| Titre : |
Mise au point du dosage de la nicotine et de ses métabolites sur HPLC et validation du dosage de la cotinine sur UPLC |
| Type de document : |
TFE / Mémoire |
| Auteurs : |
Marie Antonnaux, Directeur de la recherche ; Laurence Galanti, Directeur de la recherche |
| Année de publication : |
2015 |
| Note générale : |
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. |
| Langues : |
Français (fre) |
| Mots-clés : |
biologie médicale CHU Mont-Godinne Tabacologie Dosage : nicotine dosage : cotinine UPLC Tabac // santé Nicotine : effets |
| Index. décimale : |
TFE Bio Med TFE Biologie médicale |
| Résumé : |
Résumé
Ce TFE est divisé en deux parties : la première est la validation du dosage de la cotinine sur l’UPLC et la deuxième est la mise au point du dosage de la nicotine et ses métabolites.
Pour le moment, l’évaluation de l’imprégnation tabagique est déterminée par le dosage de la cotinine qui s’effectue sur l’HPLC. Le temps d’analyse relativement long (20minutes), a justifié la mise au point de ce dosage sur UPLC où il ne dure plus que 6 minutes. La quantité de réactifs consommés est diminuée car le flux est plus faible. Transférer le dosage de la cotinine sur l’UPLC semble donc très avantageux. Pour valider cette méthode, différents paramètres ont dû être vérifiés : la répétabilité, la reproductibilité, la limite de détection, la limite de quantification, la linéarité, la récupération, la contamination inter échantillon et la corrélation. Chaque paramètre a été validé. Le transfert du dosage de la cotinine sur UPLC est donc autorisé.
Pour la mise au point du dosage de la nicotine et de ses métabolites, un protocole de base a été choisi à partir d’articles récents. La mise au point des conditions chromatographiques a d’abord été effectuée sur des solutions pures. Ensuite, des modifications ont été faites sur le protocole de base d’extraction : pH de l’échantillon, quantité échantillon et la nature du solvant d’élution. Pour terminer, une optimisation a été faite pour déterminer les conditions chromatographiques les plus performantes. Les résultats de cette mise au point sont des chromatogrammes où chaque pic d’intérêt est isolé et quantifié. L’anabasine est la seule molécule qui n’est pas visible sur le chromatogramme des échantillons positifs car sa concentration dans les urines est trop faible pour être détectée au moyen d’un spectrophotomètre UV-visible à barrette de diodes.
La suite de ce travail de fin d’étude serait de valider la méthode de dosage de la nicotine et de ses métabolites et d’ensuite la transférer sur UPLC. L’avantage de ce dosage serait une évaluation plus complète car en plus de la cotinine, la nicotine et la
trans-3’-hydroxycotinine seraient quantifiées. De plus, cette nouvelle méthode d’extraction ne nécessite plus d’utiliser du chloroforme comme antérieurement lors du dosage de la cotinine ce qui diminue la dangerosité pour le manipulateur. |
| Note de contenu : |
Table des matières
PRESENTATION DU LIEU DE STAGE : 5
INTRODUCTION : 6
1 CONTEXTE THEORIQUE : 8
1.1 CARTE D’IDENTITE DE LA NICOTINE : 8
1.2 EFFETS DE LA NICOTINE : 9
1.3 COMPOSITION D’UNE CIGARETTE : 10
1.4 METABOLISME DE DEGRADATION : 11
1.5 DERIVES DE LA NICOTINE : 12
1.6 RISQUES LIES AU TABAGISME : 13
1.7 INTERET DU DOSAGE : 15
1.8 DOSAGE DE LA NICOTINE ET DE SES METABOLITES : 16
1.8.1 Extraction du composé: 16
1.8.2 HPLC : 17
1.8.2.1 Phase mobile : 18
1.8.2.2 Colonne : 19
1.8.2.3 Dégazeur : 19
1.8.2.4 Pompe : 20
1.8.2.5 Injecteur : 20
1.8.2.6 Détecteur : 21
1.8.3 UPLC : 22
1.9 MISE AU POINT D’UNE METHODE EN CHROMATOGRAPHIE : 23
1.10 VALIDATION TECHNIQUE : 25
1.10.1 Répétabilité : 25
1.10.2 Reproductibilité : 25
1.10.3 Justesse : 26
1.10.4 Limite de détection : 26
1.10.5 Limite de quantification : 26
