Surexpression et purification de la 2-Oxoglutarate/Fe(II)- dépendante chez Caulobacter crescentus / Grégoire Vanhaelen

Public ISBD Titre : Surexpression et purification de la 2-Oxoglutarate/Fe(II)- dépendante chez Caulobacter crescentus Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Grégoire Vanhaelen, Auteur ; Jenny Pouyez, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Centre de Cancérologie de Marseille  CRCM Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le cuivre est un élément indispensable pour tous les organismes mais, à trop grande concentration, il provoquera un stress oxydatif pouvant provoquer la mort de la cellule. Au cours de l’évolution, différents mécanismes ont été développés par des bactéries afin de pouvoir survivre dans un milieu riche en cuivre. Caulobacter crescentus est une bactérie intéressante et fortement étudiée. Elle possède différents mécanismes lui offrant une tolérance au cuivre. Son cycle cellulaire est particulier, elle donne naissance à deux cellules filles ayant chacune une morphologie et une fonction différentes : la cellule flagellée et la cellule pédonculée. Ces deux cellules ont des mécanismes différents pour faire face à un environnement riche en cuivre. La cellule flagellée dispose d’un flagelle lui permettant de se déplacer et grâce à la chimiotaxie négative, cela lui permet de s’éloigner des milieux à haute concentration en cuivre. La cellule pédonculée possède un système appelé PcoAB lui permettant de réguler la concentration intracellulaire en cuivre. Ce projet, réalisé dans le laboratoire de l’URBM, vise à étudier une protéine se trouvant chez la cellule pédonculée, elle semblerait jouer un rôle dans la tolérance au cuivre chez C. cresentus, la 2-Oxoglutarate/Fe(II)-dépendantes. Ce travail de fin d’étude a comme objectif de réaliser une surexpression de la protéine 2-Oxoglutarate/Fe(II)-dépendantes, d’en trouver les conditions optimales et de la purifier. Par la suite, des tests in vitro seront réalisés dessus dans le but de mettre en évidence la capacité de la protéine 2-Oxoglutarate/Fe(II)-dépendantes de se lier au Cu chez C. crescentus. Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage.................................................................................................................. 1 Université de Namur ........................................................................................................................... 1 Unité de recherche en biologie des microorganismes (URBM) .......................................................... 1 2. Contexte général ................................................................................................................................. 1 2.1. Le cuivre ....................................................................................................................................... 1 2.1.1. Toxicité du cuivre .................................................................................................................. 2 2.2. Homéostasie du Cuivre............................................................................................................ 3 2.2.1. Le système Cue................................................................................................................ 3 2.2.2. Le système Cus ................................................................................................................ 4 2.2.3. Le système Pco ................................................................................................................ 4 2.3. Caulobacter crescentus ........................................................................................................... 5 2.3.1. Cycle cellulaire de C. crescentus.......................................................................................... 5 2.4. 2-Oxoglutarate/Fe(II)-dépendante.......................................................................................... 6 3. Objectif et stratégie......................................................................................................................... 9 4. Matériels et méthodes .................................................................................................................. 10 4.1. Matériels..................................................................................................................................... 10 Souches :........................................................................................................................................ 10 pET vecteur :.................................................................................................................................. 11 Enzyme de restriction :.................................................................................................................. 12 Milieu :........................................................................................................................................... 14 Construction : ................................................................................................................................ 14 4.2. Méthodes .............................................................................................................................. 15 4.2.1. La réaction de la polymérisation en chaine (PCR) ......................................................... 15 4.2.2. PCR Q5 ........................................................................................................................... 16 4.2.3. PCR Gotaq check (PCR colonies).................................................................................... 16 4.2.4. Electrophorèse .............................................................................................................. 17 4.2.5. Purification d’ADN sur gel ............................................................................................. 18 4.2.6. Purification PCR ............................................................................................................. 18 4.2.7. Extraction de plasmide, réalisation d’une miniprep ..................................................... 18 4.2.8. Restriction ..................................................................................................................... 19 4.2.9. Ligation .......................................................................................................................... 20 4.2.10. Transformation.............................................................................................................. 20 4.2.11. Ensemencement sur boite de Petri via la technique des billes..................................... 20 4.2.12. Le système blanc bleu X gal........................................................................................... 21 4.2.13. Surexpression de la protéine OxcT................................................................................ 22 4.2.14. SDS-page........................................................................................................................ 23 4.2.15. Western blot.................................................................................................................. 24 4.2.16. Chromatographie d’affinité au Nickel ........................................................................... 25 5. Résultats et discussion .................................................................................................................. 26 5.1. Construction DH10B-OxcT-pET28a............................................................................................. 26 5.2. Séquençage OxcT-pET28a ..................................................................................................... 