Caractérisation du gène UGT72A2 codant pour une glycosyltransférase associée au stress oxydatif chez le peuplier / Nicolas Leurquin

Public ISBD Titre : Caractérisation du gène UGT72A2 codant pour une glycosyltransférase associée au stress oxydatif chez le peuplier Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Nicolas Leurquin, Auteur ; Jenny Pouyez, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie Année de publication : 2020 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Agronomie  AIBT Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : Dans une optique d’amélioration de la qualité du bois, le laboratoire de Biotechnologie Végétale de l’ULB a débuté des recherches visant à mieux comprendre le rôle des glycosyltransférases dans la formation des parois secondaires lignifiées. Ainsi, des chercheurs ont isolé le gène UGT72A2 chez l’hybride Populus tremula x alba. Ce gène est phylogénétiquement proche des gènes de la sous-famille UGT72E qui codent pour des glycosyltransférases impliquées dans la glycosylation des monolignols chez Arabidopsis thaliana. Afin d’étudier le rôle de UGT72A2, des lignées transgéniques sur-exprimant (sous le contrôle du promoteur CaMV35S - lignées OE) et d’autres sous-exprimant UGT72A2 (par interférence ARN - lignées RNAi) ont été produites. Une première caractérisation de UGT72A2 a montré que les lignées sous-exprimant le gène présentaient un jaunissement précoce des feuilles, pouvant être associé à un phénomène de stress oxydatif caractérisé par la présence de dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) dans la plante. Afin de confirmer ce phénomène de stress oxydatif et de comprendre l’implication de UGT72A2 dans la résistance à ce type de stress, différentes manipulations ont été réalisées sur des lignées RNAi, OE et des lignées de type sauvage (WT). Un dosage des chlorophylles, des phéophytines et des caroténoïdes a d’abord permis de confirmer que le jaunissement précoce des lignées RNAi était associé à une diminution des pigments foliaires. Ensuite, différents marqueurs de stress oxydatif ont été étudiés. Ainsi, l’augmentation de la peroxydation des lipides et l’augmentation de la quantité de protéasome 20S dans les feuilles semblent confirmer un stress oxydatif plus élevé dans les lignées RNAi que dans les lignées OE et WT. Un dosage des anthocyanes, molécules antioxydantes, a également été réalisé. La baisse de la concentration en anthocyanes dans les lignées RNAi montre une diminution de la capacité antioxydante dans ces lignées. Il semblerait donc que la sous-expression de UGT72A2 induise un stress oxydatif dans la plante. Pour finir, une série de manipulations a permis d’évaluer la résistance des différentes lignées de peupliers à un stress oxydatif provoqué par l’antimycine A et le méthyl viologène, deux herbicides qui engendrent la production de ROS respectivement au niveau des mitochondries et des chloroplastes. Étonnement, la lignée RNAi la plus proche du WT (pour l’antimycine A) et la lignée exprimant le moins UGT72A2 (pour le méthyl viologène) ont montré une meilleure résistance au stress oxydatif. Les manipulations effectuées ont ainsi confirmé les résultats des analyses antérieures et renforcé l'hypothèse de l'implication de UGT72A2 dans le phénomène de résistance au stress oxydatif. Ces recherches ouvrent dès lors la voie à d’autres expériences qui permettront de déterminer les facteurs régulant l’expression de UGT72A2. Note de contenu : Table des matières Remerciements Présentation du lieu de stage Introduction .............................................................................................................................. 10 1 Introduction théorique .............................................................................................. 11 1.1 Le peuplier .................................................................................................................. 11 1.1.1 Interférence par ARN .......................................................................................... 12 1.1.2 Production de peupliers sur-exprimant UGT72A2 ............................................. 14 1.1.3 Techniques de transformation génétique .......................................................... 14 1.2 Les glycosyltransférases ............................................................................................. 15 1.3 Le stress oxydatif ........................................................................................................ 19 1.4 Analyses des lignées de peupliers transgéniques sous-exprimant UGT72A2 ........... 22 2 Objectifs du travail de fin d’études ............................................................................ 25 3 Matériel et méthodes ................................................................................................ 26 3.1 Calcul du niveau d’expression de UGT72A2 chez les peupliers transgéniques OE500 .................................................................................................................................... 27 3.1.1 Extraction de l’ARN ............................................................................................. 27 3.1.2 Dosage au NanodropTM ....................................................................................... 28 3.1.3 Vérification de l’intégrité de l’ARN par électrophorèse ..................................... 28 3.1.4 Transcription inverse .......................................................................................... 29 3.1.5 PCR-quantitative (qPCR) ..................................................................................... 29 3.2 Dosage de la chlorophylle, de la phéophytine et des caroténoïdes .......................... 30 3.3 Analyse de la peroxydation des lipides et dosage des anthocyanes ......................... 31 3.4 Quantification du protéasome 20S ............................................................................ 