Étude des systèmes de réponse aux stress d’enveloppe chez Brucella abortus / Marine Van Der Gucht

Public ISBD Titre : Étude des systèmes de réponse aux stress d’enveloppe chez Brucella abortus Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Marine Van Der Gucht, Auteur ; Gaël Gilbert, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Université de Namur  BRUCELLOSE BOVINE  Brucella abortus Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Brucella abortus est un pathogène intracellulaire facultativement extracellulaire provoquant la brucellose chez les bovins et entrainant des avortements. Une fois l’animal testé positif, tout le troupeau est abattu. Cela engendre donc des pertes économiques importantes dans les pays endémiques. De surcroit, lors de l’évolution, les bactéries ont développé des mécanismes, des systèmes de réponse afin de survivre et de proliférer dans un environnement représentant un stress pour elles, notamment un stress perturbant l’enveloppe bactérienne. Il est donc important d’étudier ces systèmes afin d’approfondir les connaissances sur la bactérie pour ainsi mieux contrôler les infections et les pertes économiques que cela engendre. Ce travail de fin d’étude aborde l’éventuelle intervention du système à deux composants, BvrR/BvrS dans la réponse aux stress d’enveloppe chez B. abortus et la caractérisation d’une potentielle interaction entre les protéines ExoR et BvrS. Afin d’y parvenir, une surexpression de ces deux protéines a été réalisée chez B. abortus. Les mutants de surexpression ont ensuite été déposés sur un milieu avec et sans stress d’enveloppe afin d’observer une éventuelle différence de croissance. Ces protéines ont également été fusionnées à des protéines fluorescentes afin d’être visualisées au microscope à fluorescence permettant l’étude de la localisation de ces protéines et d’une éventuelle co-localisation de celles-ci, qui pourrait indiquer une potentielle interaction entre ces deux protéines. Il a premièrement été démontré que la surexpression de BvrS induisait des différences de croissance des clones lorsqu’ils sont soumis à un stress d’enveloppe, ce qui atteste que BvrS joue un rôle dans la réponse de la bactérie face à ce type de stress ou du moins qu’il perturbe sa croissance. La surexpression d’ExoR semble quant à elle montrer une légère amélioration de croissance, celle-ci n’étant cependant pas confirmée par les CFU obtenus. La localisation et la co-localisation des protéines n’ont pas pu être mises en évidence car aucune fluorescence n’a été obtenue. Les hypothèses qui ont alors été émises est que l’expression des protéines par la bactérie est peut-être trop faible pour observer une fluorescence ou qu’il y a un problème au niveau des constructions. Pour vérifier cela, une surexpression des protéines de fusion a été testée. Cependant, les transformations n’étant pas concluantes, la seconde hypothèse émise est que les protéines surexprimées sont peut-être toxiques pour la bactérie. Le bilan de ce travail démontre donc que le système BvrS/BvrR serait impliqué dans la réponse au stress d’enveloppe chez B. abortus. L’interaction avec ExoR n’ayant pas pu être mise en évidence, des méthodes sont proposées afin d’y remédier. L’utilisation d’un plasmide inductible d’une part permettra d’exprimer les protéines à un moment voulu, réglant le problème de toxicité. D’autre part, le remplacement génomique du promoteur de BvrS et d’ExoR par un promoteur plus fort permettra de surexprimer la protéine d’un point de vue génomique. Note de contenu : Tables des matières Remerciements .................................................................................................................... Présentation du lieu de stage ............................................................................................. 8 Introduction générale ........................................................................................................ 9 I. Partie théorique ........................................................................................................11 1. Généralités....................................................................................................................... 11 2. Mode d’infection cellulaire de Brucella spp..................................................................... 13 2.1. Cycle de vie intracellulaire de Brucella spp. .................................................................................14 3. Les systèmes de réponse aux stress d’enveloppe chez Escherichia coli ........................... 15 3.1. Les systèmes dépendant d’un facteur sigma..................................................................................16 3.2. Les systèmes à deux composants (TCS)........................................................................................17 4. Le système BvrR/BvrS .................................................................................................... 18 4.1. Rôle et fonctionnement du système BvrR/BvrS ............................................................................19 4.2. Interaction d’ExoR avec le système BvrR/BvrS ? .........................................................................20 5. La double recombinaison homologue.............................................................................. 21 II. Partie pratique ......................................................................................................24 1. Objectifs et stratégie........................................................................................................ 24 2. Matériel ........................................................................................................................... 24 2.1. Les constructions ...........................................................................................................................24 2.2. Les plasmides ................................................................................................................................27 2.2.1. Le pNPTS 138 ..........................................................................................................................29 2.2.2. Le pBBR ...................................................................................................................................30 2.2.3. Le pGem ...................................................................................................................................31 2.2.4. Le pMR10.................................................................................................................................32 2.3. Les enzymes de restriction ............................................................................................................32 2.4. Les souches bactériennes...............................................................................................................34 2.4.1. Escherichia coli.........................................................................................................................34 2.4.1.1. DH10B ............................................................................................................................35 2.4.1.2. S17-1 ...............................................................................................................................35 2.4.2. Brucella abortus 544 .................................................................................................................35 3. Méthodes ......................................................................................................................... 