Evaluation pré-clinique in vitro de candidats médicaments en vue d’un traitement du gliome infiltrant du tronc cérébral et mise à l’essai de nouveaux tests de quantification de l’apoptose et de la nécrose in vitro. / Mélanie Debroux

Public ISBD Titre : Evaluation pré-clinique in vitro de candidats médicaments en vue d’un traitement du gliome infiltrant du tronc cérébral et mise à l’essai de nouveaux tests de quantification de l’apoptose et de la nécrose in vitro. Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Mélanie Debroux, Auteur ; Yves Collette, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2020 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les cellules tumorales présentent plusieurs caractéristiques communes dont certaines seront étudiées dans ce travail : elles acquièrent la caractéristique d’immortalité, une résistance au processus de mort cellulaire programmée, développent l’angiogenèse, échappent au contrôle des suppresseurs de tumeurs, présentent un maintien de la signalisation proliférative, et enfin ont la capacité d’envahir d’autres tissus. Le premier objectif de ce travail est d’étudier l’effet de drogues ayant différentes cibles sur des cellules de DIPG. Il s’agit du gliome infiltrant du tronc cérébral, sorte de cancer touchant surtout les enfants. Cette tumeur présente une localisation particulièrement difficile à atteindre, rendant toute ablation chirurgicale impossible. En plus de cela, la barrière hémato-encéphalique semble empêcher l’accession à la cible des traitements chimiothérapeutiques habituels. Il est donc indispensable de trouver de potentiels candidats médicaments pouvant détruire ces cellules. Cela se fait en testant ces cellules sur un panel de 81 drogues afin de mettre en évidence des sensibilités et/ou résistances par la méthode de chemogramme. Ces drogues peuvent démontrer d’éventuelles cibles thérapeutiques pour ce gliome et suggérer des candidats médicaments pouvant enrayer la prolifération de cette tumeur. Le second objectif de ce stage est d’évaluer l’intérêt de différents kits permettant de détecter la mort cellulaire. Ce phénomène survient généralement par apoptose, lorsque les cellules normales subissent des variations venant de l’environnement et induisent leur mort pour éviter d’acquérir des mutations. Les cellules cancéreuses, quant à elles, présentent une inhibition de cette apoptose « normale » et se multiplient de manière incontrôlée. Afin d’étudier les voies de mort cellulaire (qui sont principalement l’apoptose et la nécrose), les cellules sont mises en présence de drogues connues pour les détruire. Par l’intermédiaire de kits commerciaux, il est possible de détecter la cytotoxicité, l’apoptose et/ou la nécrose. La cytotoxicité sera donc évaluée par luminescence par libération de LDH, l’apoptose sera mesurée également par luminescence grâce au mouvement de flip-flop de phospholipides membranaires, et enfin la nécrose sera évaluée par fluorescence lors de la libération de l’ADN par dégradations membranaires. Note de contenu : Table des matières Remerciements .......................................................................................................................... 4 Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 7 1. Introduction générale ......................................................................................................... 8 1.1. Le cancer ...................................................................................................................... 8 1.1.1 Description ................................................................................................................. 8 1.1.2 Traitements ................................................................................................................ 8 1.1.3 Essais cliniques ........................................................................................................... 9 1.2. Caractéristiques des cellules tumorales .................................................................... 10 1.3. Etude du cas du gliome infiltrant du tronc cérébral.................................................. 12 1.3.1 Description de la pathologie .................................................................................... 12 1.3.2 Cas particulier de la mutation H3.3 K27M ............................................................... 13 1.3.3 Chemogramme ........................................................................................................ 15 1.4. Tests de quantification de la nécrose et de l’apoptose ............................................ 16 1.4.1 Description du processus apoptotique .................................................................... 16 1.4.2 Description du processus nécrotique ...................................................................... 17 1.4.3 Cellules utilisées et pathologie associée .................................................................. 17 2. Objectifs et stratégies ....................................................................................................... 18 2.1. Recherche de thérapies efficaces pour le DIPG ........................................................ 18 2.2. Mise au point de tests de mesure de la mort cellulaire ............................................ 19 2.2.1 LDH ........................................................................................................................... 19 2.2.2 CellTox Green ........................................................................................................... 19 2.2.3 Annexin .................................................................................................................... 19 3. Matériel et méthode ......................................................................................................... 20 3.1. Lignées cellulaires ...................................................................................................... 20 3.2. Procédure de congélation ......................................................................................... 20 3.3. Procédure de décongélation ..................................................................................... 21 3.4. Entretien des cultures ................................................................................................ 21 3.4.1 MOLM 14 ................................................................................................................. 21 3.4.2 RES259 ...................................................................................................................... 22 3.5. Dilutions des drogues et traitement des cellules ...................................................... 22 3.6. CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay ........................................................ 24 3.6.1 Principe du kit .......................................................................................................... 24 3.6.2 Calcul de l’EC50 par logiciel GraphPad Prism .......................................................... 25 3.7. Temps de doublement RES259 .................................................................................. 26 3.8. MycoAlert .................................................................................................................. 27 3.9. Chemogramme RES259 ............................................................................................. 30 3.10 LDH-GloTM Cytotoxicity Assay .................................................................................... 