorale induite par ce vaccin "maison" avec celle obtenue par la vaccination avec le vaccin commercial VaxigripTetra®. Afin de réaliser cette comparaison, nous avons mis au point un test ELISA pour doser les immunoglobulines (IgG1 et Ig totales) présentes dans le sérum des souris vaccinées avec l'un des deux vaccins. Cependant, la comparaison s'avère complexe. En raison des difficultés liées à l'établissement d'un standard commun pour les deux types d'immunoglobulines, seules les IgG1 ont été dosées pour le vaccin "maison", tandis que les Ig totales ont été mesurées pour VaxigripTetra®. Dans de futures expériences, la mise en place d'un standard adéquat permettra de doser les Ig totales dans le sérum des souris vaccinées avec le vaccin "maison". Ces résultats initiaux soulignent l'importance de poursuivre les recherches pour améliorer notre compréhension des mécanismes d'infection et de protection immunitaire chez les nouveau-nés. Les ajustements et les nouvelles stratégies développées dans le cadre de ce travail offrent des perspectives passionnantes pour la prévention et le traitement des infections respiratoires chez les nourrissons Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=114754 Les infections virales respiratoires en début de vie : Suivi de l'infection et de la vaccination et impact de la supplémentation maternelle en probiotiques [TFE / Mémoire] / Zoé Leloup ; Véronique Flamand, Promoteur du mémoire ; Manuel Constant, Promoteur du mémoire . - Montignies-sur-Sambre : Haute Ecole Louvain en Hainaut, 2023 . - 67p. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur . Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Au cours des premiers stades de la vie d'un nouveau-né, son système immunitaire est en plein développement. Les protections fournies par la mère, que ce soit à travers le placenta ou l'allaitement, commencent à diminuer, et la capacité de défense du nouveau-né n'est pas encore pleinement développée. Le premier objectif de ce travail de fin d'études est de mettre au point un modèle d'infection des nouveau-nés murins par le Pneumovirus et d'étudier les effets de la supplémentation maternelle en probiotiques (Lactobacillus rhamnosus et Bifidobacterium lactis) sur les nouveau-nés infectés. Pour ce faire, nous mesurons la charge virale dans les poumons des nouveau-nés prélevés à l'aide de la technique de RT-qPCR. Cependant, les résultats obtenus ne sont pas conformes à nos attentes. En effet, les deux souches de probiotiques ont des effets opposés : l'une augmente la charge virale dans les poumons, tandis que l'autre la diminue. Pour de futures expériences, il serait intéressant d'adapter le modèle afin de mesurer la charge virale dans le nez des nouveau-nés infectés plutôt que dans les poumons. Le deuxième objectif de notre étude est de développer un vaccin à partir d'une protéine de l'Influenza virus A, connue sous le nom d'hémagglutinine. Nous souhaitons comparer la réponse humorale induite par ce vaccin "maison" avec celle obtenue par la vaccination avec le vaccin commercial VaxigripTetra®. Afin de réaliser cette comparaison, nous avons mis au point un test ELISA pour doser les immunoglobulines (IgG1 et Ig totales) présentes dans le sérum des souris vaccinées avec l'un des deux vaccins. Cependant, la comparaison s'avère complexe. En raison des difficultés liées à l'établissement d'un standard commun pour les deux types d'immunoglobulines, seules les IgG1 ont été dosées pour le vaccin "maison", tandis que les Ig totales ont été mesurées pour VaxigripTetra®. Dans de futures expériences, la mise en place d'un standard adéquat permettra de doser les Ig totales dans le sérum des souris vaccinées avec le vaccin "maison". Ces résultats initiaux soulignent l'importance de poursuivre les recherches pour améliorer notre compréhension des mécanismes d'infection et de protection immunitaire chez les nouveau-nés. Les ajustements et les nouvelles stratégies développées dans le cadre de ce travail offrent des perspectives passionnantes pour la prévention et le traitement des infections respiratoires chez les nourrissons Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=114754

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Optimiser la détection du Streptococcus pyogenes : évaluation du nouveau milieu chromogène « CHROMagarTM StrepA » / Koukab Mahrous

Public ISBD Titre : Optimiser la détection du Streptococcus pyogenes : évaluation du nouveau milieu chromogène « CHROMagarTM StrepA » Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Koukab Mahrous ; Françoise Motte, Directeur de la recherche ; Manuel Constant, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2024 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : L’objectif de cette étude est d’évaluer le milieu chromogène CHROMagar™ StrepA pour la détection du Streptococcus pyogenes (SGA), une bactérie pathogène majeure qui produit plusieurs facteurs de virulence et est responsable d’un large éventail d’infections, allant de la pharyngite à des maladies plus sévères comme les infections invasives. Une identification rapide et précise de cette bactérie est essentielle pour un traitement rapide et efficace. Cette étude a comparé la performance du CHROMagar™ StrepA avec des méthodes de culture traditionnelles (milieu COL-S) et des tests rapides (OSOM® Strep A Test). Le CHROMagar™ StrepA utilise la méthode chromogène pour différencier les souches de streptocoques pathogènes facilitant ainsi l’identification visuelle des colonies. L’étude s’est déroulée en trois étapes distinctes. La première étape était l’analyse du milieu chromogène en utilisant des souches pures d’identification connues. La deuxième étape consistait à comparer le milieu chromogène à la méthode classique utilisée. Enfin, la troisième étape était l’intégration du milieu chromogène dans la routine pour tous les frottis de gorge reçus au laboratoire. Les résultats indiquent que le CHROMagar™ StrepA offre une sensibilité, une spécificité, une valeur prédictive positive (VPP) et une valeur prédictive négative (VPN) de 100%, démontrant une grande fiabilité pour la détection du SGA. De plus, l’étude a montré une concordance totale entre les méthodes traditionnelles et le milieu chromogène pour l’identification des streptocoques du groupe A. Cependant, certains isolats, comme le Streptococcus dysgalactiae, ont montré des résultats faussement négatifs, révélant une sensibilité réduite pour ces souches. De plus, le milieu n’a pas réussi à différencier tous les pathogènes de la gorge, comme Streptococcus constellatus et Streptococcus anginosus, indiquant des limitations dans certaines conditions cliniques. En conclusion, le milieu chromogène CHROMagar™ StrepA offre une alternative efficace aux méthodes traditionnelles pour la détection de Streptococcus pyogenes, avec des avantages notables en termes de spécificité et de simplicité d’interprétation. Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE ..............................................................................................5 INTRODUCTION ..........................................................................................................................6 CONTEXTE THÉORIQUE ...............................................................................................................7 Streptocoque du groupe A .................................................................................................................. 7 1 Propriétés bactériologiques ............................................................................................................................. 7 2 Propriétés biochimiques .................................................................................................................................. 8 3 Structure antigénique et facteurs de virulence ............................................................................................... 9 4 Écologie - Rôle pathogène – Épidémiologie ................................................................................................... 12 4.1 Les Infections suppurées ...................................................................................................................... 13 4.1.1 L’angine et la pharyngite .................................................................................................................. 13 4.1.2 La cellulite cutanée .......................................................................................................................... 14 4.2 Manifestations toxiniques .................................................................................................................... 15 4.2.1 La scarlatine ..................................................................................................................................... 15 4.2.2 Le syndrome de choc toxique streptococcique ............................................................................... 16 4.3 Complications post-streptococciques .................................................................................................. 17 4.3.1 Le rhumatisme articulaire aigu (RAA) .............................................................................................. 17 5 Traitement ..................................................................................................................................................... 18 6 Méthodes classiques de détection du Streptocoque A ................................................................................. 18 6.1 Le type d’hémolyse .............................................................................................................................. 18 6.2 Le test rapide d'agglutination au latex « PASTOREX® Strep » .............................................................. 19 6.3 Le test rapide antigénique « OSOM® Strep A » .................................................................................... 21 6.4 Polymerase chain reaction (PCR) ......................................................................................................... 22 OBJECTIFS ET STRATÉGIES ......................................................................................................... 23 1 Matériel et méthodes .................................................................................................................................... 23 1.1 Matériel ................................................................................................................................................ 23 1.2 Méthodes ............................................................................................................................................. 24 1.2.1 Mise en évidence des streptocoques pathogènes sur le milieu chromogène ................................. 24 1.2.2 La composition du milieu CHROMagar™ StrepA ............................................................................. 26 1.2.3 L’aspect des colonies sur le milieu chromogène « CHROMagar™ StrepA » ..................................... 26 2 Résultats et discussion ................................................................................................................................... 27 2.1 Population étudiée ............................................................................................................................... 27 2.2 Phase 1 ................................................................................................................................................. 29 2.3 Phase 2 ................................................................................................................................................. 33 2.4 Phase 2 et 3 .......................................................................................................................................... 36 2.4.1 Comparaison entre les méthodes de routine et le milieu chromogène pour l’identification des bactéries pathogènes du genre Streptococcus .............................................................................................. 36 ➢ Comparaison entre le milieu chromogène StrepA et le milieu COL-S pour une population de 101 individus : .................................................................................................................................................. 36 ➢ Comparaison entre le milieu chromogène StrepA et le milieu COL-S ainsi que le test rapide Strep A pour une population de 81 individus : ...................................................................................................... 38 2.4.2 Évaluation de la capacité du milieu chromogène StrepA pour la culture de différentes espèces de Streptocoques ................................................................................................................................................ 40 2.4.3 Comparaison des germes identifiés dans le frottis de gorge et épidémiologie des deux dernières années 45 CONCLUSION ............................................................................................................................ 48 BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................ 