36 3.1. La PCR ..........................................................................................................................................36 3.1.1. La PCR préparatrice..................................................................................................................37 3.1.2. La PCR jointive ........................................................................................................................37 3.1.3. La PCR de diagnostic ...............................................................................................................38 3.2. Électrophorèse ...............................................................................................................................39 3.3. La purification ...............................................................................................................................39 3.4. La restriction..................................................................................................................................40 3.5. La ligation......................................................................................................................................41 3.6. La transformation ..........................................................................................................................41 3.6.1. La transformation par choc thermique ......................................................................................41 3.7. Sélection des transformants : test blanc/bleu .................................................................................42 3.8. Extraction d’ADN plasmidique .....................................................................................................43 3.9. La conjugaison...............................................................................................................................43 3.10. La microscopie à fluorescence.......................................................................................................44 3.10.1. Principe ................................................................................................................................45 3.11. Le western blot ..............................................................................................................................46 3.11.1. Principe ................................................................................................................................47 4. Résultats et discussion ..................................................................................................... 49 4.1. Surexpression d’ExoR et BvrS ......................................................................................................49 4.2. Construction des protéines de fusion .............................................................................................54 4.3. Transformation en DH10B ............................................................................................................56 4.4. PCR de diagnostic des thermolysats..............................................................................................58 4.5. Observation au microscope à fluorescence....................................................................................59 4.6. Western blot ..................................................................................................................................63 4.7. Surexpression des protéines de fusion ...........................................................................................65 4.8. Amplification des séquences d’intérêt...........................................................................................65 Conclusion générale et perspectives..................................................................................69 Glossaire ..........................................................................................................................71 Liste des abréviations........................................................................................................74 Liste des tableaux .............................................................................................................77 Bibliographie....................................................................................................................78 Annexes............................................................................................................................82 Résumé.............................................................................................................................91 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100370 Étude des systèmes de réponse aux stress d’enveloppe chez Brucella abortus [TFE / Mémoire] / Marine Van Der Gucht, Auteur ; Gaël Gilbert, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Université de Namur  BRUCELLOSE BOVINE  Brucella abortus Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Brucella abortus est un pathogène intracellulaire facultativement extracellulaire provoquant la brucellose chez les bovins et entrainant des avortements. Une fois l’animal testé positif, tout le troupeau est abattu. Cela engendre donc des pertes économiques importantes dans les pays endémiques. De surcroit, lors de l’évolution, les bactéries ont développé des mécanismes, des systèmes de réponse afin de survivre et de proliférer dans un environnement représentant un stress pour elles, notamment un stress perturbant l’enveloppe bactérienne. Il est donc important d’étudier ces systèmes afin d’approfondir les connaissances sur la bactérie pour ainsi mieux contrôler les infections et les pertes économiques que cela engendre. Ce travail de fin d’étude aborde l’éventuelle intervention du système à deux composants, BvrR/BvrS dans la réponse aux stress d’enveloppe chez B. abortus et la caractérisation d’une potentielle interaction entre les protéines ExoR et BvrS. Afin d’y parvenir, une surexpression de ces deux protéines a été réalisée chez B. abortus. Les mutants de surexpression ont ensuite été déposés sur un milieu avec et sans stress d’enveloppe afin d’observer une éventuelle différence de croissance. Ces protéines ont également été fusionnées à des protéines fluorescentes afin d’être visualisées au microscope à fluorescence permettant l’étude de la localisation de ces protéines et d’une éventuelle co-localisation de celles-ci, qui pourrait indiquer une potentielle interaction entre ces deux protéines. Il a premièrement été démontré que la surexpression de BvrS induisait des différences de croissance des clones lorsqu’ils sont soumis à un stress d’enveloppe, ce qui atteste que BvrS joue un rôle dans la réponse de la bactérie face à ce type de stress ou du moins qu’il perturbe sa croissance. La surexpression d’ExoR semble quant à elle montrer une légère amélioration de croissance, celle-ci n’étant cependant pas confirmée par les CFU obtenus. La localisation et la co-localisation des protéines n’ont pas pu être mises en évidence car aucune fluorescence n’a été obtenue. Les hypothèses qui ont alors été émises est que l’expression des protéines par la bactérie est peut-être trop faible pour observer une fluorescence ou qu’il y a un problème au niveau des constructions. Pour vérifier cela, une surexpression des protéines de fusion a été testée. Cependant, les transformations n’étant pas concluantes, la seconde hypothèse émise est que les protéines surexprimées sont peut-être toxiques pour la bactérie. Le bilan de ce travail démontre donc que le système BvrS/BvrR serait impliqué dans la réponse au stress d’enveloppe chez B. abortus. L’interaction avec ExoR n’ayant pas pu être mise en évidence, des méthodes sont proposées afin d’y remédier. L’utilisation d’un plasmide inductible d’une part permettra d’exprimer les protéines à un moment voulu, réglant le problème de toxicité. D’autre part, le remplacement génomique du promoteur de BvrS et d’ExoR par un promoteur plus fort permettra de surexprimer la protéine d’un point de vue génomique. Note de contenu : Tables des matières Remerciements .................................................................................................................... Présentation du lieu de stage ............................................................................................. 8 Introduction générale ........................................................................................................ 9 I. Partie théorique ........................................................................................................11 1. Généralités....................................................................................................................... 