Régulation distale de la compétence chez Streptococcus salivarius / François Caussin

Public ISBD Titre : Régulation distale de la compétence chez Streptococcus salivarius Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : François Caussin, Auteur ; Caroline Charlier, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : UCLouvain  Unité de Biochimie et Génétique des Microorganismes  BGM Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Dans des milieux aux paramètres fluctuants constamment, des mécanismes d’adaptation et d’évolution ont été mis en place par la plupart bactéries. Ces mécanismes favorisent entre autres les échanges génétiques qui leur permettent de survivre et croître. Un processus primordial dans l’évolution bactérienne est le transfert latéral de gènes, incluant la transformation, la transduction et la conjugaison. Les bactéries du genre streptococcus utilisent principalement la transformation naturelle. Streptococcus salivarius, l’organisme modèle de ce projet, est une bactérie à gram positif, saprophyte pour l’Homme. Ce micro-organisme est capable d’adapter son mode de vie en fonction du milieu dans lequel il croît. Primo-colonisatrice du système digestif, très présente au niveau de la cavité orale et de l’intestin grêle, elle est bénéfique pour l’Homme. Sa production de bactériocines (peptides antibactériens) couplée à la transformation naturelle fait d’elle une bactérie capable d’inhiber la croissance d’autres bactéries pathogènes ou de capturer l’ADN exogène présent dans le milieu extracellulaire lors d’un état physiologique transitoire appelé compétence. Chez certains streptocoques, l’état de compétence peut se déclencher grâce à des conditions environnementales et physiologiques spécifiques. Le premier niveau de contrôle de l’activation de la compétence est effectué par le système de régulation transcriptionnelle ComRS. Le second niveau de régulation de la compétence est régi par les systèmes à deux composants (TCS) dont celui au centre de ce projet, le système CovRS. Le lien entre ces deux systèmes de régulation se fait au niveau de l’expression du gène comR. Le système CovRS fonctionne comme suit : CovS, l’histidine kinase transmembranaire, détecte un signal extracellulaire provoquant l’autophosphorylation de son domaine cytoplasmique. Le groupement phosphate de CovS est ensuite transféré au régulateur de réponse (RR) associé (CovR~P). Cette phosphorylation provoque la dimérisation de CovR afin d’augmenter son affinité pour les séquences de reconnaissance en amont des gènes cibles. L’interaction directe du dimère avec le promoteur de comR réprime son expression. CovRS est donc capable d’adapter la quantité de ComR, l’acteur principal de l’activation de la compétence. Étant donné que le système CovRS n’a encore jamais été mis en lien avec l’induction spontanée de la compétence, ce travail sera consacré à l’identification de stimuli capables d’affecter l’expression de comR en relais avec CovR, l’un des acteurs principaux du système CovRS. Lorsque ces facteurs environnementaux auront été identifiés, ils seront analysés plus en détail afin d’affiner les paramètres physico-chimiques ou les concentrations en molécules activatrices pour un contrôle fin de l’induction spontanée de la compétence. Parmi les nombreux facteurs environnementaux proposés par les plaques phénotypiques (société Biolog), les résultats obtenus ont relevé qu’en présence de sels ou d’un pH basique, S. salivarius pourrait entrer en état de compétence. Ces deux conditions sont retrouvées dans la littérature pour d’autres streptocoques tels que S. pyogenes. D’autres facteurs candidats comme inducteurs de la compétence ont été identifiés. Parmi ceux-ci, on retrouve l’urée, le lactate de sodium et la présence de certains sucres comme le galactose, le glucose, le maltose et le sucrose. Contrairement à l’impact du sel et du pH, aucune donnée préalable concernant ces autres facteurs n’a été rapportée dans la littérature pour d’autres espèces du genre Streptococcus. Si ces données devront être confirmées, ce travail ouvre la porte au contrôle du mécanisme couplé de prédation/compétence chez S. salivarius à des fins biomédicales pour le contrôle des bactéries pathogènes. Note de contenu : Table des matières Table des matières................................................................................................................................5 Présentation du lieu de stage................................................................................................................7 Université catholique de Louvain (UCLouvain)............................................................................................ 7 Unité de Biochimie et Génétique des Microorganismes (BGM) ................................................................. 7 Introduction générale ...........................................................................................................................9 Contexte général ................................................................................................................................ 11 1.1 Les streptocoques ................................................................................................................. 11 1.1.1 Les streptocoques oraux.......................................................................................................... 11 1.1.2 Streptoccocus salivarius........................................................................................................... 12 1.2 La compétence...................................................................................................................... 13 1.3 La régulation de la compétence ............................................................................................. 14 1.3.1 La régulation proximale ........................................................................................................... 16 1.3.2 La régulation distale................................................................................................................. 19 2 Objectifs et stratégie ................................................................................................................... 28 3 Matériels et méthodes ................................................................................................................ 30 3.1 Souches bactériennes et constructions génétiques ................................................................ 30 3.1.1 Souche Streptococcus salivarius HSISS4 .................................................................................. 30 3.1.2 Construction HSISS4 PcomR-luxAB ............................................................................................. 30 3.1.3 Construction HSISS4 PcomR-luxAB ; covST287A .................................................................................................................. 30 3.1.4 Construction HSISS4 PcomX-luxAB ; covST287A .................................................................................................................. 31 3.2 Conditions et Milieux de culture............................................................................................ 31 3.2.1 M17.......................................................................................................................................... 31 3.2.2 CDM ......................................................................................................................................... 32 3.3 Plaques phénotypiques et système rapporteur luciférase ...................................................... 