49 ANNEXES.................................................................................................................................. 53 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=119416 Optimiser la détection du Streptococcus pyogenes : évaluation du nouveau milieu chromogène « CHROMagarTM StrepA » [TFE / Mémoire] / Koukab Mahrous ; Françoise Motte, Directeur de la recherche ; Manuel Constant, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2024. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : L’objectif de cette étude est d’évaluer le milieu chromogène CHROMagar™ StrepA pour la détection du Streptococcus pyogenes (SGA), une bactérie pathogène majeure qui produit plusieurs facteurs de virulence et est responsable d’un large éventail d’infections, allant de la pharyngite à des maladies plus sévères comme les infections invasives. Une identification rapide et précise de cette bactérie est essentielle pour un traitement rapide et efficace. Cette étude a comparé la performance du CHROMagar™ StrepA avec des méthodes de culture traditionnelles (milieu COL-S) et des tests rapides (OSOM® Strep A Test). Le CHROMagar™ StrepA utilise la méthode chromogène pour différencier les souches de streptocoques pathogènes facilitant ainsi l’identification visuelle des colonies. L’étude s’est déroulée en trois étapes distinctes. La première étape était l’analyse du milieu chromogène en utilisant des souches pures d’identification connues. La deuxième étape consistait à comparer le milieu chromogène à la méthode classique utilisée. Enfin, la troisième étape était l’intégration du milieu chromogène dans la routine pour tous les frottis de gorge reçus au laboratoire. Les résultats indiquent que le CHROMagar™ StrepA offre une sensibilité, une spécificité, une valeur prédictive positive (VPP) et une valeur prédictive négative (VPN) de 100%, démontrant une grande fiabilité pour la détection du SGA. De plus, l’étude a montré une concordance totale entre les méthodes traditionnelles et le milieu chromogène pour l’identification des streptocoques du groupe A. Cependant, certains isolats, comme le Streptococcus dysgalactiae, ont montré des résultats faussement négatifs, révélant une sensibilité réduite pour ces souches. De plus, le milieu n’a pas réussi à différencier tous les pathogènes de la gorge, comme Streptococcus constellatus et Streptococcus anginosus, indiquant des limitations dans certaines conditions cliniques. En conclusion, le milieu chromogène CHROMagar™ StrepA offre une alternative efficace aux méthodes traditionnelles pour la détection de Streptococcus pyogenes, avec des avantages notables en termes de spécificité et de simplicité d’interprétation. Note de contenu : TABLE DES MATIÈRES PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE ..............................................................................................5 INTRODUCTION ..........................................................................................................................6 CONTEXTE THÉORIQUE ...............................................................................................................7 Streptocoque du groupe A .................................................................................................................. 7 1 Propriétés bactériologiques ............................................................................................................................. 7 2 Propriétés biochimiques .................................................................................................................................. 8 3 Structure antigénique et facteurs de virulence ............................................................................................... 9 4 Écologie - Rôle pathogène – Épidémiologie ................................................................................................... 12 4.1 Les Infections suppurées ...................................................................................................................... 13 4.1.1 L’angine et la pharyngite .................................................................................................................. 13 4.1.2 La cellulite cutanée .......................................................................................................................... 14 4.2 Manifestations toxiniques .................................................................................................................... 15 4.2.1 La scarlatine ..................................................................................................................................... 15 4.2.2 Le syndrome de choc toxique streptococcique ............................................................................... 16 4.3 Complications post-streptococciques .................................................................................................. 17 4.3.1 Le rhumatisme articulaire aigu (RAA) .............................................................................................. 17 5 Traitement ..................................................................................................................................................... 18 6 Méthodes classiques de détection du Streptocoque A ................................................................................. 18 6.1 Le type d’hémolyse .............................................................................................................................. 18 6.2 Le test rapide d'agglutination au latex « PASTOREX® Strep » .............................................................. 19 6.3 Le test rapide antigénique « OSOM® Strep A » .................................................................................... 21 6.4 Polymerase chain reaction (PCR) ......................................................................................................... 22 OBJECTIFS ET STRATÉGIES ......................................................................................................... 23 1 Matériel et méthodes .................................................................................................................................... 23 1.1 Matériel ................................................................................................................................................ 23 1.2 Méthodes ............................................................................................................................................. 24 1.2.1 Mise en évidence des streptocoques pathogènes sur le milieu chromogène ................................. 