Evaluation pré-clinique in- vitro d’un potentiel candidat thérapeutique anti- leucémique / Elyse Fievet

Public ISBD Titre : Evaluation pré-clinique in- vitro d’un potentiel candidat thérapeutique anti- leucémique Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Elyse Fievet, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2022 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La leucémie aigüe myéloïde (LAM) est une forme sévère de cancer des cellules hématopoïétiques touchant la moelle osseuse et les organes lymphoïdes. C’est la forme de leucémie aigüe la plus répandue chez les personnes âgées. Le traitement de première intention repose sur une chimiothérapie intensive pour les patients les plus jeunes et sur l’association d’un agent hypométhylant et d’un inhibiteur de la protéine BCL2 pour les patients les plus âgés ou avec des comorbidités les rendant inéligible pour la chimiothérapie intensive. Les taux de rémission complète varient en fonction du sous-groupe mais sont d’environ 50% avec une médiane de survie comprise entre 3 et 24 mois. Face à ces résultats préoccupants, il est primordial de trouver de nouvelles approches thérapeutiques afin d’augmenter les chances de guérison. Ce travail est basé sur la recherche d’un potentiel candidat thérapeutique efficace contre la leucémie myéloïde aiguë. Dans un premier temps, il a été nécessaire de déterminer si la drogue étudiée avait un effet de cytotoxicité sur les cellules leucémiques d’abord issues de lignées cellulaires établies en culture permanente in vitro, puis sur des cellules issues d’échantillons sanguins de patients atteints de leucémie. Après diverses expériences, il a été possible de déterminer que la cytotoxicité de la drogue variait de 0,05 μM à 0,020 μM selon la lignée cellulaire étudiée et de 0,05 μM à 0,50 μM selon le type de PDX utilisé. Une fois l’action cytotoxique déterminée, diverses expérimentations ont été réalisées afin de déterminer quelle voie de mort cellulaire les cellules cancéreuses empruntaient sous l’action de la drogue. La conclusion sortant de ces expérimentations est que l’inhibition des caspases permet de diminuer la mort cellulaire de près de 20% en faveur d’une activation de l’apoptose cellulaire. Enfin, la détermination et la quantification de l’expression de l’ARNm codant pour la protéine cible de cette drogue a été réalisée sur lignées cellulaires, leucémies primaires issues de patients et sur cellules non malignes. Suite à cette expérimentation, il a été possible de démontrer que l’expression de la protéine KIF20A n’est pas associée à une meilleure efficacité de la molécule étudiée. Suite à ces nombreuses et diverses analyses, on peut en conclure que le DCR, potentiel candidat thérapeutique, est prometteur pour le traitement des LAM Note de contenu : 5 Table des matières Remerciements .......................................................................................................................... 4 Table des matières ..................................................................................................................... 5 Présentation du lieu de stage..................................................................................................... 7 1. Introduction théorique ........................................................................................................... 8 1.1 Le cancer et la leucémie myéloïde aiguë.......................................................................... 8 1.1.1 L’incidence du cancer................................................................................................. 8 1.1.2 Les différents types de cancers.................................................................................. 8 1.1.3 La leucémie aiguë myéloïde (LAM) ............................................................................ 9 1.1.3.1 La leucémie en général ....................................................................................... 9 1.1.3.2 La LAM ............................................................................................................... 10 1.2 Traitements actuels d’une LAM...................................................................................... 10 1.2.1 Pour des patients médicalement en bon état général ............................................ 11 1.2.2 Pour des patients non candidats à une chimiothérapie intensive .......................... 11 1.2.3 La résistance et la rechute ....................................................................................... 12 1.4 Caractérisation d’un nouveau candidat thérapeutique ................................................. 12 1.4.1 La protéine KIF20A ................................................................................................... 13 1.5 Les différents types de mort cellulaire programmée ..................................................... 13 1.5.1 L’apoptose cellulaire ................................................................................................ 13 1.5.1.1 Les caspases ...................................................................................................... 15 1.5.2 La nécrose et la nécroptose cellulaire ..................................................................... 17 1.5.3 L’autophagie ............................................................................................................ 18 1.5.4 La ferroptose ............................................................................................................ 18 1.5.5 Tableau récapitulatif ................................................................................................ 