Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur des cellules A549 après irradiation par des rayons X. / Christopher Bond

Public ISBD Titre : Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur des cellules A549 après irradiation par des rayons X. Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Christopher Bond, Auteur ; Thierry Arnould, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2022 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : UNamur  Laboratoire D’analyse par Reactions Nucleaires (LARN) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le cancer est une maladie connue de notre société et responsable de nombreuses morts. La cause : des mutations au niveau de l’ADN cellulaire menant à une prolifération anarchique et abondante de cellules anormales. Pour traiter ces cellules, des techniques de radiothérapie usant de rayons X ont vu le jour. Une étude récente réalisé par W.Wai-Ying Kam et Richard B. Banati a montré que la pensée initiale dans laquelle les dommages à l’ADN nucléaire était seuls responsables de la mort cellulaire suivant une irradiation ionisante n’était pas tout à fait juste. En effet, dans les cellules existent des organites appelés mitochondries, qui interviennent dans la survie cellulaire. Il est possible que des dommages au niveau de l’ADN mitochondrial ou de la structure de la mitochondrie provoquent l’augmentation de stress oxydatif risquant d’initier la mort cellulaire. Afin de préserver l’intégrité des organites, les mitochondries mettent en place divers mécanismes de biogenèse pour reformer de nouvelles mitochondries et de dégradation pour remplacer celles qui ont été endommagées. L’objectif de ce travail de fin d’étude s’intègre dans un projet portant sur l’étude du mécanisme de mitophagie et de biogenèse mitochondriale après irradiation par des protons sur des cellules cancéreuses. Dans ce contexte, la mitophagie agirait comme un processus cyto-protecteur et empêcherait le relargage de molécules sources de dommages à la cellule, provenant des mitochondries abimées. Une stratégie de traitement pourrait être d’inhiber la mitophagie dans les cellules cancéreuses de manière à accroitre la mortalité des cellules. Ce TFE aura pour but la mise en place de protocoles expérimentaux explorant l’autophagie, à l’aide de marqueurs spécifiques tels que LC3-I/II et p62, et l’abondance mitochondriale via le marquage de TOM20 et du complexe OXPHOS présents sur les membranes de la mitochondrie, ainsi que par une quantification d’ADN mitochondrial par qPCR. L’ensemble des manipulations sera réalisé sur des cellules cancéreuses A549 au cours du temps et après exposition à des rayons X, plus adaptés pour des mises au point rapides. Les résultats obtenus ont montré qu’il existait un possible lien entre l’impact des rayons X et l’augmentation du nombre d’autophagosomes dans les cellules au cours du temps. Toutefois, la manipulation a révélé la présence d’autophagie basale dans les cellules non-traitées, rendant l’analyse d’une tendance sur l’autophagie délicate. Les autres résultats portant sur l’abondance mitochondriale, basés sur deux manipulations distinctes, montrent une discordance. D’une part l’impact des rayons X semble entraîner une diminution de l’abondance de TOM20 et du complexe OXPHOS dans les premières 24H suivant le traitement et d’’autre part, on observe une tendance opposée avec une augmentation de la quantité d’ADN mitochondrial dans les cellules. Deux hypothèses sont possibles pour expliquer cet évènement. Premièrement, on suppose que ce phénomène repose sur les timings, supposés différents, entre la synthèse d’ADN mitochondrial et celle de la membrane mitochondriale. La deuxième hypothèse suggère que le mécanisme de biogenèse est incomplet et que la réparation des dommages causés par les radiations ne reposerait que sur la synthèse de l’ADN mitochondrial. Note de contenu : 3 TABLE DES MATIERES 1 Présentation du lieu de stage................................................................................................................................... 1 1.1 L’Université de Namur- L’UNAMUR ................................................................................................................ 1 1.2 Laboratoire d’Analyse par Réactions Nucléaires (LARN) ................................................................................ 1 1.3 Unité de Recherche en Biologie Cellulaire animale (URBC) ........................................................................... 1 2 Contexte général ..................................................................................................................................................... 3 2.1 Le cancer - généralités .................................................................................................................................... 3 2.2 Epidémiologie ................................................................................................................................................. 6 2.3 Traitements et prophylaxie ............................................................................................................................ 7 2.4 les différentes formes de radiothérapie ......................................................................................................... 8 2.5 Rayons X........................................................................................................................................................ 10 2.5.1 Les photons et leurs interactions avec la matière ................................................................................ 10 2.5.2 Production de rayons X ......................................................................................................................... 11 2.5.3 Impact des rayons X sur la matière ...................................................................................................... 12 2.6 Conséquence d’une irradiation sur une cellule ............................................................................................ 13 2.6.1 Phase physique ..................................................................................................................................... 14 2.6.2 Phase chimique ..................................................................................................................................... 14 2.6.3 Phase biologique ................................................................................................................................... 16 2.7 Mort cellulaire .............................................................................................................................................. 17 2.7.1 Autophagie ........................................................................................................................................... 17 2.8 La mitochondrie ............................................................................................................................................ 20 2.8.1 Origine et structure .............................................................................................................................. 