Centre de Documentation Campus Montignies
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Titre : |
Mise au point de protocoles expérimentaux permettant l’identification de marqueurs associés au développement des plaques d’athérosclérose |
Type de document : |
TFE / Mémoire |
Auteurs : |
NICOLAS BAUDOIN, Auteur |
Année de publication : |
2013 |
Note générale : |
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. |
Langues : |
Français (fre) |
Mots-clés : |
BIOLOGIE MÉDICALE PLAQUES D'ATHEROSCLEROSE RECEPTEUR P2 ET P2Y6 ATHEROSCLEROSE LIPIDES ET LIPOPROTEINES GENOTYPAGE DES SOURIS CRYOSECTION MACROPHAGES CD68 CELLULES MUSCULAIRES LISSES (ASMA) OXYDATION DU CHOLESTEROL ARTERES Biologie médicale |
Index. décimale : |
TFE Bio Med TFE Biologie médicale |
Résumé : |
Ce Travail de Fin d’Etude a été réalisé dans le cadre de l’étude du rôle du récepteur P2Y6 dans une maladie inflammatoire des artères, l’athérosclérose. Cette étude est menée à l’Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire, de la Faculté de Médecine à l’Université Libre de Bruxelles.
L’athérosclérose est provoquée par l’entrée et l’oxydation du cholestérol dans la paroi des artères, ce qui amène les cellules endothéliales à recruter les cellules immunitaires de l’organisme que sont les monocytes. Ces derniers se différencient en macrophages et internalisent les LDL oxydés, se transformant alors en cellules spumeuses gorgées de lipides. Il s’en suit une migration et une prolifération des cellules musculaires lisses (CML) de la media qui secrètent de la matrice extracellulaire et forment la plaque fibreuse. Les plaques d’athérosclérose sont sujettes à des ruptures qui vont conduire à la formation de thrombi, obstruant ainsi la lumière artérielle.
Tout au long de ce travail, nous nous sommes penché sur la mise au point de plusieurs protocoles expérimentaux permettant d’identifier et de quantifier deux types cellulaires exprimant le récepteur P2Y6 : les macrophages et les CML. La technique utilisée est l’immunohistofluorescence via des anticorps spécifiques directement couplés à un fluorochrome ou non-couplés et avec l’utilisation d’un anticorps secondaire comme révélateur. Les plaques et le collagène sont également quantifiés via des colorations histochimiques.
Lors de nos expériences, nous avons pris pour modèle des souris génétiquement invalidées pour le gène codant l’Apolipoprotéine E puisque cette dernière protège les souris de l’athérosclérose.
Nous sommes parvenus à établir des protocoles qui permettront d’étudier le rôle in vivo du récepteur P2Y6 chez les macrophages et les CML. |
Note de contenu : |
TABLE DES MATIERES
Remerciements
Introduction générale ................................................................................................................ 8
Partie théorique ....................................................................................................................... 10
1. L’athérosclérose ...................................................................................................... 10
1.1. Les lipides et les lipoprotéines .................................................................................. 10
1.2. Structure d’une artère ............................................................................................... 12
1.3. Mécanismes moléculaires et cellulaires associés au développement de l’athérosclérose .................................................................................................................... 12
1.3.1 Initiation de la lésion .......................................................................................... 12
1.3.2 Inflammation ...................................................................................................... 13
1.3.3 Formation des cellules spumeuses .................................................................... 13
1.3.4 Formation des plaques fibreuses ....................................................................... 14
1.3.5 Évolution de la lésion ......................................................................................... 14
1.3.6 Thérapies actuelles ............................................................................................. 15
2. Le modèle murin pour l’athérosclérose .................................................................... 15
3. Composition des plaques athéromateuses : les types cellulaires .............................. 16
3.1. Les cellules endothéliales .......................................................................................... 16
3.2. Les macrophages ....................................................................................................... 17
3.3. Les cellules musculaires lisses ................................................................................... 17
4. Les récepteurs P2 .................................................................................................... 18
4.1. Les récepteurs P2X .................................................................................................... 18
4.2. Les récepteur P2Y ...................................................................................................... 19
4.2.1. Les GPCRs en général ......................................................................................... 19
4.2.2. Les P2Y ................................................................................................................ 19
5. Rôles des récepteurs P2Y dans l’athérosclérose ....................................................... 22
5.1. Rôle du récepteur P2Y13 dans le métabolisme des lipides ........................................ 22
5.2. Rôles dans la régulation de la pression sanguine et de l’endothélium ..................... 22
5.3. Rôle de P2Y1 Dans la réponse inflammatoire ............................................................ 23
5.4. Rôle de P2Y1 dans la prolifération des cellules endothéliales ................................... 23
5.5. Rôle de P2Y2 dans la prolifération des cellules musculaires ..................................... 23
6. Rôle de P2Y6 dans l’athérosclérose .......................................................................... 24
Partie pratique ......................................................................................................................... 26
1. But du travail .......................................................................................................... 26
2. Matériels et méthodes ............................................................................................ 27
2.1. Génotypage des souris .............................................................................................. 27
2.1.1. Principe ............................................................................................................... 27