19 2. Objectifs et stratégies .......................................................................................................... 19 3. Matériel et méthodes........................................................................................................... 20 3.1 Mise en culture des cellules et suivi de leur développement ........................................ 20 3.1.1 Protocole de décongélation des cellules ................................................................. 21 3.1.2 Protocole de comptage des cellules ........................................................................ 21 3.2 Réactifs utilisés (drogues et inhibiteurs) ........................................................................ 22 3.3 Test de cytotoxicité ........................................................................................................ 23 3.4 Temps de doublement cellulaire .................................................................................... 26 6 3.5 Test d’activation des caspases 3/7 ................................................................................. 27 3.6 Quantification de l’ARNm codant pour KIF20A par RT-qPCR ......................................... 29 3.7 Analyse de l’apoptose par cytométrie de flux ................................................................ 35 4. Résultats et discussions ........................................................................................................ 38 4.1 Détermination des EC50 de DCR sur les lignées cellulaires ........................................... 38 4.2 Détermination de l’EC50 du DCR sur les cellules issues de PDX de LAM ....................... 40 4.3 Temps de doublement des 4 lignées cellulaires étudiées .............................................. 42 4.4 Analyse de l’apoptose cellulaire en cytométrie de flux sur les MOLM-14 et les THP-1 44 4.5 Test d’activation des caspases 3/7 sur les MOLM-14 et les THP-1 ................................ 48 4.6 Analyse de l’expression de l’ARNm codant pour KIF20A dans les PDX issues de LAM, les lignées cellulaires et les cellules non cancéreuses ............................................................... 50 5. Conclusion ............................................................................................................................ 58 6. Liste des abréviations ........................................................................................................... 59 8. Bibliographie ........................................................................................................................ 60 9. Annexes ................................................................................................................................ 63 Résumé ..................................................................................................................................... 68 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105767 Evaluation pré-clinique in- vitro d’un potentiel candidat thérapeutique anti- leucémique [TFE / Mémoire] / Elyse Fievet, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2022. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La leucémie aigüe myéloïde (LAM) est une forme sévère de cancer des cellules hématopoïétiques touchant la moelle osseuse et les organes lymphoïdes. C’est la forme de leucémie aigüe la plus répandue chez les personnes âgées. Le traitement de première intention repose sur une chimiothérapie intensive pour les patients les plus jeunes et sur l’association d’un agent hypométhylant et d’un inhibiteur de la protéine BCL2 pour les patients les plus âgés ou avec des comorbidités les rendant inéligible pour la chimiothérapie intensive. Les taux de rémission complète varient en fonction du sous-groupe mais sont d’environ 50% avec une médiane de survie comprise entre 3 et 24 mois. Face à ces résultats préoccupants, il est primordial de trouver de nouvelles approches thérapeutiques afin d’augmenter les chances de guérison. Ce travail est basé sur la recherche d’un potentiel candidat thérapeutique efficace contre la leucémie myéloïde aiguë. Dans un premier temps, il a été nécessaire de déterminer si la drogue étudiée avait un effet de cytotoxicité sur les cellules leucémiques d’abord issues de lignées cellulaires établies en culture permanente in vitro, puis sur des cellules issues d’échantillons sanguins de patients atteints de leucémie. Après diverses expériences, il a été possible de déterminer que la cytotoxicité de la drogue variait de 0,05 μM à 0,020 μM selon la lignée cellulaire étudiée et de 0,05 μM à 0,50 μM selon le type de PDX utilisé. Une fois l’action cytotoxique déterminée, diverses expérimentations ont été réalisées afin de déterminer quelle voie de mort cellulaire les cellules cancéreuses empruntaient sous l’action de la drogue. La conclusion sortant de ces expérimentations est que l’inhibition des caspases permet de diminuer la mort cellulaire de près de 20% en faveur d’une activation de l’apoptose cellulaire. Enfin, la détermination et la quantification de l’expression de l’ARNm codant pour la protéine cible de cette drogue a été réalisée sur lignées cellulaires, leucémies primaires issues de patients et sur cellules non malignes. Suite à cette expérimentation, il a été possible de démontrer que l’expression de la protéine KIF20A n’est pas associée à une meilleure efficacité de la molécule étudiée. Suite à ces nombreuses et diverses analyses, on peut en conclure que le DCR, potentiel candidat thérapeutique, est prometteur pour le traitement des LAM Note de contenu : 5 Table des matières Remerciements .......................................................................................................................... 