24 1.2.2 La composition du milieu CHROMagar™ StrepA ............................................................................. 26 1.2.3 L’aspect des colonies sur le milieu chromogène « CHROMagar™ StrepA » ..................................... 26 2 Résultats et discussion ................................................................................................................................... 27 2.1 Population étudiée ............................................................................................................................... 27 2.2 Phase 1 ................................................................................................................................................. 29 2.3 Phase 2 ................................................................................................................................................. 33 2.4 Phase 2 et 3 .......................................................................................................................................... 36 2.4.1 Comparaison entre les méthodes de routine et le milieu chromogène pour l’identification des bactéries pathogènes du genre Streptococcus .............................................................................................. 36 ➢ Comparaison entre le milieu chromogène StrepA et le milieu COL-S pour une population de 101 individus : .................................................................................................................................................. 36 ➢ Comparaison entre le milieu chromogène StrepA et le milieu COL-S ainsi que le test rapide Strep A pour une population de 81 individus : ...................................................................................................... 38 2.4.2 Évaluation de la capacité du milieu chromogène StrepA pour la culture de différentes espèces de Streptocoques ................................................................................................................................................ 40 2.4.3 Comparaison des germes identifiés dans le frottis de gorge et épidémiologie des deux dernières années 45 CONCLUSION ............................................................................................................................ 48 BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................ 49 ANNEXES.................................................................................................................................. 53 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=119416

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Séquençage et qPCR : comparaison de deux méthodes pour le développement et l’optimisation de tests génétiques / Maxime Kerff

Public ISBD Titre : Séquençage et qPCR : comparaison de deux méthodes pour le développement et l’optimisation de tests génétiques Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Maxime Kerff, Auteur ; Manuel Constant, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie Année de publication : 2023 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Progenus Index. décimale : TFE TA TFE Technologie animalière Résumé : Le séquençage capillaire et la PCR quantitative (qPCR) sont deux méthodes utilisées au sein du laboratoire Progenus de Gembloux pour dépister des mutations génétiques. Dans le cadre de ce TFE, ces deux méthodes sont comparées à travers le développement d’un test par séquençage et l’optimisation d’un autre test par qPCR. Le premier test vise à dépister une mutation chez le Maine Coon causant des troubles de la coagulation. De nombreuses étapes sont nécessaires pour parvenir à développer un test efficace avec la méthode du séquençage. Chacune d’entre elles est importante pour vérifier la bonne amplification du gène concerné, sa purification et enfin son séquençage afin d’analyser la séquence obtenue et rendre un verdict quant à l’état génétique de l’animal : sain, porteur ou atteint par la pathologie causée. Les réactifs nécessaires étant utilisés pour d’autres tests, la mise en place d’un développement par cette méthode représente un coût moindre pour l’entreprise. L’optimisation d’un test au moyen de la qPCR est, quant à elle, beaucoup plus rapide. Le gène pour lequel un test est optimisé est ICHGR, un gène présent chez le Golden Retriever qui, lorsqu’il est défectueux, peut occasionner des problèmes d’ordre cutané. La qPCR apportant des résultats interprétables en moins de deux heures, elle semble idéale pour le dépistage d’échantillons. Le point noir de cette méthode réside dans le coût élevé de ses réactifs, principalement les sondes nécessaires à la récupération d’un signal faisant office de résultats. Entre un temps d’attente plus long, mais un faible coût et une rapidité contrebalancée par un coût élevé, il peut être difficile de choisir. Il est donc important d’adapter le choix de la méthode à la réalité du terrain. Un séquençage peut s’effectuer sur des petites quantités d’échantillons demandant la même analyse puisque cette méthode, paraissant longue, possède de nombreux temps d’attente pouvant être utilisé pour réaliser des tâches annexes. De plus, son faible coût est un argument de poids pour l’entreprise. La seconde méthode d’analyse, elle, est plutôt réservée aux analyses reprenant un nombre conséquent d’échantillons pouvant aller jusqu’à plusieurs centaines. Ainsi, le coût important des réactifs sera équilibré par un nombre de résultats également élevé. La somme récupérée auprès des clients rapidement satisfaits remboursera ainsi les frais occasionnés. Ainsi, ce TFE présente en détails le déroulé des tests développés et optimisés à l’aide de ces méthodes ainsi que leurs caractéristiques, avantages et inconvénients respectifs. Note de contenu : Table des matières Introduction ...........................................................................................................................7 Contexte .............................................................................................................................7 Notions théoriques .............................................................................................................8 Composition de l’ADN .....................................................................................................8 Modifications de l’ADN .................................................................................................10 Polymer Chain Reaction « PCR » ...................................................................................11 