2.1.2. Matériels ............................................................................................................ 27
2.1.3. Solutions ............................................................................................................. 27
2.1.4. Méthode ............................................................................................................. 28
2.2. Prélèvement des organes chez les souris .................................................................. 29
2.2.1. Matériels ............................................................................................................ 29
2.2.2. Solutions ............................................................................................................. 29
2.2.3. Méthode ............................................................................................................. 30
2.3. Coupe et enrobage des organes pour la cryosection ................................................ 30
2.3.1. Principe ............................................................................................................... 30
2.3.2. Matériels ............................................................................................................ 30
2.3.3. Solutions ............................................................................................................. 31
2.3.4. Méthode ............................................................................................................. 31
2.4. Confection des coupes au cryostat ........................................................................... 31
2.4.1. Principe ............................................................................................................... 31
2.4.2. Matériels ............................................................................................................ 32
2.4.3. Méthode (voir figure 13) .................................................................................... 32
2.5. Identification et quantification des plaques d’athéromes ........................................ 32
2.5.1. Principe de la coloration Oil Red ........................................................................ 32
2.5.2. Matériels ............................................................................................................ 32
2.5.3. Solution .............................................................................................................. 33
2.5.4. Méthode ............................................................................................................. 33
2.5.5. Quantification de la surface des plaques ........................................................... 33
2.6. Identification et quantification du collagène ............................................................ 33
2.6.1. Principe de la coloration Trichrome de Masson ................................................ 33
2.6.2. Matériels ............................................................................................................ 34
2.6.3. Solutions ............................................................................................................. 34
2.6.4. Méthode ............................................................................................................. 34
2.6.5. Quantification de la surface du collagène .......................................................... 35
2.7. Identification et quantification des macrophages (CD68) ....................................... 35
2.7.1. Principe de l’immunohistofluorescence ............................................................ 35
2.7.2. Matériel .............................................................................................................. 36
2.7.3. Solutions ............................................................................................................. 36
2.7.4. Méthode ............................................................................................................. 36
2.7.5. Quantification de la surface des macrophages .................................................. 37
2.8. Identification et quantification des cellules musculaires lisses (ASMA) ................... 38
2.8.1. Principe du protocole d’immunohistofluorescence .......................................... 38
2.8.2. Matériel .............................................................................................................. 38
2.8.3. Solutions ............................................................................................................. 38
2.8.4. Méthode ............................................................................................................. 39
2.8.5. Quantification de la surface des CML ................................................................ 39
3. Résultats et discussion ............................................................................................ 40
3.1. Génotypage des souris .............................................................................................. 40
3.2. Quantification des plaques d’athérosclérose ............................................................ 40
3.3. Quantification du collagène ...................................................................................... 41
3.4. Quantification des macrophages (CD68) ................................................................... 42
3.5. Quantification des cellules musculaires lisses (ASMA) ............................................. 43
Conclusion et perspectives ...................................................................................................... 46
Bibliographie ............................................................................................................................ 48
Annexes |
Permalink : |
./index.php?lvl=notice_display&id=65241 |
Mise au point de protocoles expérimentaux permettant l’identification de marqueurs associés au développement des plaques d’athérosclérose [TFE / Mémoire] / NICOLAS BAUDOIN, Auteur . - 2013. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français ( fre)
Mots-clés : |
BIOLOGIE MÉDICALE PLAQUES D'ATHEROSCLEROSE RECEPTEUR P2 ET P2Y6 ATHEROSCLEROSE LIPIDES ET LIPOPROTEINES GENOTYPAGE DES SOURIS CRYOSECTION MACROPHAGES CD68 CELLULES MUSCULAIRES LISSES (ASMA) OXYDATION DU CHOLESTEROL ARTERES Biologie médicale |
Index. décimale : |
TFE Bio Med TFE Biologie médicale |
Résumé : |
Ce Travail de Fin d’Etude a été réalisé dans le cadre de l’étude du rôle du récepteur P2Y6 dans une maladie inflammatoire des artères, l’athérosclérose. Cette étude est menée à l’Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire, de la Faculté de Médecine à l’Université Libre de Bruxelles.