20 2.8.2 Les mécanismes de contrôle mis en place par la mitochondrie ........................................................... 23 2.9 Etude ayant déjà traité des effets de rayons x sur l’abondance mitochondriale ......................................... 26 3 objectifs et stratégie .............................................................................................................................................. 28 4 matériel et méthodes ............................................................................................................................................. 29 I. CHAPITRE 1 : PRODUCTION ET IRRADIATION DES CELLULES A549 .................................................................. 29 II. CHAPITRE 2 : extraction et détermination de la concentration en protéines .................................................. 33 III. CHAPITRE 3 : quantification de la protéine d’intérêt par Western blot ....................................................... 35 Préparation des gels pour l’électrophorèse ............................................................................................................ 36 Préparation des échantillons pour l’électrophorèse .............................................................................................. 37 Migration des protéines sur gel ............................................................................................................................... 37 Transfert humide des protéines sur membrane solide .......................................................................................... 38 4 IV. CHAPITRE 4 : rapport de la quantité ADNmt sur ADNn par une quantitative polymérase chain réaction (qPCR) 41 5 Résultats et discussion .......................................................................................................................................... 46 5.1 Mise en place des conditions expérimentales pour les manipulations western blot .................................. 46 5.1.1 Résultats de la mise au point des conditions expérimentales ........................................................... 47 5.2 Détermination des conditions optimales (Dose et timing) pour une signature d’autophagie/mitophagie. 50 .................................................................................................................................................................................. 53 5.3 Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur cellules A549 avec marquage de TOM20 et OXPHOS sur Western Blot ............................................................................................................................................................. 54 5.4 Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur cellules A549 avec rapport ADNmt sur ADNn par qPCR. 57 6 Conclusion et perspective..................................................................................................................................... 61 7 Liste des abréviations ........................................................................................................................................... 63 8 Bibliographie ......................................................................................................................................................... 67 9 ANNEXE ................................................................................................................................................................. 70 10 Résumé ................................................................................................................................................................. 81 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105746 Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur des cellules A549 après irradiation par des rayons X. [TFE / Mémoire] / Christopher Bond, Auteur ; Thierry Arnould, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2022. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : UNamur  Laboratoire D’analyse par Reactions Nucleaires (LARN) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le cancer est une maladie connue de notre société et responsable de nombreuses morts. La cause : des mutations au niveau de l’ADN cellulaire menant à une prolifération anarchique et abondante de cellules anormales. Pour traiter ces cellules, des techniques de radiothérapie usant de rayons X ont vu le jour. Une étude récente réalisé par W.Wai-Ying Kam et Richard B. Banati a montré que la pensée initiale dans laquelle les dommages à l’ADN nucléaire était seuls responsables de la mort cellulaire suivant une irradiation ionisante n’était pas tout à fait juste. En effet, dans les cellules existent des organites appelés mitochondries, qui interviennent dans la survie cellulaire. Il est possible que des dommages au niveau de l’ADN mitochondrial ou de la structure de la mitochondrie provoquent l’augmentation de stress oxydatif risquant d’initier la mort cellulaire. Afin de préserver l’intégrité des organites, les mitochondries mettent en place divers mécanismes de biogenèse pour reformer de nouvelles mitochondries et de dégradation pour remplacer celles qui ont été endommagées. L’objectif de ce travail de fin d’étude s’intègre dans un projet portant sur l’étude du mécanisme de mitophagie et de biogenèse mitochondriale après irradiation par des protons sur des cellules cancéreuses. Dans ce contexte, la mitophagie agirait comme un processus cyto-protecteur et empêcherait le relargage de molécules sources de dommages à la cellule, provenant des mitochondries abimées. Une stratégie de traitement pourrait être d’inhiber la mitophagie dans les cellules cancéreuses de manière à accroitre la mortalité des cellules. Ce TFE aura pour but la mise en place de protocoles expérimentaux explorant l’autophagie, à l’aide de marqueurs spécifiques tels que LC3-I/II et p62, et l’abondance mitochondriale via le marquage de TOM20 et du complexe OXPHOS présents sur les membranes de la mitochondrie, ainsi que par une quantification d’ADN mitochondrial par qPCR. L’ensemble des manipulations sera réalisé sur des cellules cancéreuses A549 au cours du temps et après exposition à des rayons X, plus adaptés pour des mises au point rapides. Les résultats obtenus ont montré qu’il existait un possible lien entre l’impact des rayons X et l’augmentation du nombre d’autophagosomes dans les cellules au cours du temps. Toutefois, la manipulation a révélé la présence d’autophagie basale dans les cellules non-traitées, rendant l’analyse d’une tendance sur l’autophagie délicate. Les autres résultats portant sur l’abondance mitochondriale, basés sur deux manipulations distinctes, montrent une discordance. D’une part l’impact des rayons X semble entraîner une diminution de l’abondance de TOM20 et du complexe OXPHOS dans les premières 24H suivant le traitement et d’’autre part, on observe une tendance opposée avec une augmentation de la quantité d’ADN mitochondrial dans les cellules. Deux hypothèses sont possibles pour expliquer cet évènement. Premièrement, on suppose que ce phénomène repose sur les timings, supposés différents, entre la synthèse d’ADN mitochondrial et celle de la membrane mitochondriale. La deuxième hypothèse suggère que le mécanisme de biogenèse est incomplet et que la réparation des dommages causés par les radiations ne reposerait que sur la synthèse de l’ADN mitochondrial. Note de contenu : 3 TABLE DES MATIERES 1 Présentation du lieu de stage................................................................................................................................... 