32 3.5 Mesure de l’activité PAL ............................................................................................. 33 3.6 Analyse de la résistance au stress oxydatif ................................................................ 34 3.6.1 Analyse de la résistance à l’antimycine A ........................................................... 35 3.6.2 Analyse de la résistance au méthyl viologène .................................................... 36 3.6.3 Inhibition de l’alternative oxydase ..................................................................... 37 3.7 Tests GUS ................................................................................................................... 38 4 Résultats et discussions ............................................................................................. 40 4.1 Analyse phénotypique des lignées sur-exprimant UGT72A2 .................................... 40 4.2 Calcul du degré d’expression de UGT72A2 chez les peupliers transgéniques OE500 ….. ............................................................................................................................... 40 4.3 Dosage de la chlorophylle, de la phéophytine et des caroténoïdes dans des feuilles de peupliers âgés de 4 mois ....................................................................................... 45 4.3.1 Dosage des chlorophylles a et b ......................................................................... 45 4.3.2 Dosage des phéophytines ................................................................................... 47 4.3.3 Dosage des caroténoïdes .................................................................................... 48 4.4 Analyse de la peroxydation des lipides et dosage des anthocyanes dans des feuilles de peupliers âgés de 4 mois ....................................................................................... 49 4.5 Quantification du protéasome 20S dans des feuilles de peupliers âgés de 4 mois .. 51 4.6 Mesure de l’activité PAL des feuilles de peupliers âgés de 4 mois ............................ 52 4.7 Analyse de la résistance au stress oxydatif des feuilles de peupliers âgés de 5 mois .................................................................................................................................... 53 4.7.1 Analyse de la résistance à l’Antimycine A ........................................................... 53 4.7.2 Analyse de la résistance au méthyl viologène (MV) et méthyl viologène + SHAM (MVS) ................................................................................................................... 56 Conclusion et perspectives ....................................................................................................... 63 Bibliographie ............................................................................................................................ 65 Annexes Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89177 Caractérisation du gène UGT72A2 codant pour une glycosyltransférase associée au stress oxydatif chez le peuplier [TFE / Mémoire] / Nicolas Leurquin, Auteur ; Jenny Pouyez, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie, 2020. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Agronomie  AIBT Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : Dans une optique d’amélioration de la qualité du bois, le laboratoire de Biotechnologie Végétale de l’ULB a débuté des recherches visant à mieux comprendre le rôle des glycosyltransférases dans la formation des parois secondaires lignifiées. Ainsi, des chercheurs ont isolé le gène UGT72A2 chez l’hybride Populus tremula x alba. Ce gène est phylogénétiquement proche des gènes de la sous-famille UGT72E qui codent pour des glycosyltransférases impliquées dans la glycosylation des monolignols chez Arabidopsis thaliana. Afin d’étudier le rôle de UGT72A2, des lignées transgéniques sur-exprimant (sous le contrôle du promoteur CaMV35S - lignées OE) et d’autres sous-exprimant UGT72A2 (par interférence ARN - lignées RNAi) ont été produites. Une première caractérisation de UGT72A2 a montré que les lignées sous-exprimant le gène présentaient un jaunissement précoce des feuilles, pouvant être associé à un phénomène de stress oxydatif caractérisé par la présence de dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) dans la plante. Afin de confirmer ce phénomène de stress oxydatif et de comprendre l’implication de UGT72A2 dans la résistance à ce type de stress, différentes manipulations ont été réalisées sur des lignées RNAi, OE et des lignées de type sauvage (WT). Un dosage des chlorophylles, des phéophytines et des caroténoïdes a d’abord permis de confirmer que le jaunissement précoce des lignées RNAi était associé à une diminution des pigments foliaires. Ensuite, différents marqueurs de stress oxydatif ont été étudiés. Ainsi, l’augmentation de la peroxydation des lipides et l’augmentation de la quantité de protéasome 20S dans les feuilles semblent confirmer un stress oxydatif plus élevé dans les lignées RNAi que dans les lignées OE et WT. Un dosage des anthocyanes, molécules antioxydantes, a également été réalisé. La baisse de la concentration en anthocyanes dans les lignées RNAi montre une diminution de la capacité antioxydante dans ces lignées. Il semblerait donc que la sous-expression de UGT72A2 induise un stress oxydatif dans la plante. Pour finir, une série de manipulations a permis d’évaluer la résistance des différentes lignées de peupliers à un stress oxydatif provoqué par l’antimycine A et le méthyl viologène, deux herbicides qui engendrent la production de ROS respectivement au niveau des mitochondries et des chloroplastes. Étonnement, la lignée RNAi la plus proche du WT (pour l’antimycine A) et la lignée exprimant le moins UGT72A2 (pour le méthyl viologène) ont montré une meilleure résistance au stress oxydatif. Les manipulations effectuées ont ainsi confirmé les résultats des analyses antérieures et renforcé l'hypothèse de l'implication de UGT72A2 dans le phénomène de résistance au stress oxydatif. Ces recherches ouvrent dès lors la voie à d’autres expériences qui permettront de déterminer les facteurs régulant l’expression de UGT72A2. Note de contenu : Table des matières Remerciements Présentation du lieu de stage Introduction .............................................................................................................................. 