L’athérosclérose est provoquée par l’entrée et l’oxydation du cholestérol dans la paroi des artères, ce qui amène les cellules endothéliales à recruter les cellules immunitaires de l’organisme que sont les monocytes. Ces derniers se différencient en macrophages et internalisent les LDL oxydés, se transformant alors en cellules spumeuses gorgées de lipides. Il s’en suit une migration et une prolifération des cellules musculaires lisses (CML) de la media qui secrètent de la matrice extracellulaire et forment la plaque fibreuse. Les plaques d’athérosclérose sont sujettes à des ruptures qui vont conduire à la formation de thrombi, obstruant ainsi la lumière artérielle.
Tout au long de ce travail, nous nous sommes penché sur la mise au point de plusieurs protocoles expérimentaux permettant d’identifier et de quantifier deux types cellulaires exprimant le récepteur P2Y6 : les macrophages et les CML. La technique utilisée est l’immunohistofluorescence via des anticorps spécifiques directement couplés à un fluorochrome ou non-couplés et avec l’utilisation d’un anticorps secondaire comme révélateur. Les plaques et le collagène sont également quantifiés via des colorations histochimiques.
Lors de nos expériences, nous avons pris pour modèle des souris génétiquement invalidées pour le gène codant l’Apolipoprotéine E puisque cette dernière protège les souris de l’athérosclérose.
Nous sommes parvenus à établir des protocoles qui permettront d’étudier le rôle in vivo du récepteur P2Y6 chez les macrophages et les CML. |
Note de contenu : |
TABLE DES MATIERES
Remerciements
Introduction générale ................................................................................................................ 8
Partie théorique ....................................................................................................................... 10
1. L’athérosclérose ...................................................................................................... 10
1.1. Les lipides et les lipoprotéines .................................................................................. 10
1.2. Structure d’une artère ............................................................................................... 12
1.3. Mécanismes moléculaires et cellulaires associés au développement de l’athérosclérose .................................................................................................................... 12
1.3.1 Initiation de la lésion .......................................................................................... 12
1.3.2 Inflammation ...................................................................................................... 13
1.3.3 Formation des cellules spumeuses .................................................................... 13
1.3.4 Formation des plaques fibreuses ....................................................................... 14
1.3.5 Évolution de la lésion ......................................................................................... 14
1.3.6 Thérapies actuelles ............................................................................................. 15
2. Le modèle murin pour l’athérosclérose .................................................................... 15
3. Composition des plaques athéromateuses : les types cellulaires .............................. 16
3.1. Les cellules endothéliales .......................................................................................... 16
3.2. Les macrophages ....................................................................................................... 17
3.3. Les cellules musculaires lisses ................................................................................... 17
4. Les récepteurs P2 .................................................................................................... 18
4.1. Les récepteurs P2X .................................................................................................... 18
4.2. Les récepteur P2Y ...................................................................................................... 19
4.2.1. Les GPCRs en général ......................................................................................... 19
4.2.2. Les P2Y ................................................................................................................ 19
5. Rôles des récepteurs P2Y dans l’athérosclérose ....................................................... 22
5.1. Rôle du récepteur P2Y13 dans le métabolisme des lipides ........................................ 22
5.2. Rôles dans la régulation de la pression sanguine et de l’endothélium ..................... 22
5.3. Rôle de P2Y1 Dans la réponse inflammatoire ............................................................ 23
5.4. Rôle de P2Y1 dans la prolifération des cellules endothéliales ................................... 23
5.5. Rôle de P2Y2 dans la prolifération des cellules musculaires ..................................... 23
6. Rôle de P2Y6 dans l’athérosclérose .......................................................................... 24
Partie pratique ......................................................................................................................... 26
1. But du travail .......................................................................................................... 26
2. Matériels et méthodes ............................................................................................ 27
2.1. Génotypage des souris .............................................................................................. 27
2.1.1. Principe ............................................................................................................... 27