11 2. Mode d’infection cellulaire de Brucella spp..................................................................... 13 2.1. Cycle de vie intracellulaire de Brucella spp. .................................................................................14 3. Les systèmes de réponse aux stress d’enveloppe chez Escherichia coli ........................... 15 3.1. Les systèmes dépendant d’un facteur sigma..................................................................................16 3.2. Les systèmes à deux composants (TCS)........................................................................................17 4. Le système BvrR/BvrS .................................................................................................... 18 4.1. Rôle et fonctionnement du système BvrR/BvrS ............................................................................19 4.2. Interaction d’ExoR avec le système BvrR/BvrS ? .........................................................................20 5. La double recombinaison homologue.............................................................................. 21 II. Partie pratique ......................................................................................................24 1. Objectifs et stratégie........................................................................................................ 24 2. Matériel ........................................................................................................................... 24 2.1. Les constructions ...........................................................................................................................24 2.2. Les plasmides ................................................................................................................................27 2.2.1. Le pNPTS 138 ..........................................................................................................................29 2.2.2. Le pBBR ...................................................................................................................................30 2.2.3. Le pGem ...................................................................................................................................31 2.2.4. Le pMR10.................................................................................................................................32 2.3. Les enzymes de restriction ............................................................................................................32 2.4. Les souches bactériennes...............................................................................................................34 2.4.1. Escherichia coli.........................................................................................................................34 2.4.1.1. DH10B ............................................................................................................................35 2.4.1.2. S17-1 ...............................................................................................................................35 2.4.2. Brucella abortus 544 .................................................................................................................35 3. Méthodes ......................................................................................................................... 36 3.1. La PCR ..........................................................................................................................................36 3.1.1. La PCR préparatrice..................................................................................................................37 3.1.2. La PCR jointive ........................................................................................................................37 3.1.3. La PCR de diagnostic ...............................................................................................................38 3.2. Électrophorèse ...............................................................................................................................39 3.3. La purification ...............................................................................................................................39 3.4. La restriction..................................................................................................................................40 3.5. La ligation......................................................................................................................................41 3.6. La transformation ..........................................................................................................................41 3.6.1. La transformation par choc thermique ......................................................................................41 3.7. Sélection des transformants : test blanc/bleu .................................................................................42 3.8. Extraction d’ADN plasmidique .....................................................................................................43 3.9. La conjugaison...............................................................................................................................43 3.10. La microscopie à fluorescence.......................................................................................................44 3.10.1. Principe ................................................................................................................................45 3.11. Le western blot ..............................................................................................................................46 3.11.1. Principe ................................................................................................................................47 4. Résultats et discussion ..................................................................................................... 49 4.1. Surexpression d’ExoR et BvrS ......................................................................................................49 4.2. Construction des protéines de fusion .............................................................................................54 4.3. Transformation en DH10B ............................................................................................................56 4.4. PCR de diagnostic des thermolysats..............................................................................................58 4.5. Observation au microscope à fluorescence....................................................................................59 4.6. Western blot ..................................................................................................................................63 4.7. Surexpression des protéines de fusion ...........................................................................................65 4.8. Amplification des séquences d’intérêt...........................................................................................65 Conclusion générale et perspectives..................................................................................69 Glossaire ..........................................................................................................................71 Liste des abréviations........................................................................................................74 Liste des tableaux .............................................................................................................77 Bibliographie....................................................................................................................78 Annexes............................................................................................................................82 Résumé.............................................................................................................................91 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100370

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