Contribution au développement de tests de PCR en temps réel pour l’authentification de produits dérivés d’insectes / Martin Dupont

Public ISBD Titre : Contribution au développement de tests de PCR en temps réel pour l’authentification de produits dérivés d’insectes Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Martin Dupont, Auteur ; Jonathan Scauflaire, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : L’utilisation d’insectes comestibles comme source de protéines est de plus en plus répandue en alimentation humaine et animale. En Europe, 7 espèces d’insectes sont autorisées dans l’alimentation animale en tant que protéines animales transformées (PAT) et 5 espèces d’insectes sont tolérées en Belgique en tant que « novel-food » pour la consommation humaine. C’est pourquoi, des méthodes d’authentification des produits sont requises. L’objectif de ce travail est de contribuer au développement de tests PCR en temps réel visant la détection d’insectes en général ou spécifique à une espèce. Les espèces ciblées étant Gryllodes sigillatus, Bombyx mori et Ephestia kuehniella. Différentes stratégies ont été utilisées au cours de ce travail. La première a été de rechercher des tests PCR dans la littérature et d’évaluer leur potentiel. C’est le cas pour les cibles visant la détection des insectes développées par Köppel (2019) dont l’évaluation sur base d’alignement de séquences et d’un test PCR en SYBR® Green 1 a montré des problèmes de détection pour certains insectes dont Hermetia illucens. L’utilisation de ces cibles et la possibilité de passer ces tests en PCR en temps réel avec sonde ont été abandonnées. Cette stratégie a également été utilisée pour le test PCR visant la détection spécifique de Gryllodes sigillatus qui provient également de la littérature. Le fragment d’ADN ciblé par les amorces développées par Daniso (2020) a permis le placement d’une sonde Taqman™ et donc de passer ce test en PCR en temps réel avec sonde. Les concentrations en amorces et sonde ont fait l’objet d’une optimisation. L’évaluation de la spécificité de la cible GS1 pour la détection spécifique de Gryllodes sigillatus a été concluante. Sur les 42 espèces d’insectes, 43 autres animaux et les 7 plantes testées, seules 2 espèces montrent des aspécificités mais avec des signaux tardifs. Ces aspécificités ne devraient donc pas poser de problème étant donné que ces valeurs de Ct sont obtenues avec une forte concentration en ADN dans la réaction. La seconde stratégie a été de développer un nouveau test de PCR en temps réel car aucun test n’était référencé dans la littérature. Un test de PCR en temps réel visant la détection spécifique d’Ephestia kuehniella a été développé à partir des séquences disponibles dans la base de données NCBI. Les concentrations en amorces et sonde ont fait l’objet d’une optimisation. L’évaluation de la spécificité de la cible dénommée FSTK-per a été concluante. Aucune aspécificité n’a été détectée sur les 91 autres espèces testées comprenant des insectes, d’autres animaux et des plantes. L’applicabilité de la méthode a pu être démontrée. Enfin, l’évaluation d’un test de PCR en temps réel pour la détection de Bombyx mori déjà développé au niveau du CRA-W a été réalisée. Avant de commencer l’évaluation de la cible, les concentrations en amorces et sonde ont fait l’objet d’une optimisation. Le test de spécificité réalisé sur 42 espèces d’insectes, 43 autres animaux et 7 plantes, a montré une aspécificité avec Phyrrocoris apterus. Cette aspécificité n’a pas pu être vérifiée « in silico » à cause du manque de séquences disponibles pour cette espèce. Afin de vérifier qu’il y a un réel manque de spécificité de la cible Bombyx-cad, d’autres échantillons de cette espèce devraient être analysés. Les critères de performance du test PCR ont été atteints au niveau de l’efficience, de la sensibilité et de la robustesse. L’applicabilité de la méthode a également pu être démontrée. Note de contenu : Table des matières Remerciements _____________________________________________________________ 4 Présentation du lieu de stage _________________________________________________ 7 Introduction _______________________________________________________________ 9 Contexte général_______________________________________________________ 10 Théorie à propos des insectes ________________________________________________ 10 1.1. Généralités _______________________________________________________________________ 10 1.2. Classification _____________________________________________________________________ 11 1.3. Consommation ____________________________________________________________________ 13 1.4. Législation _______________________________________________________________________ 14 1.5. Fabrication _______________________________________________________________________ 17 Biologie moléculaire _______________________________________________________ 18 Principe des techniques _____________________________________________________ 19 3.1. Techniques d’extraction de l’ADN _____________________________________________________ 