2.1.2. Matériels ............................................................................................................ 27
2.1.3. Solutions ............................................................................................................. 27
2.1.4. Méthode ............................................................................................................. 28
2.2. Prélèvement des organes chez les souris .................................................................. 29
2.2.1. Matériels ............................................................................................................ 29
2.2.2. Solutions ............................................................................................................. 29
2.2.3. Méthode ............................................................................................................. 30
2.3. Coupe et enrobage des organes pour la cryosection ................................................ 30
2.3.1. Principe ............................................................................................................... 30
2.3.2. Matériels ............................................................................................................ 30
2.3.3. Solutions ............................................................................................................. 31
2.3.4. Méthode ............................................................................................................. 31
2.4. Confection des coupes au cryostat ........................................................................... 31
2.4.1. Principe ............................................................................................................... 31
2.4.2. Matériels ............................................................................................................ 32
2.4.3. Méthode (voir figure 13) .................................................................................... 32
2.5. Identification et quantification des plaques d’athéromes ........................................ 32
2.5.1. Principe de la coloration Oil Red ........................................................................ 32
2.5.2. Matériels ............................................................................................................ 32
2.5.3. Solution .............................................................................................................. 33
2.5.4. Méthode ............................................................................................................. 33
2.5.5. Quantification de la surface des plaques ........................................................... 33
2.6. Identification et quantification du collagène ............................................................ 33
2.6.1. Principe de la coloration Trichrome de Masson ................................................ 33
2.6.2. Matériels ............................................................................................................ 34
2.6.3. Solutions ............................................................................................................. 34
2.6.4. Méthode ............................................................................................................. 34
2.6.5. Quantification de la surface du collagène .......................................................... 35
2.7. Identification et quantification des macrophages (CD68) ....................................... 35
2.7.1. Principe de l’immunohistofluorescence ............................................................ 35
2.7.2. Matériel .............................................................................................................. 36
2.7.3. Solutions ............................................................................................................. 36
2.7.4. Méthode ............................................................................................................. 36
2.7.5. Quantification de la surface des macrophages .................................................. 37
2.8. Identification et quantification des cellules musculaires lisses (ASMA) ................... 38
2.8.1. Principe du protocole d’immunohistofluorescence .......................................... 38
2.8.2. Matériel .............................................................................................................. 38
2.8.3. Solutions ............................................................................................................. 38
2.8.4. Méthode ............................................................................................................. 39
2.8.5. Quantification de la surface des CML ................................................................ 39
3. Résultats et discussion ............................................................................................ 40
3.1. Génotypage des souris .............................................................................................. 40
3.2. Quantification des plaques d’athérosclérose ............................................................ 40
3.3. Quantification du collagène ...................................................................................... 41
3.4. Quantification des macrophages (CD68) ................................................................... 42
3.5. Quantification des cellules musculaires lisses (ASMA) ............................................. 43
Conclusion et perspectives ...................................................................................................... 46
Bibliographie ............................................................................................................................ 48
Annexes |
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