Etude des effets de miels sur l’autophagie des macrophages / Julie George

Public ISBD Titre : Etude des effets de miels sur l’autophagie des macrophages Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Julie George, Auteur ; Gaëtane Maernoudt, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les propriétés curatives du miel sont connues depuis l’Antiquité et sont démontrées par des études contemporaines. En effet, le miel est connu depuis des décennies comme étant un remède naturel. Ses effets anti-inflammatoire, antibactériens et immunomodulatrices ne sont plus à prouver tant le nombre de recherches est important. Une recherche précédente a permis de mettre en évidence l’effet du miel artisanal d’été, des miels dont les propriétés curatives sont connues le Manuka et le Revamil sur l’abondance de protéines autophagiques des macrophages. En effet, les résultats ont montré une augmentation des protéines LC3-II et p62 en leur présence ainsi qu’une phosphorylation du complexe mTOR. L’autophagie désigne le mécanisme par lequel la cellule est capable de dégrader ses propres éléments cytoplasmiques n’étant plus nécessaire pour produire de nouvelles protéines. Ceci se réalise par l’intermédiaire de ses autophagosomes et lysosomes. L’objectif de ce travail de fin d’étude sera de confirmer l’augmentation de l’abondance des protéines autophagiques p62 dans les cellules RAW264.7 en présence du miel d’été, du Manuka et du Revamil. Il s’agira également de confirmer la diminution de l’abondance de la protéine TFEB qui est un marqueur majeur de l’autophagie dans ces 3 miels. L’objectif sera aussi de connaitre par quels mécanismes moléculaires et cellulaires ainsi que de quelle façon ces phénomènes se produisent et régulent l’autophagie. Dans le cadre de mon TFE, l’objectif principal est de connaitre et comprendre l’effet des différents miels sur les mécanismes d’autophagie des cellules macrophages. Pour se faire, on va s’intéresser principalement sur le facteur de transcription TFEB. Cette comparaison, des effets de différents miels a, dans un premier temps, été réalisée par analyse d’abondance protéique des marqueurs de l’autophagie et de kinases/enzymes clés de sa régulation. Cette recherche a permis de montrer une différence de l’augmentation de l’abondance des protéines p62 et TFEB en fonction du miel utilisé. La composition ainsi que la période de récolte du miel influenceraient cet effet. Deux miels artisanaux ont montré des profils complétement différents et les miels médicaux alors que le Revamil et le Manuka montrent des effets relativement similaires. En effet, Les résultats montrent une augmentation de l’abondance de la protéine p62 pour les conditions Revamil, Manuka et miel d’été par rapport à la condition « Sugar Mix » contrairement au miel de printemps qui se comporte comme la condition « Sugar Mix ». Ceci pourrait être expliqué par deux hypothèses. En effet, soit il pourrait s’agir d’une stimulation de l’initiation de l’autophagie et donc une accumulation d’autophagosomes, soit il pourrait s’agir d’une diminution de flux d’autophagie, c’est-à-dire l’étape de fusion de l’autophagosome avec le lysosome. Cette inhibition empêcherait ainsi la dégradation des autophagosomes, entrainant leur accumulation, ce qui expliquerait pourquoi p62 voit son abondance augmenter. Les résultats montrent également une diminution de l’abondance totale de TFEB ainsi qu’une translocation de TFEB dans les miels d’été, le Manuka et le Revamil. Une étude des gènes cibles de TFEB n’a pu affirmer que son activité est plus exprimée dans les miels d’été, Manuka et Revamil malgré sa translocation. Ces résultats montrent également que la composition du miel ainsi que la période de récolte influencent les effets de ce dernier sur l’abondance des protéines p62 et TFEB. Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage ..........................................................................................................................7 Introduction .....................................................................................................................................................8 Le miel........................................................................................................................................................11 Composition du miel..............................................................................................................................11 Propriétés du miel .................................................................................................................................15 L’autophagie ..............................................................................................................................................21 Mécanismes impliqués dans l’autophagie et formation de l’autophagosome .....................................23 Régulation de l’autophagie....................................................................................................................26 Objectif de l’étude .........................................................................................................................................32 Matériel et méthodes ....................................................................................................................................34 Matériels....................................................................................................................................................35 Miels.......................................................................................................................................................35 Cellules RAW 264.7................................................................................................................................37 Méthodes...................................................................................................................................................38 Workflow des manipulations.................................................................................................................38 Dosage protéique par la méthode de Bradford ....................................................................................38 Lysats cellulaires ....................................................................................................................................39 Fractionnement cellulaire......................................................................................................................40 Western blot ..........................................................................................................................................40 Dosage de deux enzymes lysosomales ..................................................................................................44 Immunofluorescence.............................................................................................................................46 Résultats et discussion...................................................................................................................................48 Résultats préliminaires ..............................................................................................................................49 Etude des nouveaux miels .........................................................................................................................49 Micrographie..........................................................................................................................................50 Etude des effets des miels sur l’abondance de p62 ..................................................................................52 Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de p62 par western blot .......................52 Immunofluorescence et observation de l’abondance et de la localisation de p62 au microscope confocal..................................................................................................................................................54 Etude du facteur de transcription EB ........................................................................................................57 Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de TFEB par des analyses en western blot ...............................................................................................................................................................57 Immunofluorescence et observation au confocal.................................................................................59 Fractionnement .....................................................................................................................................61 Dosage enzymatique .............................................................................................................................63 Conclusions et perspectives ..........................................................................................................................64 Liste des abréviations ................................................................................................................................68 Liste des figures .........................................................................................................................................70 Références bibliographiques .........................................................................................................................72 