19 3.2. Technique d’évaluation de l’ADN extrait : La spectrophotométrie ___________________________ 19 3.3. Techniques d’amplification de l’ADN __________________________________________________ 20 Objectif et stratégie ____________________________________________________ 27 Matériel et méthodes ___________________________________________________ 28 1. Visualisation de l’ensemble des étapes de travail ________________________________ 28 2. Procédure organisationnelle _________________________________________________ 29 2.1. Organisation des locaux_____________________________________________________________ 29 2.2. Précautions ______________________________________________________________________ 30 3. Analyse bioinformatique ____________________________________________________ 30 3.1. Collecte de séquences nucléotidiques _________________________________________________ 31 3.2. Alignement globaux des séquences ___________________________________________________ 31 3.3. Visualisation de la région cible pour les amorces et sondes ________________________________ 31 3.4. Design des amorces et sondes _______________________________________________________ 31 4. Analyse des échantillons ____________________________________________________ 32 4.1. Réception des échantillons __________________________________________________________ 32 4.2. Broyage des échantillons ____________________________________________________________ 33 4.3. Prises d’essai _____________________________________________________________________ 33 4.4. Extraction de l’ADN au CTAB _________________________________________________________ 34 4.5. Quantification des acides nucléiques __________________________________________________ 35 4.6. Analyse par PCR en temps réel _______________________________________________________ 36 4.7. Test d’optimisation ________________________________________________________________ 37 5. Analyse des performances __________________________________________________ 38 5.1. Evaluation de la spécificité __________________________________________________________ 38 5.2. Détermination du nombre de copies par PCR digitale _____________________________________ 38 5.3. Evaluation de l’efficience ____________________________________________________________ 39 5.4. Evaluation de la sensibilité __________________________________________________________ 40 5.5. Evaluation de la robustesse __________________________________________________________ 41 5.6. Test d’applicabilité _________________________________________________________________ 42 Résultats et discussion __________________________________________________ 43 1. Description des recherches bibliographiques____________________________________ 43 1.1. Cible visant la détection des insectes nommée Ins3 ______________________________________ 43 1.2. Cible visant la détection spécifique de Gryllodes sigillatus nommée GS1 ______________________ 48 1.3. Cible visant la détection spécifique d’Ephestia kuehniella nommée FSTK-per __________________ 49 2. Test d’optimisation ________________________________________________________ 50 2.1. Cible visant la détection spécifique de Gryllodes sigillatus nommée GS1 ______________________ 50 2.2. Cible visant la détection spécifique de Bombyx mori nommée Bombyx-cad ___________________ 51 2.3. Cible visant la détection spécifique d’Ephestia kuehniella nommée FSTK-per __________________ 52 2.4. Récapitulatif des concentrations finales utilisées_________________________________________ 53 3. Evaluation des performances ________________________________________________ 53 3.1. Évaluation de la spécificité des méthodes de PCR en temps réel ____________________________ 53 3.2. Détermination du nombre de copies par PCR digitale _____________________________________ 60 3.3. Efficience ________________________________________________________________________ 61 3.4. Evaluation de la sensibilité __________________________________________________________ 61 3.5. Robustesse _______________________________________________________________________ 63 4. Test d’applicabilité_________________________________________________________ 64 4.1. Cible visant la détection spécifique de Bombyx mori nommée Bombyx-cad ___________________ 64 4.2. Cible visant la détection spécifique d’Ephestia kuehniella nommée FSTK-per __________________ 65 Conclusion générale et perspectives ___________________________________________ 66 Liste des tableaux, des figures, des abréviations, des symboles _____________________ 68 Liste des tableaux _________________________________________________________ 68 2. Liste des figures ___________________________________________________________ 69 3. Liste des abréviations ______________________________________________________ 71 4. Liste des symboles _________________________________________________________ 72 Bibliographie ______________________________________________________________ 73 Annexe __________________________________________________________________ 78 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105984 Contribution au développement de tests de PCR en temps réel pour l’authentification de produits dérivés d’insectes [TFE / Mémoire] / Martin Dupont, Auteur ; Jonathan Scauflaire, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie, 2021. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : L’utilisation d’insectes comestibles comme source de protéines est de plus en plus répandue en alimentation humaine et animale. En Europe, 7 espèces d’insectes sont autorisées dans l’alimentation animale en tant que protéines animales transformées (PAT) et 5 espèces d’insectes sont tolérées en Belgique en tant que « novel-food » pour la consommation humaine. C’est pourquoi, des méthodes d’authentification des produits sont requises. L’objectif de ce travail est de contribuer au développement de tests PCR en temps réel visant la détection d’insectes en général ou spécifique à une espèce. Les espèces ciblées étant Gryllodes sigillatus, Bombyx mori et Ephestia kuehniella. Différentes stratégies ont été utilisées au cours de ce travail. La première a été de rechercher des tests PCR dans la littérature et d’évaluer leur potentiel. C’est le cas pour les cibles visant la détection des insectes développées par Köppel (2019) dont l’évaluation sur base d’alignement de séquences et d’un test PCR en SYBR® Green 1 a montré des problèmes de détection pour certains insectes dont Hermetia illucens. L’utilisation de ces cibles et la possibilité de passer ces tests en PCR en temps réel avec sonde ont été abandonnées. Cette stratégie a également été utilisée pour le test PCR visant la détection spécifique de Gryllodes sigillatus qui provient également de la littérature. Le fragment d’ADN ciblé par les amorces développées par Daniso (2020) a permis le placement d’une sonde Taqman™ et donc de passer ce test en PCR en temps réel avec sonde. Les concentrations en amorces et sonde ont fait l’objet d’une optimisation. L’évaluation de la spécificité de la cible GS1 pour la détection spécifique de Gryllodes sigillatus a été concluante. Sur les 42 espèces d’insectes, 43 autres animaux et les 7 plantes testées, seules 2 espèces montrent des aspécificités mais avec des signaux tardifs. Ces aspécificités ne devraient donc pas poser de problème étant donné que ces valeurs de Ct sont obtenues avec une forte concentration en ADN dans la réaction. La seconde stratégie a été de développer un nouveau test de PCR en temps réel car aucun test n’était référencé dans la littérature. Un test de PCR en temps réel visant la détection spécifique d’Ephestia kuehniella a été développé à partir des séquences disponibles dans la base de données NCBI. Les concentrations en amorces et sonde ont fait l’objet d’une optimisation. L’évaluation de la spécificité de la cible dénommée FSTK-per a été concluante. Aucune aspécificité n’a été détectée sur les 91 autres espèces testées comprenant des insectes, d’autres animaux et des plantes. L’applicabilité de la méthode a pu être démontrée. Enfin, l’évaluation d’un test de PCR en temps réel pour la détection de Bombyx mori déjà développé au niveau du CRA-W a été réalisée. Avant de commencer l’évaluation de la cible, les concentrations en amorces et sonde ont fait l’objet d’une optimisation. Le test de spécificité réalisé sur 42 espèces d’insectes, 43 autres animaux et 7 plantes, a montré une aspécificité avec Phyrrocoris apterus. Cette aspécificité n’a pas pu être vérifiée « in silico » à cause du manque de séquences disponibles pour cette espèce. Afin de vérifier qu’il y a un réel manque de spécificité de la cible Bombyx-cad, d’autres échantillons de cette espèce devraient être analysés. Les critères de performance du test PCR ont été atteints au niveau de l’efficience, de la sensibilité et de la robustesse. L’applicabilité de la méthode a également pu être démontrée. Note de contenu : Table des matières Remerciements _____________________________________________________________ 4 Présentation du lieu de stage _________________________________________________ 7 Introduction _______________________________________________________________ 9 Contexte général_______________________________________________________ 10 Théorie à propos des insectes ________________________________________________ 10 1.1. Généralités _______________________________________________________________________ 10 1.2. Classification _____________________________________________________________________ 11 1.3. Consommation ____________________________________________________________________ 13 1.4. Législation _______________________________________________________________________ 14 1.5. Fabrication _______________________________________________________________________ 17 Biologie moléculaire _______________________________________________________ 18 Principe des techniques _____________________________________________________ 19 3.1. Techniques d’extraction de l’ADN _____________________________________________________ 19 3.2. Technique d’évaluation de l’ADN extrait : La spectrophotométrie ___________________________ 19 3.3. Techniques d’amplification de l’ADN __________________________________________________ 20 Objectif et stratégie ____________________________________________________ 27 Matériel et méthodes ___________________________________________________ 28 1. Visualisation de l’ensemble des étapes de travail ________________________________ 28 2. Procédure organisationnelle _________________________________________________ 29 2.1. Organisation des locaux_____________________________________________________________ 29 2.2. Précautions ______________________________________________________________________ 30 3. Analyse bioinformatique ____________________________________________________ 30 3.1. Collecte de séquences nucléotidiques _________________________________________________ 31 3.2. Alignement globaux des séquences ___________________________________________________ 31 3.3. Visualisation de la région cible pour les amorces et sondes ________________________________ 31 3.4. Design des amorces et sondes _______________________________________________________ 31 4. Analyse des échantillons ____________________________________________________ 32 4.1. Réception des échantillons __________________________________________________________ 32 4.2. Broyage des échantillons ____________________________________________________________ 33 4.3. Prises d’essai _____________________________________________________________________ 33 4.4. Extraction de l’ADN au CTAB _________________________________________________________ 34 4.5. Quantification des acides nucléiques __________________________________________________ 35 4.6. Analyse par PCR en temps réel _______________________________________________________ 36 4.7. Test d’optimisation ________________________________________________________________ 37 5. Analyse des performances __________________________________________________ 38 5.1. Evaluation de la spécificité __________________________________________________________ 38 5.2. Détermination du nombre de copies par PCR digitale _____________________________________ 38 5.3. Evaluation de l’efficience ____________________________________________________________ 39 5.4. Evaluation de la sensibilité __________________________________________________________ 40 5.5. Evaluation de la robustesse __________________________________________________________ 41 5.6. Test d’applicabilité _________________________________________________________________ 42 Résultats et discussion __________________________________________________ 43 1. Description des recherches bibliographiques____________________________________ 43 1.1. Cible visant la détection des insectes nommée Ins3 ______________________________________ 43 1.2. Cible visant la détection spécifique de Gryllodes sigillatus nommée GS1 ______________________ 48 1.3. Cible visant la détection spécifique d’Ephestia kuehniella nommée FSTK-per __________________ 49 2. Test d’optimisation ________________________________________________________ 50 2.1. Cible visant la détection spécifique de Gryllodes sigillatus nommée GS1 ______________________ 50 2.2. Cible visant la détection spécifique de Bombyx mori nommée Bombyx-cad ___________________ 51 2.3. Cible visant la détection spécifique d’Ephestia kuehniella nommée FSTK-per __________________ 52 2.4. Récapitulatif des concentrations finales utilisées_________________________________________ 53 3. Evaluation des performances ________________________________________________ 53 3.1. Évaluation de la spécificité des méthodes de PCR en temps réel ____________________________ 53 3.2. Détermination du nombre de copies par PCR digitale _____________________________________ 60 3.3. Efficience ________________________________________________________________________ 61 3.4. Evaluation de la sensibilité __________________________________________________________ 61 3.5. Robustesse _______________________________________________________________________ 63 4. Test d’applicabilité_________________________________________________________ 64 4.1. Cible visant la détection spécifique de Bombyx mori nommée Bombyx-cad ___________________ 64 4.2. Cible visant la détection spécifique d’Ephestia kuehniella nommée FSTK-per __________________ 65 Conclusion générale et perspectives ___________________________________________ 66 Liste des tableaux, des figures, des abréviations, des symboles _____________________ 68 Liste des tableaux _________________________________________________________ 68 2. Liste des figures ___________________________________________________________ 69 3. Liste des abréviations ______________________________________________________ 71 4. Liste des symboles _________________________________________________________ 72 Bibliographie ______________________________________________________________ 73 Annexe __________________________________________________________________ 78 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105984

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