1.10.6 Linéarité : 26
1.10.7 Récupération : 27
1.10.8 Contamination inter échantillon : 27
1.10.9 Corrélation entre deux méthodes: 27
2 OBJECTIFS ET STRATEGIE : 28
3 MATERIEL ET METHODES : 28
3.1 MATERIEL : 28
3.1.1 Dosage de la nicotine et de ses métabolites: 28
3.1.2 Dosage de la cotinine : 30
3.2 METHODES : 31
3.2.1 Conditions expérimentales pour le dosage de la nicotine et de ses métabolites : 31
3.2.1.1 Paramètres modifiés pour la mise au point : 31
3.2.1.2 Protocole final : 31
3.2.2 Dosage de la cotinine : 33
3.2.2.1 Validation technique : 34
4 RESULTATS ET DISCUSSION : 37
4.1 MISE AU POINT DU DOSAGE DE LA NICOTINE : 37
4.1.1 Technique de chromatographie : 37
4.1.2 Développement de la technique extraction : 38
4.1.2.1 Premiers tests : 38
4.1.2.2 Modification des conditions HPLC : 39
4.1.2.3 Modification des conditions d’extraction : 41
4.1.3 Optimisation : 44
4.1.3.1 Gradient : 45
4.1.3.2 Flux : 46
4.1.3.3 Température de la colonne : 47
4.1.3.4 pH : 48
4.2 VALIDATION TECHNIQUE DU DOSAGE DE LA COTININE SUR UPLC : 49
4.2.1 Répétabilité : 49
4.2.2 Reproductibilité : 49
4.2.3 Limite de détection : 49
4.2.4 Limite de quantification : 50
4.2.5 Linéarité : 50
4.2.6 Récupération : 50
4.2.7 Contamination inter échantillon : 51
4.2.8 Corrélation entre les deux méthodes : 51
CONCLUSION : 53
BIBLIOGRAPHIE 55
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| Permalink : |
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Mise au point du dosage de la nicotine et de ses métabolites sur HPLC et validation du dosage de la cotinine sur UPLC [TFE / Mémoire] / Marie Antonnaux, Directeur de la recherche ; Laurence Galanti, Directeur de la recherche . - 2015. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français ( fre)
| Mots-clés : |
biologie médicale CHU Mont-Godinne Tabacologie Dosage : nicotine dosage : cotinine UPLC Tabac // santé Nicotine : effets |
| Index. décimale : |
TFE Bio Med TFE Biologie médicale |
| Résumé : |
Résumé
Ce TFE est divisé en deux parties : la première est la validation du dosage de la cotinine sur l’UPLC et la deuxième est la mise au point du dosage de la nicotine et ses métabolites.
Pour le moment, l’évaluation de l’imprégnation tabagique est déterminée par le dosage de la cotinine qui s’effectue sur l’HPLC. Le temps d’analyse relativement long (20minutes), a justifié la mise au point de ce dosage sur UPLC où il ne dure plus que 6 minutes. La quantité de réactifs consommés est diminuée car le flux est plus faible. Transférer le dosage de la cotinine sur l’UPLC semble donc très avantageux. Pour valider cette méthode, différents paramètres ont dû être vérifiés : la répétabilité, la reproductibilité, la limite de détection, la limite de quantification, la linéarité, la récupération, la contamination inter échantillon et la corrélation. Chaque paramètre a été validé. Le transfert du dosage de la cotinine sur UPLC est donc autorisé.
Pour la mise au point du dosage de la nicotine et de ses métabolites, un protocole de base a été choisi à partir d’articles récents. La mise au point des conditions chromatographiques a d’abord été effectuée sur des solutions pures. Ensuite, des modifications ont été faites sur le protocole de base d’extraction : pH de l’échantillon, quantité échantillon et la nature du solvant d’élution. Pour terminer, une optimisation a été faite pour déterminer les conditions chromatographiques les plus performantes. Les résultats de cette mise au point sont des chromatogrammes où chaque pic d’intérêt est isolé et quantifié. L’anabasine est la seule molécule qui n’est pas visible sur le chromatogramme des échantillons positifs car sa concentration dans les urines est trop faible pour être détectée au moyen d’un spectrophotomètre UV-visible à barrette de diodes.
