Mise au point de RT-qPCR ciblant les transcrits de fusion BCR-ABL1 pour le diagnostic et le suivi thérapeutique des leucémies myéloïdes chroniques / Sarah Verardo

Public ISBD Titre : Mise au point de RT-qPCR ciblant les transcrits de fusion BCR-ABL1 pour le diagnostic et le suivi thérapeutique des leucémies myéloïdes chroniques Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Sarah Verardo, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2022 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La leucémie myéloïde chronique est une pathologie due à la translocation t(9 ;22) (q34 ;q11.2) qui, en fonction du point de cassure qui a lieu dans les introns des gènes BCR et ABL1, donne des transcrits BCR-ABL1 différents. Certains points de cassure sont plus rares que d’autres. Quand ceux-ci surviennent ils sont considérés comme atypiques (e1a2, e1a3, e6a2, e8a2, e13a3, e14a3 et e19a2). Dans le cadre de mon TFE, il a été décidé de mettre au point une nouvelle technique de RT-qPCR pour le diagnostic et le suivi des transcrits de BCR-ABL1 dans les leucémies myéloïdes chroniques. Nous avons donc réalisé un screening des patients déjà suivis à l’IPG pour nous rendre compte de l’utilité de mettre en place cette technique et d’obtenir le matériel biologique nécessaire à la mise au point. Ce screening se base sur une PCR avec des amorces permettant d’amplifier tous les transcrits de BCR-ABL1 et il nous aura permis de diagnostiquer 8 patients possédant un transcrit atypique de BCR-ABL1, à savoir 6 patients e19a2, un patient e6a2 et un patient e13a3. Il était donc nécessaire de mettre en place une technique de diagnostic permettant de distinguer ces différents transcrits ainsi qu’une méthode de suivi. Dans un deuxième temps, nous avons mis en place une technique de RT-qPCR multiplex qui permet de mettre en évidence et de distinguer les transcrits BCR-ABL1 les uns des autres grâce à des sondes qui viennent s’hybrider sur différents endroits du gène. Nous avons pu montrer que cette technique donne les résultats que nous attendions mais aussi qu’elle était équivalente à la technique déjà utilisée au laboratoire pour les transcrits e1a2, e13a2 et e14a2. Cette RT-qPCR multiplex est donc spécifique des fragments que nous souhaitons amplifier et assez sensible pour détecter de petites quantités de transcrits et ce sur des plasmides et lignées contrôles comme sur des échantillons de patients. Nous avons aussi mis en place une RT-qPCR mutliplex qui permet de mettre en évidence les transcrits BCR-ABL1 qui ont une fusion a3. Dans cette RT-qPCR, tous les transcrits sont positifs mais on sait distinguer les fusions a3 des fusions a2 quand la RT-qPCR multiplex a2 ne donne aucune valeur de Ct alors que la RT-qPCR multiplex a3 donne des valeurs positives. Ces 2 RT-qPCR seront donc à l’avenir utilisées en parallèle l’une de l’autre afin de pouvoir diagnostiquer au mieux les patients. Pour le suivi des patients, nous nous sommes concentrés ici sur le suivi du e19a2 à l’aide d’un plasmide contenant le gène de ménage GUS B qui va donc nous permettre de faire une quantification du transcrit e19a2 par rapport au gène GUS B et de suivre les patients en IMR (Individual Molecular Response). Nous avons donc appliqué cette technique à des patients qui étaient suivis au laboratoire depuis des années avec une technique moins spécifique et nous avons remarqué que certains patients qui avaient été notés comme négatifs ne l’étaient en fait pas et n’avaient pas répondu correctement au traitement. Note de contenu : 6 Table des matières Remerciements ................................................................................................................................5 Présentation du laboratoire ............................................................................................................10 A. La leucémie myéloïde chronique ........................................................................................11 1. Définition et physiopathologie ...........................................................................................11 2. Diagnostic ...........................................................................................................................13 a) L’hémogramme ...............................................................................................................13 b) Le myélogramme ............................................................................................................14 c) La cytogénétique .............................................................................................................14 d) La biologie moléculaire ..................................................................................................16 3. Évolution de la maladie ......................................................................................................16 4. Étiologie et épidémiologie ..................................................................................................17 5. Traitement ...........................................................................................................................18 6. Suivi du patient ...................................................................................................................19 7. Pronostic .............................................................................................................................20 B. Objectifs et stratégie ...........................................................................................................22 C. Résultats .............................................................................................................................23 1. Recherche de patients présentant un transcrit BCR-ABL1 atypique .................................23 a) PCR V136A/B et V136E/B ............................................................................................23 b) Résultats de l’amplification sur gel d’électrophorèse .....................................................24 c) Séquençage Sanger .........................................................................................................26 2. Préparation des plasmides contenant les transcrits de fusion BCR-ABL1 .........................29 3. Mise au point des RT-qPCR multiplex identifiant les transcrits de fusion BCR-ABL1 ....31 a) RT-qPCR BCR-ABL1 fusion a2 ....................................................................................31 b) RT-qPCR BCR-ABL1 fusion a2 sur les lignées contrôles .............................................34 c) RT- qPCR BCR-ABL1 fusion a3 testées sur les plasmides ...........................................36 d) Test des qPCR BCR-ABL1 fusion a2 et a3 sur des échantillons de patients. ................37 7 e) RT-qPCR BCR-ABL1 fusion a3 rétrospective sur les ADNc de patients négatifs de l’année 2021 ...........................................................................................................................39 f) Test des qPCR BCR-ABL1 fusion a2 et a3 sur des ADNc de patients pour compléter une analyse de routine ............................................................................................................39 4. Mise au point du suivi par Individual Molecular Response (IMR) d’un patient présentant un transcrit de fusion BCR-ABL1 e19a2 ...................................................................................41 a) Principe ...........................................................................................................................41 b) Quantification du plasmide linéarisé pUC-18BCR_GUS_e19a2 ...................................41 c) Cas du patient n°7 ...........................................................................................................43 D. Conclusions et perspectives ................................................................................................44 E. Matériel et méthodes ..............................................................................................................46 1. La « Polymerase Chain Reaction » (PCR) .........................................................................46 a) Principe ...........................................................................................................................46 b) PCR V136A/B ................................................................................................................46 c) PCR V136E/B .................................................................................................................47 2. L’électrophorèse sur gel d’agarose .....................................................................................47 a) Principe ...........................................................................................................................47 b) Mode opératoire ..............................................................................................................47 3. Le Séquençage de Sanger ...................................................................................................48 a) Principe ...........................................................................................................................48 b) Mode opératoire ..............................................................................................................48 4. Transformation de bactéries Escherichia coli compétentes avec un plasmide ..................50 a) Principe ...........................................................................................................................50 b) Mode opératoire ..............................................................................................................50 5. Purification d’ADN plasmidique ........................................................................................51 a) Principe ...........................................................................................................................51 b) Mode opératoire ..............................................................................................................51 6. Dosage d’ADN/ARN ..........................................................................................................52 8 a) Principe ...........................................................................................................................52 b) Mode opératoire ..............................................................................................................52 7. Digestion d’ADN plasmidique par enzyme de restriction .................................................52 a) Principe ...........................................................................................................................52 b) Restriction diagnostique .................................................................................................52 c) Mode opératoire ..............................................................................................................53 d) Linéarisation ...................................................................................................................53 8. Purification d’ADN sur gel d’électrophorèse .....................................................................53 a) Principe ...........................................................................................................................53 b) Mode opératoire ..............................................................................................................53 9. Purification d’ADN sur colonne .........................................................................................53 a) Principe ...........................................................................................................................53 b) Mode opératoire ..............................................................................................................54 10. Rétrotranscription d’ARN...............................................................................................54 a) Principe ...........................................................................................................................54 b) Mode opératoire ..............................................................................................................54 11. La PCR quantitative (qPCR)...........................................................................................55 a) Principe ...........................................................................................................................55 b) Analyse des résultats .......................................................................................................56 c) Evaluation de la méthode ................................................................................................56 d) Mode opératoire ..............................................................................................................56 e) Mix utilisés .....................................................................................................................57 12. La PCR digitale en gouttelettes (ddPCR) .......................................................................57 a) Principe ...........................................................................................................................57 b) Mode opératoire de la manipulation manuelle................................................................57 c) Mode opératoire de la méthode automatisée ..................................................................58 d) Mix utilisés .....................................................................................................................58 9 e) Programme PCR .............................................................................................................58 f) Explication des calculs effectués ....................................................................................59 G. Bibliographie ......................................................................................................................61 H. Table des annexes ...............................................................................................................63 I. Annexes images......................................................................................................................65 J. Annexes tableaux ...................................................................................................................77 Résumé ..........................................................................................................................................87 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105768 Mise au point de RT-qPCR ciblant les transcrits de fusion BCR-ABL1 pour le diagnostic et le suivi thérapeutique des leucémies myéloïdes chroniques [TFE / Mémoire] / Sarah Verardo, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2022. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La leucémie myéloïde chronique est une pathologie due à la translocation t(9 ;22) (q34 ;q11.2) qui, en fonction du point de cassure qui a lieu dans les introns des gènes BCR et ABL1, donne des transcrits BCR-ABL1 différents. Certains points de cassure sont plus rares que d’autres. Quand ceux-ci surviennent ils sont considérés comme atypiques (e1a2, e1a3, e6a2, e8a2, e13a3, e14a3 et e19a2). Dans le cadre de mon TFE, il a été décidé de mettre au point une nouvelle technique de RT-qPCR pour le diagnostic et le suivi des transcrits de BCR-ABL1 dans les leucémies myéloïdes chroniques. Nous avons donc réalisé un screening des patients déjà suivis à l’IPG pour nous rendre compte de l’utilité de mettre en place cette technique et d’obtenir le matériel biologique nécessaire à la mise au point. Ce screening se base sur une PCR avec des amorces permettant d’amplifier tous les transcrits de BCR-ABL1 et il nous aura permis de diagnostiquer 8 patients possédant un transcrit atypique de BCR-ABL1, à savoir 6 patients e19a2, un patient e6a2 et un patient e13a3. Il était donc nécessaire de mettre en place une technique de diagnostic permettant de distinguer ces différents transcrits ainsi qu’une méthode de suivi. Dans un deuxième temps, nous avons mis en place une technique de RT-qPCR multiplex qui permet de mettre en évidence et de distinguer les transcrits BCR-ABL1 les uns des autres grâce à des sondes qui viennent s’hybrider sur différents endroits du gène. Nous avons pu montrer que cette technique donne les résultats que nous attendions mais aussi qu’elle était équivalente à la technique déjà utilisée au laboratoire pour les transcrits e1a2, e13a2 et e14a2. Cette RT-qPCR multiplex est donc spécifique des fragments que nous souhaitons amplifier et assez sensible pour détecter de petites quantités de transcrits et ce sur des plasmides et lignées contrôles comme sur des échantillons de patients. Nous avons aussi mis en place une RT-qPCR mutliplex qui permet de mettre en évidence les transcrits BCR-ABL1 qui ont une fusion a3. Dans cette RT-qPCR, tous les transcrits sont positifs mais on sait distinguer les fusions a3 des fusions a2 quand la RT-qPCR multiplex a2 ne donne aucune valeur de Ct alors que la RT-qPCR multiplex a3 donne des valeurs positives. Ces 2 RT-qPCR seront donc à l’avenir utilisées en parallèle l’une de l’autre afin de pouvoir diagnostiquer au mieux les patients. Pour le suivi des patients, nous nous sommes concentrés ici sur le suivi du e19a2 à l’aide d’un plasmide contenant le gène de ménage GUS B qui va donc nous permettre de faire une quantification du transcrit e19a2 par rapport au gène GUS B et de suivre les patients en IMR (Individual Molecular Response). Nous avons donc appliqué cette technique à des patients qui étaient suivis au laboratoire depuis des années avec une technique moins spécifique et nous avons remarqué que certains patients qui avaient été notés comme négatifs ne l’étaient en fait pas et n’avaient pas répondu correctement au traitement. Note de contenu : 6 Table des matières Remerciements ................................................................................................................................5 Présentation du laboratoire ............................................................................................................10 A. La leucémie myéloïde chronique ........................................................................................11 1. Définition et physiopathologie ...........................................................................................11 2. Diagnostic ...........................................................................................................................13 a) L’hémogramme ...............................................................................................................13 b) Le myélogramme ............................................................................................................14 c) La cytogénétique .............................................................................................................14 d) La biologie moléculaire ..................................................................................................16 3. Évolution de la maladie ......................................................................................................16 4. Étiologie et épidémiologie ..................................................................................................17 5. Traitement ...........................................................................................................................18 6. Suivi du patient ...................................................................................................................19 7. Pronostic .............................................................................................................................20 B. Objectifs et stratégie ...........................................................................................................22 C. Résultats .............................................................................................................................23 1. Recherche de patients présentant un transcrit BCR-ABL1 atypique .................................23 a) PCR V136A/B et V136E/B ............................................................................................23 b) Résultats de l’amplification sur gel d’électrophorèse .....................................................24 c) Séquençage Sanger .........................................................................................................26 2. Préparation des plasmides contenant les transcrits de fusion BCR-ABL1 .........................29 3. Mise au point des RT-qPCR multiplex identifiant les transcrits de fusion BCR-ABL1 ....31 a) RT-qPCR BCR-ABL1 fusion a2 ....................................................................................31 b) RT-qPCR BCR-ABL1 fusion a2 sur les lignées contrôles .............................................34 c) RT- qPCR BCR-ABL1 fusion a3 testées sur les plasmides ...........................................36 d) Test des qPCR BCR-ABL1 fusion a2 et a3 sur des échantillons de patients. ................37 7 e) RT-qPCR BCR-ABL1 fusion a3 rétrospective sur les ADNc de patients négatifs de l’année 2021 ...........................................................................................................................39 f) Test des qPCR BCR-ABL1 fusion a2 et a3 sur des ADNc de patients pour compléter une analyse de routine ............................................................................................................39 4. Mise au point du suivi par Individual Molecular Response (IMR) d’un patient présentant un transcrit de fusion BCR-ABL1 e19a2 ...................................................................................41 a) Principe ...........................................................................................................................41 b) Quantification du plasmide linéarisé pUC-18BCR_GUS_e19a2 ...................................41 c) Cas du patient n°7 ...........................................................................................................43 D. Conclusions et perspectives ................................................................................................44 E. Matériel et méthodes ..............................................................................................................46 1. La « Polymerase Chain Reaction » (PCR) .........................................................................46 a) Principe ...........................................................................................................................46 b) PCR V136A/B ................................................................................................................46 c) PCR V136E/B .................................................................................................................47 2. L’électrophorèse sur gel d’agarose .....................................................................................47 a) Principe ...........................................................................................................................47 b) Mode opératoire ..............................................................................................................47 3. Le Séquençage de Sanger ...................................................................................................48 a) Principe ...........................................................................................................................48 b) Mode opératoire ..............................................................................................................48 4. Transformation de bactéries Escherichia coli compétentes avec un plasmide ..................50 a) Principe ...........................................................................................................................50 b) Mode opératoire ..............................................................................................................50 5. Purification d’ADN plasmidique ........................................................................................51 a) Principe ...........................................................................................................................51 b) Mode opératoire ..............................................................................................................51 6. Dosage d’ADN/ARN ..........................................................................................................52 8 a) Principe ...........................................................................................................................52 b) Mode opératoire ..............................................................................................................52 7. Digestion d’ADN plasmidique par enzyme de restriction .................................................52 a) Principe ...........................................................................................................................52 b) Restriction diagnostique .................................................................................................52 c) Mode opératoire ..............................................................................................................53 d) Linéarisation ...................................................................................................................53 8. Purification d’ADN sur gel d’électrophorèse .....................................................................53 a) Principe ...........................................................................................................................53 b) Mode opératoire ..............................................................................................................53 9. Purification d’ADN sur colonne .........................................................................................53 a) Principe ...........................................................................................................................53 b) Mode opératoire ..............................................................................................................54 10. Rétrotranscription d’ARN...............................................................................................54 a) Principe ...........................................................................................................................54 b) Mode opératoire ..............................................................................................................54 11. La PCR quantitative (qPCR)...........................................................................................55 a) Principe ...........................................................................................................................55 b) Analyse des résultats .......................................................................................................56 c) Evaluation de la méthode ................................................................................................56 d) Mode opératoire ..............................................................................................................56 e) Mix utilisés .....................................................................................................................57 12. La PCR digitale en gouttelettes (ddPCR) .......................................................................57 a) Principe ...........................................................................................................................57 b) Mode opératoire de la manipulation manuelle................................................................57 c) Mode opératoire de la méthode automatisée ..................................................................58 d) Mix utilisés .....................................................................................................................58 9 e) Programme PCR .............................................................................................................58 f) Explication des calculs effectués ....................................................................................59 G. Bibliographie ......................................................................................................................61 H. Table des annexes ...............................................................................................................63 I. Annexes images......................................................................................................................65 J. Annexes tableaux ...................................................................................................................77 Résumé ..........................................................................................................................................87 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105768

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