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100365 Etude des effets de miels sur l’autophagie des macrophages [TFE / Mémoire] / Julie George, Auteur ; Gaëtane Maernoudt, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les propriétés curatives du miel sont connues depuis l’Antiquité et sont démontrées par des études contemporaines. En effet, le miel est connu depuis des décennies comme étant un remède naturel. Ses effets anti-inflammatoire, antibactériens et immunomodulatrices ne sont plus à prouver tant le nombre de recherches est important. Une recherche précédente a permis de mettre en évidence l’effet du miel artisanal d’été, des miels dont les propriétés curatives sont connues le Manuka et le Revamil sur l’abondance de protéines autophagiques des macrophages. En effet, les résultats ont montré une augmentation des protéines LC3-II et p62 en leur présence ainsi qu’une phosphorylation du complexe mTOR. L’autophagie désigne le mécanisme par lequel la cellule est capable de dégrader ses propres éléments cytoplasmiques n’étant plus nécessaire pour produire de nouvelles protéines. Ceci se réalise par l’intermédiaire de ses autophagosomes et lysosomes. L’objectif de ce travail de fin d’étude sera de confirmer l’augmentation de l’abondance des protéines autophagiques p62 dans les cellules RAW264.7 en présence du miel d’été, du Manuka et du Revamil. Il s’agira également de confirmer la diminution de l’abondance de la protéine TFEB qui est un marqueur majeur de l’autophagie dans ces 3 miels. L’objectif sera aussi de connaitre par quels mécanismes moléculaires et cellulaires ainsi que de quelle façon ces phénomènes se produisent et régulent l’autophagie. Dans le cadre de mon TFE, l’objectif principal est de connaitre et comprendre l’effet des différents miels sur les mécanismes d’autophagie des cellules macrophages. Pour se faire, on va s’intéresser principalement sur le facteur de transcription TFEB. Cette comparaison, des effets de différents miels a, dans un premier temps, été réalisée par analyse d’abondance protéique des marqueurs de l’autophagie et de kinases/enzymes clés de sa régulation. Cette recherche a permis de montrer une différence de l’augmentation de l’abondance des protéines p62 et TFEB en fonction du miel utilisé. La composition ainsi que la période de récolte du miel influenceraient cet effet. Deux miels artisanaux ont montré des profils complétement différents et les miels médicaux alors que le Revamil et le Manuka montrent des effets relativement similaires. En effet, Les résultats montrent une augmentation de l’abondance de la protéine p62 pour les conditions Revamil, Manuka et miel d’été par rapport à la condition « Sugar Mix » contrairement au miel de printemps qui se comporte comme la condition « Sugar Mix ». Ceci pourrait être expliqué par deux hypothèses. En effet, soit il pourrait s’agir d’une stimulation de l’initiation de l’autophagie et donc une accumulation d’autophagosomes, soit il pourrait s’agir d’une diminution de flux d’autophagie, c’est-à-dire l’étape de fusion de l’autophagosome avec le lysosome. Cette inhibition empêcherait ainsi la dégradation des autophagosomes, entrainant leur accumulation, ce qui expliquerait pourquoi p62 voit son abondance augmenter. Les résultats montrent également une diminution de l’abondance totale de TFEB ainsi qu’une translocation de TFEB dans les miels d’été, le Manuka et le Revamil. Une étude des gènes cibles de TFEB n’a pu affirmer que son activité est plus exprimée dans les miels d’été, Manuka et Revamil malgré sa translocation. Ces résultats montrent également que la composition du miel ainsi que la période de récolte influencent les effets de ce dernier sur l’abondance des protéines p62 et TFEB. Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage ..........................................................................................................................7 Introduction .....................................................................................................................................................8 Le miel........................................................................................................................................................11 Composition du miel..............................................................................................................................11 Propriétés du miel .................................................................................................................................15 L’autophagie ..............................................................................................................................................21 Mécanismes impliqués dans l’autophagie et formation de l’autophagosome .....................................23 Régulation de l’autophagie....................................................................................................................26 Objectif de l’étude .........................................................................................................................................32 Matériel et méthodes ....................................................................................................................................34 Matériels....................................................................................................................................................35 Miels.......................................................................................................................................................35 Cellules RAW 264.7................................................................................................................................37 Méthodes...................................................................................................................................................38 Workflow des manipulations.................................................................................................................38 Dosage protéique par la méthode de Bradford ....................................................................................38 Lysats cellulaires ....................................................................................................................................39 Fractionnement cellulaire......................................................................................................................40 Western blot ..........................................................................................................................................40 Dosage de deux enzymes lysosomales ..................................................................................................44 Immunofluorescence.............................................................................................................................46 Résultats et discussion...................................................................................................................................48 Résultats préliminaires ..............................................................................................................................49 Etude des nouveaux miels .........................................................................................................................49 Micrographie..........................................................................................................................................50 Etude des effets des miels sur l’abondance de p62 ..................................................................................52 Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de p62 par western blot .......................52 Immunofluorescence et observation de l’abondance et de la localisation de p62 au microscope confocal..................................................................................................................................................54 Etude du facteur de transcription EB ........................................................................................................57 Comparaison des effets de différents miels sur l’abondance de TFEB par des analyses en western blot ...............................................................................................................................................................57 Immunofluorescence et observation au confocal.................................................................................59 Fractionnement .....................................................................................................................................61 Dosage enzymatique .............................................................................................................................63 Conclusions et perspectives ..........................................................................................................................64 Liste des abréviations ................................................................................................................................68 Liste des figures .........................................................................................................................................70 Références bibliographiques .........................................................................................................................72 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100365

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