1 1.1 L’Université de Namur- L’UNAMUR ................................................................................................................ 1 1.2 Laboratoire d’Analyse par Réactions Nucléaires (LARN) ................................................................................ 1 1.3 Unité de Recherche en Biologie Cellulaire animale (URBC) ........................................................................... 1 2 Contexte général ..................................................................................................................................................... 3 2.1 Le cancer - généralités .................................................................................................................................... 3 2.2 Epidémiologie ................................................................................................................................................. 6 2.3 Traitements et prophylaxie ............................................................................................................................ 7 2.4 les différentes formes de radiothérapie ......................................................................................................... 8 2.5 Rayons X........................................................................................................................................................ 10 2.5.1 Les photons et leurs interactions avec la matière ................................................................................ 10 2.5.2 Production de rayons X ......................................................................................................................... 11 2.5.3 Impact des rayons X sur la matière ...................................................................................................... 12 2.6 Conséquence d’une irradiation sur une cellule ............................................................................................ 13 2.6.1 Phase physique ..................................................................................................................................... 14 2.6.2 Phase chimique ..................................................................................................................................... 14 2.6.3 Phase biologique ................................................................................................................................... 16 2.7 Mort cellulaire .............................................................................................................................................. 17 2.7.1 Autophagie ........................................................................................................................................... 17 2.8 La mitochondrie ............................................................................................................................................ 20 2.8.1 Origine et structure .............................................................................................................................. 20 2.8.2 Les mécanismes de contrôle mis en place par la mitochondrie ........................................................... 23 2.9 Etude ayant déjà traité des effets de rayons x sur l’abondance mitochondriale ......................................... 26 3 objectifs et stratégie .............................................................................................................................................. 28 4 matériel et méthodes ............................................................................................................................................. 29 I. CHAPITRE 1 : PRODUCTION ET IRRADIATION DES CELLULES A549 .................................................................. 29 II. CHAPITRE 2 : extraction et détermination de la concentration en protéines .................................................. 33 III. CHAPITRE 3 : quantification de la protéine d’intérêt par Western blot ....................................................... 35 Préparation des gels pour l’électrophorèse ............................................................................................................ 36 Préparation des échantillons pour l’électrophorèse .............................................................................................. 37 Migration des protéines sur gel ............................................................................................................................... 37 Transfert humide des protéines sur membrane solide .......................................................................................... 38 4 IV. CHAPITRE 4 : rapport de la quantité ADNmt sur ADNn par une quantitative polymérase chain réaction (qPCR) 41 5 Résultats et discussion .......................................................................................................................................... 46 5.1 Mise en place des conditions expérimentales pour les manipulations western blot .................................. 46 5.1.1 Résultats de la mise au point des conditions expérimentales ........................................................... 47 5.2 Détermination des conditions optimales (Dose et timing) pour une signature d’autophagie/mitophagie. 50 .................................................................................................................................................................................. 53 5.3 Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur cellules A549 avec marquage de TOM20 et OXPHOS sur Western Blot ............................................................................................................................................................. 54 5.4 Caractérisation de l’abondance mitochondriale sur cellules A549 avec rapport ADNmt sur ADNn par qPCR. 57 6 Conclusion et perspective..................................................................................................................................... 61 7 Liste des abréviations ........................................................................................................................................... 63 8 Bibliographie ......................................................................................................................................................... 67 9 ANNEXE ................................................................................................................................................................. 70 10 Résumé ................................................................................................................................................................. 81 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105746

Exemplaires

Cote	Support	Localisation	Section	Disponibilité
aucun exemplaire

---

1 (1 - 1 / 1)