Centre de Documentation Campus Montignies
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Vendredi : 8h30-16h30
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| Titre : |
PURIFICATIONS PAR BILLES MAGNÉTIQUES DANS LE FLUX DU SÉQUENÇAGE SANGER |
| Type de document : |
TFE / Mémoire |
| Auteurs : |
Ariane SAAN KEMEGNI, Auteur |
| Année de publication : |
2016 |
| Note générale : |
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. |
| Langues : |
Français (fre) |
| Mots-clés : |
biologie médicale UCL Saint-Luc Woluwe-Saint-Lambert PURIFICATION BILLES MAGNÉTIQUES SÉQUENÇAGE SANGER ADN |
| Index. décimale : |
TFE Bio Med TFE Biologie médicale |
| Note de contenu : |
TABLE DES MATIÈRES
INTRODUCTION ................................................................................................................... 15
1 NOTION THÉORIQUE ................................................................................................... 19
1.1 Définition de l’ADN.................................................................................................. 19
1.2 Structure .................................................................................................................... 19
1.3 Propriétés de l’ADN .................................................................................................. 21
2 Séquençage Sanger ........................................................................................................... 23
2.1 Extraction de l’ADN ................................................................................................. 23
2.1.1 Extraction d’ADN par phénol-chloroforme-alcool isoamylique ....................... 24
2.1.2 Extraction de l’ADN par salting out .................................................................. 24
2.1.3 Extraction sur l’extracteur automatique QIAsymphony .................................... 25
2.2 Quantification de l’ADN ........................................................................................... 26
2.3 PCR .......................................................................................................................... 26
2.4 Purification du produit PCR ...................................................................................... 32
2.4.1 Purification par méthode enzymatique : ............................................................ 33
2.4.2 Purification par les billes magnétiques : ............................................................ 33
2.5 Séquençage Sanger proprement dit ........................................................................... 34 2.5.1 Principe .............................................................................................................. 34
2.6 Purification après la réaction de séquence ................................................................ 37
2.6.1 Purification par précipitation acétate-éthanol .................................................... 37
2.6.2 Purification d’ADN par gel-filtration sur résine Sephadex® G-50 Super fine.. 38
2.6.3 Purification par les billes magnétiques : AGENCOURT ®CLEANSEQ® ...... 39
2.7 Électrophorèse capillaire ........................................................................................... 40
Objectifs et stratégies ............................................................................................................... 41
3 Matériels et méthodes ....................................................................................................... 45
3.1 Matériel de base ........................................................................................................ 45
3.2 Réaction de polymérisation en chaine (PCR). .......................................................... 45
3.2.1 Matériel .............................................................................................................. 45
3.2.2 Réactifs .............................................................................................................. 46
3.2.3 Mode opératoire ................................................................................................. 47
3.3 Électrophorèse en gel d’agarose ou polyacrylamide ................................................. 48
3.3.1 Principe .............................................................................................................. 49
3.3.2 Matériel : ............................................................................................................ 49
3.3.3 Réactifs : ............................................................................................................ 50
3.3.4 Description ......................................................................................................... 50
3.4 Purification du produit PCR ...................................................................................... 52
3.4.1 Purification par méthode enzymatique .............................................................. 52
3.4.1.1 Réactifs ........................................................................................................... 52
3.4.1.2 Mode opératoire ............................................................................................. 52
3.4.2 Purification par billes magnétiques : AMPure Agencourt ................................. 52
3.4.2.1 Matériel et réactif ........................................................................................... 52
3.4.2.2 Mode opératoire ............................................................................................. 53
3.5 Séquençage Sanger .................................................................................................... 54
3.5.1 Matériels et Réactifs .......................................................................................... 54
3.5.2 Mode opératoire ................................................................................................. 55
3.6 Purification de la réaction de séquence ..................................................................... 56
3.6.1 Purification d’ADN par gel-filtration sur résine Sephadex® G-50 Super fine.. 56
3.6.1.1 Matériel et réactif ........................................................................................... 56
3.6.1.2 Mode opératoire ............................................................................................. 56
3.6.2 Purification par précipitation acétate-éthanol .................................................... 57
3.6.2.1 Réactifs et consommables .............................................................................. 57
3.6.2.2 Mode opératoire ............................................................................................. 57
3.6.3 Purification par les billes magnétiques : CleanSEQ Agencourt ............................ 58
3.6.3.1 Réactifs ........................................................................................................... 58
3.6.3.2 Mode opératoire .............................................................................................. 58
3.7 Analyseur génétique (séquenceur) : 3500XLDX ET 3730XL de chez Applied Biosystems ........................................................................................................................... 60
3.8 Analyses des données ................................................................................................ 61
4 RÉSULTATS et discussion .............................................................................................. 63
4.1 Choix des échantillons .............................................................................................. 63
4.2 Comparaison de la purification PCR par AMPure et par EXOSAP. ........................ 64
4.2.1 Utilisation de l’AMPure pour éliminer les dimeres de primers ......................... 67
4.3 Comparaison de technique de purification post-séquençage par CleanSEQ, SEPHADEX et précipitation acétate-éthanol. ...................................................................... 71
4.3.1 Comparaison CleanSEQ et SEPHADEX ........................................................... 71
4.3.2 Comparaison CleanSEQ et précipitation acétate- éthanol. ................................ 73
4.4 Application de la purification par billes magnétique dans le secteur HLA. ............. 76
Conclusion et perspectives ....................................................................................................... 79
Liste des illustrations ............................................................................................................... 81
Bibliographie............................................................................................................................ 83