28 5.3. Construction DH10B-OxcT-pSK.............................................................................................. 28 5.4. Séquençage de OxcT-pSK ...................................................................................................... 30 5.5. Construction DH10B-OxcT-pET28a........................................................................................ 30 5.6. Construction BL21plyS-OxcT-pET28a .................................................................................... 31 5.7. Surexpression de la protéine OxcT dans des BL21plysS........................................................ 33 5.8. Construction BL21-OxcT-pET28a........................................................................................... 34 5.9. Surexpression de la protéine OxcT dans des BL21plysS........................................................ 35 5.10. Surexpression d’OxcT dans des BL21 concentrations en IPTG différentes ....................... 35 5.11. Transformation OxcT-pET28a dans C41plysS .................................................................... 38 5.12. Surexpression d’OxcT dans C41plysS ................................................................................ 38 5.13. Surexpression d’OxcT dans C41plysS à des concentrations d’IPTG différentes................ 40 5.14. Surexpression d’OxcT dans C41plysS à différentes concentrations en DTT...................... 41 5.15. Western blot sur C41plysS avec du DTT............................................................................ 42 ........................................................................................................................................................... 43 5.16. Western blot sur C41plysS avec beta-mercaptoéthanol................................................... 43 5.17. Séquençage OxcT-pET28a ................................................................................................. 44 5.18. Construction DH10B-OxcT-pET15b.................................................................................... 44 5.19. Séquençage OxcT-pET15b ................................................................................................. 45 5.20. Construction DH10B-OxcT-pET15b.................................................................................... 45 5.21. Séquençage OxcT-pET15b ................................................................................................. 46 5.22. Construction DH10B-OxcT-pET15b.................................................................................... 47 5.23. Séquençage OxcT-pET15b ................................................................................................. 49 5.24. Construction DH10B-OxcT-pET28a.................................................................................... 49 5.25. Séquençage OxcT-pET28a ................................................................................................. 50 6. Conclusion et Perspective ............................................................................................................. 51 7. Bibliographie.................................................................................................................................. 54 8. Liste des tableaux .......................................................................................................................... 56 9. Liste des figures............................................................................................................................. 57 10. Annexes ..................................................................................................................................... 59 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100317 Surexpression et purification de la 2-Oxoglutarate/Fe(II)- dépendante chez Caulobacter crescentus [TFE / Mémoire] / Grégoire Vanhaelen, Auteur ; Jenny Pouyez, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Centre de Cancérologie de Marseille  CRCM Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le cuivre est un élément indispensable pour tous les organismes mais, à trop grande concentration, il provoquera un stress oxydatif pouvant provoquer la mort de la cellule. Au cours de l’évolution, différents mécanismes ont été développés par des bactéries afin de pouvoir survivre dans un milieu riche en cuivre. Caulobacter crescentus est une bactérie intéressante et fortement étudiée. Elle possède différents mécanismes lui offrant une tolérance au cuivre. Son cycle cellulaire est particulier, elle donne naissance à deux cellules filles ayant chacune une morphologie et une fonction différentes : la cellule flagellée et la cellule pédonculée. Ces deux cellules ont des mécanismes différents pour faire face à un environnement riche en cuivre. La cellule flagellée dispose d’un flagelle lui permettant de se déplacer et grâce à la chimiotaxie négative, cela lui permet de s’éloigner des milieux à haute concentration en cuivre. La cellule pédonculée possède un système appelé PcoAB lui permettant de réguler la concentration intracellulaire en cuivre. Ce projet, réalisé dans le laboratoire de l’URBM, vise à étudier une protéine se trouvant chez la cellule pédonculée, elle semblerait jouer un rôle dans la tolérance au cuivre chez C. cresentus, la 2-Oxoglutarate/Fe(II)-dépendantes. Ce travail de fin d’étude a comme objectif de réaliser une surexpression de la protéine 2-Oxoglutarate/Fe(II)-dépendantes, d’en trouver les conditions optimales et de la purifier. Par la suite, des tests in vitro seront réalisés dessus dans le but de mettre en évidence la capacité de la protéine 2-Oxoglutarate/Fe(II)-dépendantes de se lier au Cu chez C. crescentus. Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage.................................................................................................................. 1 Université de Namur ........................................................................................................................... 1 Unité de recherche en biologie des microorganismes (URBM) .......................................................... 1 2. Contexte général ................................................................................................................................. 1 2.1. Le cuivre ....................................................................................................................................... 1 2.1.1. Toxicité du cuivre .................................................................................................................. 2 2.2. Homéostasie du Cuivre............................................................................................................ 3 2.2.1. Le système Cue................................................................................................................ 3 2.2.2. Le système Cus ................................................................................................................ 4 2.2.3. Le système Pco ................................................................................................................ 4 2.3. Caulobacter crescentus ........................................................................................................... 5 2.3.1. Cycle cellulaire de C. crescentus.......................................................................................... 5 2.4. 2-Oxoglutarate/Fe(II)-dépendante.......................................................................................... 