33 3.3.1 Intérêt et composition des plaques phénotypiques BiologTM ................................................. 33 3.3.2 Mode opératoire...................................................................................................................... 33 3.4 Utilisation du système rapporteur luciférase ......................................................................... 34 3.5 Préparation de la construction géntique HSISS4 PcomX-luxAB ; covST287A ..................................................35 3.5.1 Transformation naturelle......................................................................................................... 35 3.5.2 PCR diagnostique ..................................................................................................................... 36 3.5.3 Migration sur gel d’agarose..................................................................................................... 37 3.5.4 Purification et mesure de la quantification d’ADN.................................................................. 37 3.5.5 Séquençage.............................................................................................................................. 38 4 Résultats..................................................................................................................................... 39 4.1 Identification des stimuli affectant l’expression de comR....................................................... 39 4.1.1 Impact du stress salin .............................................................................................................. 40 4.1.2 Impact de la variation du pH.................................................................................................... 41 4.1.3 Impact du lactate de sodium ................................................................................................... 43 4.1.4 Impact lié à la présence d’urée................................................................................................ 44 4.1.5 Impact des sucres .................................................................................................................... 46 4.2 Construction de la souche PcomX-luxAB ; covST287A .................................................................................................47 4.2.1 Transfert de la mutation covST287A ........................................................................................................................................ 47 4.2.2 PCR diagnostique et quantification de l’ADN .......................................................................... 48 4.2.3 Séquençage.............................................................................................................................. 49 4.3 Confirmation des stimuli ....................................................................................................... 49 4.3.1 Analyse des résultats ............................................................................................................... 50 5 Discussion ................................................................................................................................... 57 5.1 Le système CovRS de régulation distale chez S. salivarius....................................................... 57 5.2 Facteurs environnementaux capable d’induire la compétence ................................................... 57 Conclusion et perspectives.................................................................................................................. 60 Bibliographie ...................................................................................................................................... 62 Annexes ............................................................................................................................................. 69 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100337 Régulation distale de la compétence chez Streptococcus salivarius [TFE / Mémoire] / François Caussin, Auteur ; Caroline Charlier, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : UCLouvain  Unité de Biochimie et Génétique des Microorganismes  BGM Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Dans des milieux aux paramètres fluctuants constamment, des mécanismes d’adaptation et d’évolution ont été mis en place par la plupart bactéries. Ces mécanismes favorisent entre autres les échanges génétiques qui leur permettent de survivre et croître. Un processus primordial dans l’évolution bactérienne est le transfert latéral de gènes, incluant la transformation, la transduction et la conjugaison. Les bactéries du genre streptococcus utilisent principalement la transformation naturelle. Streptococcus salivarius, l’organisme modèle de ce projet, est une bactérie à gram positif, saprophyte pour l’Homme. Ce micro-organisme est capable d’adapter son mode de vie en fonction du milieu dans lequel il croît. Primo-colonisatrice du système digestif, très présente au niveau de la cavité orale et de l’intestin grêle, elle est bénéfique pour l’Homme. Sa production de bactériocines (peptides antibactériens) couplée à la transformation naturelle fait d’elle une bactérie capable d’inhiber la croissance d’autres bactéries pathogènes ou de capturer l’ADN exogène présent dans le milieu extracellulaire lors d’un état physiologique transitoire appelé compétence. Chez certains streptocoques, l’état de compétence peut se déclencher grâce à des conditions environnementales et physiologiques spécifiques. Le premier niveau de contrôle de l’activation de la compétence est effectué par le système de régulation transcriptionnelle ComRS. Le second niveau de régulation de la compétence est régi par les systèmes à deux composants (TCS) dont celui au centre de ce projet, le système CovRS. Le lien entre ces deux systèmes de régulation se fait au niveau de l’expression du gène comR. Le système CovRS fonctionne comme suit : CovS, l’histidine kinase transmembranaire, détecte un signal extracellulaire provoquant l’autophosphorylation de son domaine cytoplasmique. Le groupement phosphate de CovS est ensuite transféré au régulateur de réponse (RR) associé (CovR~P). Cette phosphorylation provoque la dimérisation de CovR afin d’augmenter son affinité pour les séquences de reconnaissance en amont des gènes cibles. L’interaction directe du dimère avec le promoteur de comR réprime son expression. CovRS est donc capable d’adapter la quantité de ComR, l’acteur principal de l’activation de la compétence. Étant donné que le système CovRS n’a encore jamais été mis en lien avec l’induction spontanée de la compétence, ce travail sera consacré à l’identification de stimuli capables d’affecter l’expression de comR en relais avec CovR, l’un des acteurs principaux du système CovRS. Lorsque ces facteurs environnementaux auront été identifiés, ils seront analysés plus en détail afin d’affiner les paramètres physico-chimiques ou les concentrations en molécules activatrices pour un contrôle fin de l’induction spontanée de la compétence. Parmi les nombreux facteurs environnementaux proposés par les plaques phénotypiques (société Biolog), les résultats obtenus ont relevé qu’en présence de sels ou d’un pH basique, S. salivarius pourrait entrer en état de compétence. Ces deux conditions sont retrouvées dans la littérature pour d’autres streptocoques tels que S. pyogenes. D’autres facteurs candidats comme inducteurs de la compétence ont été identifiés. Parmi ceux-ci, on retrouve l’urée, le lactate de sodium et la présence de certains sucres comme le galactose, le glucose, le maltose et le sucrose. Contrairement à l’impact du sel et du pH, aucune donnée préalable concernant ces autres facteurs n’a été rapportée dans la littérature pour d’autres espèces du genre Streptococcus. Si ces données devront être confirmées, ce travail ouvre la porte au contrôle du mécanisme couplé de prédation/compétence chez S. salivarius à des fins biomédicales pour le contrôle des bactéries pathogènes. Note de contenu : Table des matières Table des matières................................................................................................................................5 Présentation du lieu de stage................................................................................................................7 Université catholique de Louvain (UCLouvain)............................................................................................ 