PCR en temps réel « qPCR » ..........................................................................................13 Séquençage par la méthode de Sanger sur capillaire ....................................................16 Electrophorèse sur gel d’agarose ..................................................................................18 Matériel et méthodes ...........................................................................................................20 Extraction de l’ADN d’un échantillon ................................................................................20 Matériel ........................................................................................................................20 Protocole pour les échantillons sanguins ......................................................................20 Protocole pour les écouvillons salivaires .......................................................................21 Préparation de l’échantillon pour la PCR ...........................................................................21 Matériel ........................................................................................................................21 Protocole ......................................................................................................................22 Polymer Chain Reaction (PCR) ..........................................................................................22 Matériel ........................................................................................................................22 Protocole ......................................................................................................................22 Préparation d’un gel d’agarose .........................................................................................22 Matériel ........................................................................................................................22 Protocole ......................................................................................................................23 Purification de bandes de gel d’agarose ............................................................................24 Matériel ........................................................................................................................24 Protocole ......................................................................................................................24 Quantification d’ADN présent dans les échantillons ..........................................................24 Matériel ........................................................................................................................25 Protocole ......................................................................................................................25 Séquençage ......................................................................................................................25 Résultats et discussion..........................................................................................................26 Développement du test F11 par PCR et séquençage sur capillaire ....................................26 6 Optimisation du test ICHGR par la qPCR ...........................................................................34 Comparaison des méthodes .............................................................................................42 Réactifs .........................................................................................................................42 Méthode d’analyse .......................................................................................................42 Spécificités ....................................................................................................................43 Sensibilité .....................................................................................................................43 Temps ...........................................................................................................................44 Coût financier ...............................................................................................................44 Applications ..................................................................................................................44 Conclusion ............................................................................................................................45 Bibliographie ........................................................................................................................47 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=112610 Séquençage et qPCR : comparaison de deux méthodes pour le développement et l’optimisation de tests génétiques [TFE / Mémoire] / Maxime Kerff, Auteur ; Manuel Constant, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie, 2023. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Progenus Index. décimale : TFE TA TFE Technologie animalière Résumé : Le séquençage capillaire et la PCR quantitative (qPCR) sont deux méthodes utilisées au sein du laboratoire Progenus de Gembloux pour dépister des mutations génétiques. Dans le cadre de ce TFE, ces deux méthodes sont comparées à travers le développement d’un test par séquençage et l’optimisation d’un autre test par qPCR. Le premier test vise à dépister une mutation chez le Maine Coon causant des troubles de la coagulation. De nombreuses étapes sont nécessaires pour parvenir à développer un test efficace avec la méthode du séquençage. Chacune d’entre elles est importante pour vérifier la bonne amplification du gène concerné, sa purification et enfin son séquençage afin d’analyser la séquence obtenue et rendre un verdict quant à l’état génétique de l’animal : sain, porteur ou atteint par la pathologie causée. Les réactifs nécessaires étant utilisés pour d’autres tests, la mise en place d’un développement par cette méthode représente un coût moindre pour l’entreprise. L’optimisation d’un test au moyen de la qPCR est, quant à elle, beaucoup plus rapide. Le gène pour lequel un test est optimisé est ICHGR, un gène présent chez le Golden Retriever qui, lorsqu’il est défectueux, peut occasionner des problèmes d’ordre cutané. La qPCR apportant des résultats interprétables en moins de deux heures, elle semble idéale pour le dépistage d’échantillons. Le point noir de cette méthode réside dans le coût élevé de ses réactifs, principalement les sondes nécessaires à la récupération d’un signal faisant office de résultats. Entre un temps