10 1 Introduction théorique .............................................................................................. 11 1.1 Le peuplier .................................................................................................................. 11 1.1.1 Interférence par ARN .......................................................................................... 12 1.1.2 Production de peupliers sur-exprimant UGT72A2 ............................................. 14 1.1.3 Techniques de transformation génétique .......................................................... 14 1.2 Les glycosyltransférases ............................................................................................. 15 1.3 Le stress oxydatif ........................................................................................................ 19 1.4 Analyses des lignées de peupliers transgéniques sous-exprimant UGT72A2 ........... 22 2 Objectifs du travail de fin d’études ............................................................................ 25 3 Matériel et méthodes ................................................................................................ 26 3.1 Calcul du niveau d’expression de UGT72A2 chez les peupliers transgéniques OE500 .................................................................................................................................... 27 3.1.1 Extraction de l’ARN ............................................................................................. 27 3.1.2 Dosage au NanodropTM ....................................................................................... 28 3.1.3 Vérification de l’intégrité de l’ARN par électrophorèse ..................................... 28 3.1.4 Transcription inverse .......................................................................................... 29 3.1.5 PCR-quantitative (qPCR) ..................................................................................... 29 3.2 Dosage de la chlorophylle, de la phéophytine et des caroténoïdes .......................... 30 3.3 Analyse de la peroxydation des lipides et dosage des anthocyanes ......................... 31 3.4 Quantification du protéasome 20S ............................................................................ 32 3.5 Mesure de l’activité PAL ............................................................................................. 33 3.6 Analyse de la résistance au stress oxydatif ................................................................ 34 3.6.1 Analyse de la résistance à l’antimycine A ........................................................... 35 3.6.2 Analyse de la résistance au méthyl viologène .................................................... 36 3.6.3 Inhibition de l’alternative oxydase ..................................................................... 37 3.7 Tests GUS ................................................................................................................... 38 4 Résultats et discussions ............................................................................................. 40 4.1 Analyse phénotypique des lignées sur-exprimant UGT72A2 .................................... 40 4.2 Calcul du degré d’expression de UGT72A2 chez les peupliers transgéniques OE500 ….. ............................................................................................................................... 40 4.3 Dosage de la chlorophylle, de la phéophytine et des caroténoïdes dans des feuilles de peupliers âgés de 4 mois ....................................................................................... 45 4.3.1 Dosage des chlorophylles a et b ......................................................................... 45 4.3.2 Dosage des phéophytines ................................................................................... 47 4.3.3 Dosage des caroténoïdes .................................................................................... 48 4.4 Analyse de la peroxydation des lipides et dosage des anthocyanes dans des feuilles de peupliers âgés de 4 mois ....................................................................................... 49 4.5 Quantification du protéasome 20S dans des feuilles de peupliers âgés de 4 mois .. 51 4.6 Mesure de l’activité PAL des feuilles de peupliers âgés de 4 mois ............................ 52 4.7 Analyse de la résistance au stress oxydatif des feuilles de peupliers âgés de 5 mois .................................................................................................................................... 53 4.7.1 Analyse de la résistance à l’Antimycine A ........................................................... 53 4.7.2 Analyse de la résistance au méthyl viologène (MV) et méthyl viologène + SHAM (MVS) ................................................................................................................... 56 Conclusion et perspectives ....................................................................................................... 63 Bibliographie ............................................................................................................................ 65 Annexes Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89177

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