Contribution au développement d’essais enzymatiques permettant d’établir le profil de sélectivité d’inhibiteurs du facteur XIIa / Julien Hermant

Public ISBD Titre : Contribution au développement d’essais enzymatiques permettant d’établir le profil de sélectivité d’inhibiteurs du facteur XIIa Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Julien Hermant, Auteur ; Caroline Charlier, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2022 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le facteur XII est une protéine plasmatique impliquée dans la coagulation, l’inflammation et l’immunité innée. Celui-ci peut être activé en facteur XIIa, une protéase à sérine du groupe S1A. Le facteur XIIa s’est révélé impliqué dans diverses pathologies telles que les thromboses induites par les surfaces artificielles, l’angio-œdème héréditaire, la maladie d’Alzheimer ou encore la sclérose en plaques. Ce manuscrit aborde les protéases à sérines et plus particulièrement leur spécificité, la mise en œuvre de tests enzymatiques et le développement de tests d’inhibition dans le but final d’établir un profil de sélectivité de composés inhibiteurs vis-à-vis du facteur XIIa. Les tests enzymatiques ont été développés pour 5 enzymes. Des mesures d’activité ont été effectuées pour 5 fragments et 10 molécules de faible poids moléculaire synthétisées à partir de modifications d’un composé, RF1. Les résultats des expérimentations sur ces molécules ont permis d’observer qu’elles présentent une activité considérable sur le facteur XIIa ainsi qu’une sélectivité par rapport aux enzymes proches. Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage .............................................................................. 7 Introduction générale .......................................................................................... 8 Partie théorique .................................................................................................. 9 1. Facteur XII ..........................................................................................................9 1.1. Généralités ...................................................................................................................... 9 1.2. Rôles physiologiques de FXII ......................................................................................... 10 1.3. Indications potentielles d’inhibiteurs du FXIIa.............................................................. 11 2. Les protéases ....................................................................................................14 2.1. Introduction................................................................................................................... 14 2.2. Les protéases à sérine ................................................................................................... 14 2.3. Structure des protéases à sérine................................................................................... 15 2.3.1. Les composantes catalytiques .................................................................................. 15 2.3.2. Les sites de reconnaissance du substrat .................................................................. 16 2.3.3. Le domaine d’activation du zymogène .................................................................... 18 3. Tests de cinétiques enzymatiques .....................................................................18 3.1. Concept ......................................................................................................................... 18 3.2. Mesure de la vitesse initiale .......................................................................................... 20 3.3. Détermination de Km et Vmax ......................................................................................... 20 3.4. Facteurs influençant la cinétique enzymatique ............................................................ 22 4. Les inhibiteurs ..................................................................................................23 4.1. Les types d’inhibiteurs .................................................................................................. 23 4.2. KD vs Ki vs IC50 ................................................................................................................ 24 4.3. Détermination des IC50 .................................................................................................. 25 4.4. Influence de [S] et Km sur l’IC50 ...................................................................................... 27 5. Sélectivité .........................................................................................................28 5.1. Introduction................................................................................................................... 28 5.2. Profil de sélectivité ........................................................................................................ 29 6. Objectifs et stratégie ......................................................................................... 30 Partie pratique ...................................................................................................33 7. Matériel et méthode ......................................................................................... 33 7.1. Produits chimiques et réactifs....................................................................................... 33 7.2. Tests chromogéniques .................................................................................................. 34 7.2.1. Principe général ........................................................................................................ 34 7.2.2. Instrumentation........................................................................................................ 34 7.2.3. Procédure pour le test initial .................................................................................... 34 7.2.4. Procédure pour la détermination de Km .................................................................. 35 7.2.5. Procédure pour le test de vérification de stabilité................................................... 35 7.2.6. Procédure pour le test d’inhibition .......................................................................... 36 7.2.7. Procédure pour la détermination d’IC50 ................................................................... 36 7.3. Analyse des données ..................................................................................................... 36 8. Résultats et discussion ...................................................................................... 37 8.1. Etude enzymatique ....................................................................................................... 40 8.1.1. Méthodologie ........................................................................................................... 41 8.1.1.1. Test initial ........................................................................................................ 41 8.1.1.2. Détermination du Km....................................................................................... 41 8.1.1.3. Vérification de stabilité ................................................................................... 42 8.1.2. Résultats des tests enzymatiques ............................................................................ 42 8.1.2.1. Facteur XIIa ..................................................................................................... 42 8.1.2.2. Chymotrypsine ................................................................................................ 44 8.1.2.3. Thrombine....................................................................................................... 46 8.1.2.4. tPA ................................................................................................................... 48 8.1.2.5. Trypsine........................................................................................................... 50 8.1.2.6. Kallikréine ....................................................................................................... 52 8.2. Etude de l’inhibition et du profil de sélectivité ............................................................. 54 8.2.1. Méthodologie ........................................................................................................... 54 8.2.1.1. Tests d’inhibition............................................................................................. 54 8.2.1.2. Détermination d’IC50 ....................................................................................... 55 8.2.2. Représentation des courbes IC50 .............................................................................. 55 8.2.3. Comparaison des Ki de BZM ..................................................................................... 57 8.2.4. Résultats des courbes d’IC50 ..................................................................................... 57 Conclusion et perspectives ..................................................................................62 Liste des figures..................................................................................................63 Liste des tableaux...............................................................................................65 Liste des abréviations .........................................................................................65 Bibliographie .....................................................................................................66 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105763 Contribution au développement d’essais enzymatiques permettant d’établir le profil de sélectivité d’inhibiteurs du facteur XIIa [TFE / Mémoire] / Julien Hermant, Auteur ; Caroline Charlier, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2022. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le facteur XII est une protéine plasmatique impliquée dans la coagulation, l’inflammation et l’immunité innée. Celui-ci peut être activé en facteur XIIa, une protéase à sérine du groupe S1A. Le facteur XIIa s’est révélé impliqué dans diverses pathologies telles que les thromboses induites par les surfaces artificielles, l’angio-œdème héréditaire, la maladie d’Alzheimer ou encore la sclérose en plaques. Ce manuscrit aborde les protéases à sérines et plus particulièrement leur spécificité, la mise en œuvre de tests enzymatiques et le développement de tests d’inhibition dans le but final d’établir un profil de sélectivité de composés inhibiteurs vis-à-vis du facteur XIIa. Les tests enzymatiques ont été développés pour 5 enzymes. Des mesures d’activité ont été effectuées pour 5 fragments et 10 molécules de faible poids moléculaire synthétisées à partir de modifications d’un composé, RF1. Les résultats des expérimentations sur ces molécules ont permis d’observer qu’elles présentent une activité considérable sur le facteur XIIa ainsi qu’une sélectivité par rapport aux enzymes proches. Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage .............................................................................. 7 Introduction générale .......................................................................................... 8 Partie théorique .................................................................................................. 9 1. Facteur XII ..........................................................................................................9 1.1. Généralités ...................................................................................................................... 9 1.2. Rôles physiologiques de FXII ......................................................................................... 10 1.3. Indications potentielles d’inhibiteurs du FXIIa.............................................................. 11 2. Les protéases ....................................................................................................14 2.1. Introduction................................................................................................................... 14 2.2. Les protéases à sérine ................................................................................................... 14 2.3. Structure des protéases à sérine................................................................................... 15 2.3.1. Les composantes catalytiques .................................................................................. 15 2.3.2. Les sites de reconnaissance du substrat .................................................................. 16 2.3.3. Le domaine d’activation du zymogène .................................................................... 18 3. Tests de cinétiques enzymatiques .....................................................................18 3.1. Concept ......................................................................................................................... 18 3.2. Mesure de la vitesse initiale .......................................................................................... 20 3.3. Détermination de Km et Vmax ......................................................................................... 20 3.4. Facteurs influençant la cinétique enzymatique ............................................................ 22 4. Les inhibiteurs ..................................................................................................23 4.1. Les types d’inhibiteurs .................................................................................................. 23 4.2. KD vs Ki vs IC50 ................................................................................................................ 24 4.3. Détermination des IC50 .................................................................................................. 25 4.4. Influence de [S] et Km sur l’IC50 ...................................................................................... 27 5. Sélectivité .........................................................................................................28 5.1. Introduction................................................................................................................... 28 5.2. Profil de sélectivité ........................................................................................................ 29 6. Objectifs et stratégie ......................................................................................... 30 Partie pratique ...................................................................................................33 7. Matériel et méthode ......................................................................................... 33 7.1. Produits chimiques et réactifs....................................................................................... 33 7.2. Tests chromogéniques .................................................................................................. 34 7.2.1. Principe général ........................................................................................................ 34 7.2.2. Instrumentation........................................................................................................ 34 7.2.3. Procédure pour le test initial .................................................................................... 34 7.2.4. Procédure pour la détermination de Km .................................................................. 35 7.2.5. Procédure pour le test de vérification de stabilité................................................... 35 7.2.6. Procédure pour le test d’inhibition .......................................................................... 36 7.2.7. Procédure pour la détermination d’IC50 ................................................................... 36 7.3. Analyse des données ..................................................................................................... 36 8. Résultats et discussion ...................................................................................... 37 8.1. Etude enzymatique ....................................................................................................... 40 8.1.1. Méthodologie ........................................................................................................... 41 8.1.1.1. Test initial ........................................................................................................ 41 8.1.1.2. Détermination du Km....................................................................................... 41 8.1.1.3. Vérification de stabilité ................................................................................... 42 8.1.2. Résultats des tests enzymatiques ............................................................................ 42 8.1.2.1. Facteur XIIa ..................................................................................................... 42 8.1.2.2. Chymotrypsine ................................................................................................ 44 8.1.2.3. Thrombine....................................................................................................... 46 8.1.2.4. tPA ................................................................................................................... 48 8.1.2.5. Trypsine........................................................................................................... 50 8.1.2.6. Kallikréine ....................................................................................................... 52 8.2. Etude de l’inhibition et du profil de sélectivité ............................................................. 54 8.2.1. Méthodologie ........................................................................................................... 54 8.2.1.1. Tests d’inhibition............................................................................................. 54 8.2.1.2. Détermination d’IC50 ....................................................................................... 55 8.2.2. Représentation des courbes IC50 .............................................................................. 55 8.2.3. Comparaison des Ki de BZM ..................................................................................... 57 8.2.4. Résultats des courbes d’IC50 ..................................................................................... 57 Conclusion et perspectives ..................................................................................62 Liste des figures..................................................................................................63 Liste des tableaux...............................................................................................65 Liste des abréviations .........................................................................................65 Bibliographie .....................................................................................................66 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105763

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