7 Unité de Biochimie et Génétique des Microorganismes (BGM) ................................................................. 7 Introduction générale ...........................................................................................................................9 Contexte général ................................................................................................................................ 11 1.1 Les streptocoques ................................................................................................................. 11 1.1.1 Les streptocoques oraux.......................................................................................................... 11 1.1.2 Streptoccocus salivarius........................................................................................................... 12 1.2 La compétence...................................................................................................................... 13 1.3 La régulation de la compétence ............................................................................................. 14 1.3.1 La régulation proximale ........................................................................................................... 16 1.3.2 La régulation distale................................................................................................................. 19 2 Objectifs et stratégie ................................................................................................................... 28 3 Matériels et méthodes ................................................................................................................ 30 3.1 Souches bactériennes et constructions génétiques ................................................................ 30 3.1.1 Souche Streptococcus salivarius HSISS4 .................................................................................. 30 3.1.2 Construction HSISS4 PcomR-luxAB ............................................................................................. 30 3.1.3 Construction HSISS4 PcomR-luxAB ; covST287A .................................................................................................................. 30 3.1.4 Construction HSISS4 PcomX-luxAB ; covST287A .................................................................................................................. 31 3.2 Conditions et Milieux de culture............................................................................................ 31 3.2.1 M17.......................................................................................................................................... 31 3.2.2 CDM ......................................................................................................................................... 32 3.3 Plaques phénotypiques et système rapporteur luciférase ...................................................... 33 3.3.1 Intérêt et composition des plaques phénotypiques BiologTM ................................................. 33 3.3.2 Mode opératoire...................................................................................................................... 33 3.4 Utilisation du système rapporteur luciférase ......................................................................... 34 3.5 Préparation de la construction géntique HSISS4 PcomX-luxAB ; covST287A ..................................................35 3.5.1 Transformation naturelle......................................................................................................... 35 3.5.2 PCR diagnostique ..................................................................................................................... 36 3.5.3 Migration sur gel d’agarose..................................................................................................... 37 3.5.4 Purification et mesure de la quantification d’ADN.................................................................. 37 3.5.5 Séquençage.............................................................................................................................. 38 4 Résultats..................................................................................................................................... 39 4.1 Identification des stimuli affectant l’expression de comR....................................................... 39 4.1.1 Impact du stress salin .............................................................................................................. 40 4.1.2 Impact de la variation du pH.................................................................................................... 41 4.1.3 Impact du lactate de sodium ................................................................................................... 43 4.1.4 Impact lié à la présence d’urée................................................................................................ 44 4.1.5 Impact des sucres .................................................................................................................... 46 4.2 Construction de la souche PcomX-luxAB ; covST287A .................................................................................................47 4.2.1 Transfert de la mutation covST287A ........................................................................................................................................ 47 4.2.2 PCR diagnostique et quantification de l’ADN .......................................................................... 48 4.2.3 Séquençage.............................................................................................................................. 49 4.3 Confirmation des stimuli ....................................................................................................... 49 4.3.1 Analyse des résultats ............................................................................................................... 50 5 Discussion ................................................................................................................................... 57 5.1 Le système CovRS de régulation distale chez S. salivarius....................................................... 57 5.2 Facteurs environnementaux capable d’induire la compétence ................................................... 57 Conclusion et perspectives.................................................................................................................. 60 Bibliographie ...................................................................................................................................... 62 Annexes ............................................................................................................................................. 69 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100337

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