4 Table des matières ..................................................................................................................... 5 Présentation du lieu de stage..................................................................................................... 7 1. Introduction théorique ........................................................................................................... 8 1.1 Le cancer et la leucémie myéloïde aiguë.......................................................................... 8 1.1.1 L’incidence du cancer................................................................................................. 8 1.1.2 Les différents types de cancers.................................................................................. 8 1.1.3 La leucémie aiguë myéloïde (LAM) ............................................................................ 9 1.1.3.1 La leucémie en général ....................................................................................... 9 1.1.3.2 La LAM ............................................................................................................... 10 1.2 Traitements actuels d’une LAM...................................................................................... 10 1.2.1 Pour des patients médicalement en bon état général ............................................ 11 1.2.2 Pour des patients non candidats à une chimiothérapie intensive .......................... 11 1.2.3 La résistance et la rechute ....................................................................................... 12 1.4 Caractérisation d’un nouveau candidat thérapeutique ................................................. 12 1.4.1 La protéine KIF20A ................................................................................................... 13 1.5 Les différents types de mort cellulaire programmée ..................................................... 13 1.5.1 L’apoptose cellulaire ................................................................................................ 13 1.5.1.1 Les caspases ...................................................................................................... 15 1.5.2 La nécrose et la nécroptose cellulaire ..................................................................... 17 1.5.3 L’autophagie ............................................................................................................ 18 1.5.4 La ferroptose ............................................................................................................ 18 1.5.5 Tableau récapitulatif ................................................................................................ 19 2. Objectifs et stratégies .......................................................................................................... 19 3. Matériel et méthodes........................................................................................................... 20 3.1 Mise en culture des cellules et suivi de leur développement ........................................ 20 3.1.1 Protocole de décongélation des cellules ................................................................. 21 3.1.2 Protocole de comptage des cellules ........................................................................ 21 3.2 Réactifs utilisés (drogues et inhibiteurs) ........................................................................ 22 3.3 Test de cytotoxicité ........................................................................................................ 23 3.4 Temps de doublement cellulaire .................................................................................... 26 6 3.5 Test d’activation des caspases 3/7 ................................................................................. 27 3.6 Quantification de l’ARNm codant pour KIF20A par RT-qPCR ......................................... 29 3.7 Analyse de l’apoptose par cytométrie de flux ................................................................ 35 4. Résultats et discussions ........................................................................................................ 38 4.1 Détermination des EC50 de DCR sur les lignées cellulaires ........................................... 38 4.2 Détermination de l’EC50 du DCR sur les cellules issues de PDX de LAM ....................... 40 4.3 Temps de doublement des 4 lignées cellulaires étudiées .............................................. 42 4.4 Analyse de l’apoptose cellulaire en cytométrie de flux sur les MOLM-14 et les THP-1 44 4.5 Test d’activation des caspases 3/7 sur les MOLM-14 et les THP-1 ................................ 48 4.6 Analyse de l’expression de l’ARNm codant pour KIF20A dans les PDX issues de LAM, les lignées cellulaires et les cellules non cancéreuses ............................................................... 50 5. Conclusion ............................................................................................................................ 58 6. Liste des abréviations ........................................................................................................... 59 8. Bibliographie ........................................................................................................................ 60 9. Annexes ................................................................................................................................ 63 Résumé ..................................................................................................................................... 68 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105767

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