6 3. Objectif et stratégie......................................................................................................................... 9 4. Matériels et méthodes .................................................................................................................. 10 4.1. Matériels..................................................................................................................................... 10 Souches :........................................................................................................................................ 10 pET vecteur :.................................................................................................................................. 11 Enzyme de restriction :.................................................................................................................. 12 Milieu :........................................................................................................................................... 14 Construction : ................................................................................................................................ 14 4.2. Méthodes .............................................................................................................................. 15 4.2.1. La réaction de la polymérisation en chaine (PCR) ......................................................... 15 4.2.2. PCR Q5 ........................................................................................................................... 16 4.2.3. PCR Gotaq check (PCR colonies).................................................................................... 16 4.2.4. Electrophorèse .............................................................................................................. 17 4.2.5. Purification d’ADN sur gel ............................................................................................. 18 4.2.6. Purification PCR ............................................................................................................. 18 4.2.7. Extraction de plasmide, réalisation d’une miniprep ..................................................... 18 4.2.8. Restriction ..................................................................................................................... 19 4.2.9. Ligation .......................................................................................................................... 20 4.2.10. Transformation.............................................................................................................. 20 4.2.11. Ensemencement sur boite de Petri via la technique des billes..................................... 20 4.2.12. Le système blanc bleu X gal........................................................................................... 21 4.2.13. Surexpression de la protéine OxcT................................................................................ 22 4.2.14. SDS-page........................................................................................................................ 23 4.2.15. Western blot.................................................................................................................. 24 4.2.16. Chromatographie d’affinité au Nickel ........................................................................... 25 5. Résultats et discussion .................................................................................................................. 26 5.1. Construction DH10B-OxcT-pET28a............................................................................................. 26 5.2. Séquençage OxcT-pET28a ..................................................................................................... 28 5.3. Construction DH10B-OxcT-pSK.............................................................................................. 28 5.4. Séquençage de OxcT-pSK ...................................................................................................... 30 5.5. Construction DH10B-OxcT-pET28a........................................................................................ 30 5.6. Construction BL21plyS-OxcT-pET28a .................................................................................... 31 5.7. Surexpression de la protéine OxcT dans des BL21plysS........................................................ 33 5.8. Construction BL21-OxcT-pET28a........................................................................................... 34 5.9. Surexpression de la protéine OxcT dans des BL21plysS........................................................ 35 5.10. Surexpression d’OxcT dans des BL21 concentrations en IPTG différentes ....................... 35 5.11. Transformation OxcT-pET28a dans C41plysS .................................................................... 38 5.12. Surexpression d’OxcT dans C41plysS ................................................................................ 38 5.13. Surexpression d’OxcT dans C41plysS à des concentrations d’IPTG différentes................ 40 5.14. Surexpression d’OxcT dans C41plysS à différentes concentrations en DTT...................... 41 5.15. Western blot sur C41plysS avec du DTT............................................................................ 42 ........................................................................................................................................................... 43 5.16. Western blot sur C41plysS avec beta-mercaptoéthanol................................................... 43 5.17. Séquençage OxcT-pET28a ................................................................................................. 44 5.18. Construction DH10B-OxcT-pET15b.................................................................................... 44 5.19. Séquençage OxcT-pET15b ................................................................................................. 45 5.20. Construction DH10B-OxcT-pET15b.................................................................................... 45 5.21. Séquençage OxcT-pET15b ................................................................................................. 46 5.22. Construction DH10B-OxcT-pET15b.................................................................................... 47 5.23. Séquençage OxcT-pET15b ................................................................................................. 49 5.24. Construction DH10B-OxcT-pET28a.................................................................................... 49 5.25. Séquençage OxcT-pET28a ................................................................................................. 50 6. Conclusion et Perspective ............................................................................................................. 51 7. Bibliographie.................................................................................................................................. 54 8. Liste des tableaux .......................................................................................................................... 56 9. Liste des figures............................................................................................................................. 57 10. Annexes ..................................................................................................................................... 59 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100317

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