d’attente plus long, mais un faible coût et une rapidité contrebalancée par un coût élevé, il peut être difficile de choisir. Il est donc important d’adapter le choix de la méthode à la réalité du terrain. Un séquençage peut s’effectuer sur des petites quantités d’échantillons demandant la même analyse puisque cette méthode, paraissant longue, possède de nombreux temps d’attente pouvant être utilisé pour réaliser des tâches annexes. De plus, son faible coût est un argument de poids pour l’entreprise. La seconde méthode d’analyse, elle, est plutôt réservée aux analyses reprenant un nombre conséquent d’échantillons pouvant aller jusqu’à plusieurs centaines. Ainsi, le coût important des réactifs sera équilibré par un nombre de résultats également élevé. La somme récupérée auprès des clients rapidement satisfaits remboursera ainsi les frais occasionnés. Ainsi, ce TFE présente en détails le déroulé des tests développés et optimisés à l’aide de ces méthodes ainsi que leurs caractéristiques, avantages et inconvénients respectifs. Note de contenu : Table des matières Introduction ...........................................................................................................................7 Contexte .............................................................................................................................7 Notions théoriques .............................................................................................................8 Composition de l’ADN .....................................................................................................8 Modifications de l’ADN .................................................................................................10 Polymer Chain Reaction « PCR » ...................................................................................11 PCR en temps réel « qPCR » ..........................................................................................13 Séquençage par la méthode de Sanger sur capillaire ....................................................16 Electrophorèse sur gel d’agarose ..................................................................................18 Matériel et méthodes ...........................................................................................................20 Extraction de l’ADN d’un échantillon ................................................................................20 Matériel ........................................................................................................................20 Protocole pour les échantillons sanguins ......................................................................20 Protocole pour les écouvillons salivaires .......................................................................21 Préparation de l’échantillon pour la PCR ...........................................................................21 Matériel ........................................................................................................................21 Protocole ......................................................................................................................22 Polymer Chain Reaction (PCR) ..........................................................................................22 Matériel ........................................................................................................................22 Protocole ......................................................................................................................22 Préparation d’un gel d’agarose .........................................................................................22 Matériel ........................................................................................................................22 Protocole ......................................................................................................................23 Purification de bandes de gel d’agarose ............................................................................24 Matériel ........................................................................................................................24 Protocole ......................................................................................................................24 Quantification d’ADN présent dans les échantillons ..........................................................24 Matériel ........................................................................................................................25 Protocole ......................................................................................................................25 Séquençage ......................................................................................................................25 Résultats et discussion..........................................................................................................26 Développement du test F11 par PCR et séquençage sur capillaire ....................................26 6 Optimisation du test ICHGR par la qPCR ...........................................................................34 Comparaison des méthodes .............................................................................................42 Réactifs .........................................................................................................................42 Méthode d’analyse .......................................................................................................42 Spécificités ....................................................................................................................43 Sensibilité .....................................................................................................................43 Temps ...........................................................................................................................44 Coût financier ...............................................................................................................44 Applications ..................................................................................................................44 Conclusion ............................................................................................................................45 Bibliographie ........................................................................................................................47 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=112610

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