Annexes.................................................................................................................................... 85 |
| Permalink : |
./index.php?lvl=notice_display&id=65691 |
PURIFICATIONS PAR BILLES MAGNÉTIQUES DANS LE FLUX DU SÉQUENÇAGE SANGER [TFE / Mémoire] / Ariane SAAN KEMEGNI, Auteur . - 2016. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français ( fre)
| Mots-clés : |
biologie médicale UCL Saint-Luc Woluwe-Saint-Lambert PURIFICATION BILLES MAGNÉTIQUES SÉQUENÇAGE SANGER ADN |
| Index. décimale : |
TFE Bio Med TFE Biologie médicale |
| Note de contenu : |
TABLE DES MATIÈRES
INTRODUCTION ................................................................................................................... 15
1 NOTION THÉORIQUE ................................................................................................... 19
1.1 Définition de l’ADN.................................................................................................. 19
1.2 Structure .................................................................................................................... 19
1.3 Propriétés de l’ADN .................................................................................................. 21
2 Séquençage Sanger ........................................................................................................... 23
2.1 Extraction de l’ADN ................................................................................................. 23
2.1.1 Extraction d’ADN par phénol-chloroforme-alcool isoamylique ....................... 24
2.1.2 Extraction de l’ADN par salting out .................................................................. 24
2.1.3 Extraction sur l’extracteur automatique QIAsymphony .................................... 25
2.2 Quantification de l’ADN ........................................................................................... 26
2.3 PCR .......................................................................................................................... 26
2.4 Purification du produit PCR ...................................................................................... 32
2.4.1 Purification par méthode enzymatique : ............................................................ 33
2.4.2 Purification par les billes magnétiques : ............................................................ 33
2.5 Séquençage Sanger proprement dit ........................................................................... 34 2.5.1 Principe .............................................................................................................. 34
2.6 Purification après la réaction de séquence ................................................................ 37
2.6.1 Purification par précipitation acétate-éthanol .................................................... 37
2.6.2 Purification d’ADN par gel-filtration sur résine Sephadex® G-50 Super fine.. 38
2.6.3 Purification par les billes magnétiques : AGENCOURT ®CLEANSEQ® ...... 39
2.7 Électrophorèse capillaire ........................................................................................... 40
Objectifs et stratégies ............................................................................................................... 41
3 Matériels et méthodes ....................................................................................................... 45
3.1 Matériel de base ........................................................................................................ 45
3.2 Réaction de polymérisation en chaine (PCR). .......................................................... 45
3.2.1 Matériel .............................................................................................................. 45
3.2.2 Réactifs .............................................................................................................. 46
3.2.3 Mode opératoire ................................................................................................. 47
3.3 Électrophorèse en gel d’agarose ou polyacrylamide ................................................. 48
3.3.1 Principe .............................................................................................................. 49
3.3.2 Matériel : ............................................................................................................ 49
3.3.3 Réactifs : ............................................................................................................ 50
3.3.4 Description ......................................................................................................... 50
3.4 Purification du produit PCR ...................................................................................... 52
3.4.1 Purification par méthode enzymatique .............................................................. 52
3.4.1.1 Réactifs ........................................................................................................... 52
3.4.1.2 Mode opératoire ............................................................................................. 52
3.4.2 Purification par billes magnétiques : AMPure Agencourt ................................. 52
3.4.2.1 Matériel et réactif ........................................................................................... 52
3.4.2.2 Mode opératoire ............................................................................................. 53
3.5 Séquençage Sanger .................................................................................................... 54
3.5.1 Matériels et Réactifs .......................................................................................... 54
3.5.2 Mode opératoire ................................................................................................. 55
3.6 Purification de la réaction de séquence ..................................................................... 56
3.6.1 Purification d’ADN par gel-filtration sur résine Sephadex® G-50 Super fine.. 56
3.6.1.1 Matériel et réactif ........................................................................................... 56
3.6.1.2 Mode opératoire ............................................................................................. 56
3.6.2 Purification par précipitation acétate-éthanol .................................................... 57
3.6.2.1 Réactifs et consommables .............................................................................. 57
3.6.2.2 Mode opératoire ............................................................................................. 57
3.6.3 Purification par les billes magnétiques : CleanSEQ Agencourt ............................ 58
3.6.3.1 Réactifs ........................................................................................................... 58
3.6.3.2 Mode opératoire .............................................................................................. 58
3.7 Analyseur génétique (séquenceur) : 3500XLDX ET 3730XL de chez Applied Biosystems ........................................................................................................................... 60
3.8 Analyses des données ................................................................................................ 61
4 RÉSULTATS et discussion .............................................................................................. 63
4.1 Choix des échantillons .............................................................................................. 63
4.2 Comparaison de la purification PCR par AMPure et par EXOSAP. ........................ 64
4.2.1 Utilisation de l’AMPure pour éliminer les dimeres de primers ......................... 67
4.3 Comparaison de technique de purification post-séquençage par CleanSEQ, SEPHADEX et précipitation acétate-éthanol. ...................................................................... 71
4.3.1 Comparaison CleanSEQ et SEPHADEX ........................................................... 71
4.3.2 Comparaison CleanSEQ et précipitation acétate- éthanol. ................................ 73
4.4 Application de la purification par billes magnétique dans le secteur HLA. ............. 76
Conclusion et perspectives ....................................................................................................... 79
Liste des illustrations ............................................................................................................... 81
Bibliographie............................................................................................................................ 83
Annexes.................................................................................................................................... 85 |
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Exemplaires
