Séquençage et qPCR : comparaison de deux méthodes pour le développement et l’optimisation de tests génétiques / Maxime Kerff

Public ISBD Titre : Séquençage et qPCR : comparaison de deux méthodes pour le développement et l’optimisation de tests génétiques Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Maxime Kerff, Auteur ; Manuel Constant, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie Année de publication : 2023 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Progenus Index. décimale : TFE TA TFE Technologie animalière Résumé : Le séquençage capillaire et la PCR quantitative (qPCR) sont deux méthodes utilisées au sein du laboratoire Progenus de Gembloux pour dépister des mutations génétiques. Dans le cadre de ce TFE, ces deux méthodes sont comparées à travers le développement d’un test par séquençage et l’optimisation d’un autre test par qPCR. Le premier test vise à dépister une mutation chez le Maine Coon causant des troubles de la coagulation. De nombreuses étapes sont nécessaires pour parvenir à développer un test efficace avec la méthode du séquençage. Chacune d’entre elles est importante pour vérifier la bonne amplification du gène concerné, sa purification et enfin son séquençage afin d’analyser la séquence obtenue et rendre un verdict quant à l’état génétique de l’animal : sain, porteur ou atteint par la pathologie causée. Les réactifs nécessaires étant utilisés pour d’autres tests, la mise en place d’un développement par cette méthode représente un coût moindre pour l’entreprise. L’optimisation d’un test au moyen de la qPCR est, quant à elle, beaucoup plus rapide. Le gène pour lequel un test est optimisé est ICHGR, un gène présent chez le Golden Retriever qui, lorsqu’il est défectueux, peut occasionner des problèmes d’ordre cutané. La qPCR apportant des résultats interprétables en moins de deux heures, elle semble idéale pour le dépistage d’échantillons. Le point noir de cette méthode réside dans le coût élevé de ses réactifs, principalement les sondes nécessaires à la récupération d’un signal faisant office de résultats. Entre un temps d’attente plus long, mais un faible coût et une rapidité contrebalancée par un coût élevé, il peut être difficile de choisir. Il est donc important d’adapter le choix de la méthode à la réalité du terrain. Un séquençage peut s’effectuer sur des petites quantités d’échantillons demandant la même analyse puisque cette méthode, paraissant longue, possède de nombreux temps d’attente pouvant être utilisé pour réaliser des tâches annexes. De plus, son faible coût est un argument de poids pour l’entreprise. La seconde méthode d’analyse, elle, est plutôt réservée aux analyses reprenant un nombre conséquent d’échantillons pouvant aller jusqu’à plusieurs centaines. Ainsi, le coût important des réactifs sera équilibré par un nombre de résultats également élevé. La somme récupérée auprès des clients rapidement satisfaits remboursera ainsi les frais occasionnés. Ainsi, ce TFE présente en détails le déroulé des tests développés et optimisés à l’aide de ces méthodes ainsi que leurs caractéristiques, avantages et inconvénients respectifs. Note de contenu : Table des matières Introduction ...........................................................................................................................7 Contexte .............................................................................................................................7 Notions théoriques .............................................................................................................8 Composition de l’ADN .....................................................................................................8 Modifications de l’ADN .................................................................................................10 Polymer Chain Reaction « PCR » ...................................................................................11 PCR en temps réel « qPCR » ..........................................................................................13 Séquençage par la méthode de Sanger sur capillaire ....................................................16 Electrophorèse sur gel d’agarose ..................................................................................18 Matériel et méthodes ...........................................................................................................20 Extraction de l’ADN d’un échantillon ................................................................................20 Matériel ........................................................................................................................20 Protocole pour les échantillons sanguins ......................................................................20 Protocole pour les écouvillons salivaires .......................................................................21 Préparation de l’échantillon pour la PCR ...........................................................................21 Matériel ........................................................................................................................21 Protocole ......................................................................................................................22 Polymer Chain Reaction (PCR) ..........................................................................................22 Matériel ........................................................................................................................22 Protocole ......................................................................................................................22 Préparation d’un gel d’agarose .........................................................................................22 Matériel ........................................................................................................................22 Protocole ......................................................................................................................23 Purification de bandes de gel d’agarose ............................................................................24 Matériel ........................................................................................................................24 Protocole ......................................................................................................................24 Quantification d’ADN présent dans les échantillons ..........................................................24 Matériel ........................................................................................................................25 Protocole ......................................................................................................................25 Séquençage ......................................................................................................................25 Résultats et discussion..........................................................................................................26 Développement du test F11 par PCR et séquençage sur capillaire ....................................26 6 Optimisation du test ICHGR par la qPCR ...........................................................................34 Comparaison des méthodes .............................................................................................42 Réactifs .........................................................................................................................42 Méthode d’analyse .......................................................................................................42 Spécificités ....................................................................................................................43 Sensibilité .....................................................................................................................43 Temps ...........................................................................................................................44 Coût financier ...............................................................................................................44 Applications ..................................................................................................................44 Conclusion ............................................................................................................................45 Bibliographie ........................................................................................................................47 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=112610 Séquençage et qPCR : comparaison de deux méthodes pour le développement et l’optimisation de tests génétiques [TFE / Mémoire] / Maxime Kerff, Auteur ; Manuel Constant, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie, 2023. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Progenus Index. décimale : TFE TA TFE Technologie animalière Résumé : Le séquençage capillaire et la PCR quantitative (qPCR) sont deux méthodes utilisées au sein du laboratoire Progenus de Gembloux pour dépister des mutations génétiques. Dans le cadre de ce TFE, ces deux méthodes sont comparées à travers le développement d’un test par séquençage et l’optimisation d’un autre test par qPCR. Le premier test vise à dépister une mutation chez le Maine Coon causant des troubles de la coagulation. De nombreuses étapes sont nécessaires pour parvenir à développer un test efficace avec la méthode du séquençage. Chacune d’entre elles est importante pour vérifier la bonne amplification du gène concerné, sa purification et enfin son séquençage afin d’analyser la séquence obtenue et rendre un verdict quant à l’état génétique de l’animal : sain, porteur ou atteint par la pathologie causée. Les réactifs nécessaires étant utilisés pour d’autres tests, la mise en place d’un développement par cette méthode représente un coût moindre pour l’entreprise. L’optimisation d’un test au moyen de la qPCR est, quant à elle, beaucoup plus rapide. Le gène pour lequel un test est optimisé est ICHGR, un gène présent chez le Golden Retriever qui, lorsqu’il est défectueux, peut occasionner des problèmes d’ordre cutané. La qPCR apportant des résultats interprétables en moins de deux heures, elle semble idéale pour le dépistage d’échantillons. Le point noir de cette méthode réside dans le coût élevé de ses réactifs, principalement les sondes nécessaires à la récupération d’un signal faisant office de résultats. Entre un temps d’attente plus long, mais un faible coût et une rapidité contrebalancée par un coût élevé, il peut être difficile de choisir. Il est donc important d’adapter le choix de la méthode à la réalité du terrain. Un séquençage peut s’effectuer sur des petites quantités d’échantillons demandant la même analyse puisque cette méthode, paraissant longue, possède de nombreux temps d’attente pouvant être utilisé pour réaliser des tâches annexes. De plus, son faible coût est un argument de poids pour l’entreprise. La seconde méthode d’analyse, elle, est plutôt réservée aux analyses reprenant un nombre conséquent d’échantillons pouvant aller jusqu’à plusieurs centaines. Ainsi, le coût important des réactifs sera équilibré par un nombre de résultats également élevé. La somme récupérée auprès des clients rapidement satisfaits remboursera ainsi les frais occasionnés. Ainsi, ce TFE présente en détails le déroulé des tests développés et optimisés à l’aide de ces méthodes ainsi que leurs caractéristiques, avantages et inconvénients respectifs. Note de contenu : Table des matières Introduction ...........................................................................................................................7 Contexte .............................................................................................................................7 Notions théoriques .............................................................................................................8 Composition de l’ADN .....................................................................................................8 Modifications de l’ADN .................................................................................................10 Polymer Chain Reaction « PCR » ...................................................................................11 PCR en temps réel « qPCR » ..........................................................................................13 Séquençage par la méthode de Sanger sur capillaire ....................................................16 Electrophorèse sur gel d’agarose ..................................................................................18 Matériel et méthodes ...........................................................................................................20 Extraction de l’ADN d’un échantillon ................................................................................20 Matériel ........................................................................................................................20 Protocole pour les échantillons sanguins ......................................................................20 Protocole pour les écouvillons salivaires .......................................................................21 Préparation de l’échantillon pour la PCR ...........................................................................21 Matériel ........................................................................................................................21 Protocole ......................................................................................................................22 Polymer Chain Reaction (PCR) ..........................................................................................22 Matériel ........................................................................................................................22 Protocole ......................................................................................................................22 Préparation d’un gel d’agarose .........................................................................................22 Matériel ........................................................................................................................22 Protocole ......................................................................................................................23 Purification de bandes de gel d’agarose ............................................................................24 Matériel ........................................................................................................................24 Protocole ......................................................................................................................24 Quantification d’ADN présent dans les échantillons ..........................................................24 Matériel ........................................................................................................................25 Protocole ......................................................................................................................25 Séquençage ......................................................................................................................25 Résultats et discussion..........................................................................................................26 Développement du test F11 par PCR et séquençage sur capillaire ....................................26 6 Optimisation du test ICHGR par la qPCR ...........................................................................34 Comparaison des méthodes .............................................................................................42 Réactifs .........................................................................................................................42 Méthode d’analyse .......................................................................................................42 Spécificités ....................................................................................................................43 Sensibilité .....................................................................................................................43 Temps ...........................................................................................................................44 Coût financier ...............................................................................................................44 Applications ..................................................................................................................44 Conclusion ............................................................................................................................45 Bibliographie ........................................................................................................................47 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=112610

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