La suite de ce travail de fin d’étude serait de valider la méthode de dosage de la nicotine et de ses métabolites et d’ensuite la transférer sur UPLC. L’avantage de ce dosage serait une évaluation plus complète car en plus de la cotinine, la nicotine et la
trans-3’-hydroxycotinine seraient quantifiées. De plus, cette nouvelle méthode d’extraction ne nécessite plus d’utiliser du chloroforme comme antérieurement lors du dosage de la cotinine ce qui diminue la dangerosité pour le manipulateur. |
| Note de contenu : |
Table des matières
PRESENTATION DU LIEU DE STAGE : 5
INTRODUCTION : 6
1 CONTEXTE THEORIQUE : 8
1.1 CARTE D’IDENTITE DE LA NICOTINE : 8
1.2 EFFETS DE LA NICOTINE : 9
1.3 COMPOSITION D’UNE CIGARETTE : 10
1.4 METABOLISME DE DEGRADATION : 11
1.5 DERIVES DE LA NICOTINE : 12
1.6 RISQUES LIES AU TABAGISME : 13
1.7 INTERET DU DOSAGE : 15
1.8 DOSAGE DE LA NICOTINE ET DE SES METABOLITES : 16
1.8.1 Extraction du composé: 16
1.8.2 HPLC : 17
1.8.2.1 Phase mobile : 18
1.8.2.2 Colonne : 19
1.8.2.3 Dégazeur : 19
1.8.2.4 Pompe : 20
1.8.2.5 Injecteur : 20
1.8.2.6 Détecteur : 21
1.8.3 UPLC : 22
1.9 MISE AU POINT D’UNE METHODE EN CHROMATOGRAPHIE : 23
1.10 VALIDATION TECHNIQUE : 25
1.10.1 Répétabilité : 25
1.10.2 Reproductibilité : 25
1.10.3 Justesse : 26
1.10.4 Limite de détection : 26
1.10.5 Limite de quantification : 26
1.10.6 Linéarité : 26
1.10.7 Récupération : 27
1.10.8 Contamination inter échantillon : 27
1.10.9 Corrélation entre deux méthodes: 27
2 OBJECTIFS ET STRATEGIE : 28
3 MATERIEL ET METHODES : 28
3.1 MATERIEL : 28
3.1.1 Dosage de la nicotine et de ses métabolites: 28
3.1.2 Dosage de la cotinine : 30
3.2 METHODES : 31
3.2.1 Conditions expérimentales pour le dosage de la nicotine et de ses métabolites : 31
3.2.1.1 Paramètres modifiés pour la mise au point : 31
3.2.1.2 Protocole final : 31
3.2.2 Dosage de la cotinine : 33
3.2.2.1 Validation technique : 34
4 RESULTATS ET DISCUSSION : 37
4.1 MISE AU POINT DU DOSAGE DE LA NICOTINE : 37
4.1.1 Technique de chromatographie : 37
4.1.2 Développement de la technique extraction : 38
4.1.2.1 Premiers tests : 38
4.1.2.2 Modification des conditions HPLC : 39
4.1.2.3 Modification des conditions d’extraction : 41
4.1.3 Optimisation : 44
4.1.3.1 Gradient : 45
4.1.3.2 Flux : 46
4.1.3.3 Température de la colonne : 47
4.1.3.4 pH : 48
4.2 VALIDATION TECHNIQUE DU DOSAGE DE LA COTININE SUR UPLC : 49
4.2.1 Répétabilité : 49
4.2.2 Reproductibilité : 49
4.2.3 Limite de détection : 49
4.2.4 Limite de quantification : 50
4.2.5 Linéarité : 50
4.2.6 Récupération : 50
4.2.7 Contamination inter échantillon : 51
4.2.8 Corrélation entre les deux méthodes : 51
CONCLUSION : 53
BIBLIOGRAPHIE 55
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Mise au point du dosage de la nicotine et de ses métabolites sur HPLC et validation du dosage de la cotinine sur UPLC