33 3.11 CellTox Green Cytotoxicity Assay .............................................................................. 35 3.12 RealTime-Glo Annexin-V Apoptosis and Necrosis Assay ........................................... 36 4. Résultats et discussion ...................................................................................................... 38 4.1. Recherche de cibles thérapeutiques du DIPG ........................................................... 38 4.1.1 Evaluation du nombre de cellules à ensemencer pour chaque lignée de RES259 en vue d’un chemogramme ................................................................................................... 39 4.1.2 Chemogramme RES259 WT, RES259 H3, RES259 H3K27M et évaluation des EC50 pour les 81 drogues testées .............................................................................................. 40 4.2. Mise à l’essai de kits évaluant la cytotoxicité d’une drogue sur les MOLM14 ......... 45 4.2.1 LDH-Glo Cytotoxicity Assay : détection de la cytotoxicité par luminescence ......... 46 4.2.2 CellTox Green Cytotoxicity Assay : mesure de la nécrose par détection en fluorescence ...................................................................................................................... 48 4.2.3 RealTime-Glo Cytotoxicity Assay : détection de l’apoptose par mesure de la luminescence et détection de la nécrose par mesure de la fluorescence ....................... 51 4.2.4 Perspectives de ces différents kits ........................................................................... 54 Conclusions ............................................................................................................................... 56 Recherche de candidats médicaments en vue du traitement du DIPG ............................... 56 Mise à l’essai de tests évaluant la cytotoxicité et le processus de mort cellulaire d’une drogue sur une culture cellulaire ......................................................................................... 56 Bibliographie ............................................................................................................................ 57 Annexes .................................................................................................................................... 61 Résumé ..................................................................................................................................... 64 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89143 Evaluation pré-clinique in vitro de candidats médicaments en vue d’un traitement du gliome infiltrant du tronc cérébral et mise à l’essai de nouveaux tests de quantification de l’apoptose et de la nécrose in vitro. [TFE / Mémoire] / Mélanie Debroux, Auteur ; Yves Collette, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2020. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les cellules tumorales présentent plusieurs caractéristiques communes dont certaines seront étudiées dans ce travail : elles acquièrent la caractéristique d’immortalité, une résistance au processus de mort cellulaire programmée, développent l’angiogenèse, échappent au contrôle des suppresseurs de tumeurs, présentent un maintien de la signalisation proliférative, et enfin ont la capacité d’envahir d’autres tissus. Le premier objectif de ce travail est d’étudier l’effet de drogues ayant différentes cibles sur des cellules de DIPG. Il s’agit du gliome infiltrant du tronc cérébral, sorte de cancer touchant surtout les enfants. Cette tumeur présente une localisation particulièrement difficile à atteindre, rendant toute ablation chirurgicale impossible. En plus de cela, la barrière hémato-encéphalique semble empêcher l’accession à la cible des traitements chimiothérapeutiques habituels. Il est donc indispensable de trouver de potentiels candidats médicaments pouvant détruire ces cellules. Cela se fait en testant ces cellules sur un panel de 81 drogues afin de mettre en évidence des sensibilités et/ou résistances par la méthode de chemogramme. Ces drogues peuvent démontrer d’éventuelles cibles thérapeutiques pour ce gliome et suggérer des candidats médicaments pouvant enrayer la prolifération de cette tumeur. Le second objectif de ce stage est d’évaluer l’intérêt de différents kits permettant de détecter la mort cellulaire. Ce phénomène survient généralement par apoptose, lorsque les cellules normales subissent des variations venant de l’environnement et induisent leur mort pour éviter d’acquérir des mutations. Les cellules cancéreuses, quant à elles, présentent une inhibition de cette apoptose « normale » et se multiplient de manière incontrôlée. Afin d’étudier les voies de mort cellulaire (qui sont principalement l’apoptose et la nécrose), les cellules sont mises en présence de drogues connues pour les détruire. Par l’intermédiaire de kits commerciaux, il est possible de détecter la cytotoxicité, l’apoptose et/ou la nécrose. La cytotoxicité sera donc évaluée par luminescence par libération de LDH, l’apoptose sera mesurée également par luminescence grâce au mouvement de flip-flop de phospholipides membranaires, et enfin la nécrose sera évaluée par fluorescence lors de la libération de l’ADN par dégradations membranaires. Note de contenu : Table des matières Remerciements .......................................................................................................................... 4 Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 7 1. Introduction générale ......................................................................................................... 8 1.1. Le cancer ...................................................................................................................... 8 1.1.1 Description ................................................................................................................. 8 1.1.2 Traitements ................................................................................................................ 8 1.1.3 Essais cliniques ........................................................................................................... 9 1.2. Caractéristiques des cellules tumorales .................................................................... 10 1.3. Etude du cas du gliome infiltrant du tronc cérébral.................................................. 12 1.3.1 Description de la pathologie .................................................................................... 12 1.3.2 Cas particulier de la mutation H3.3 K27M ............................................................... 13 1.3.3 Chemogramme ........................................................................................................ 15 1.4. Tests de quantification de la nécrose et de l’apoptose ............................................ 16 1.4.1 Description du processus apoptotique .................................................................... 16 1.4.2 Description du processus nécrotique ...................................................................... 17 1.4.3 Cellules utilisées et pathologie associée .................................................................. 17 2. Objectifs et stratégies ....................................................................................................... 18 2.1. Recherche de thérapies efficaces pour le DIPG ........................................................ 18 2.2. Mise au point de tests de mesure de la mort cellulaire ............................................ 19 2.2.1 LDH ........................................................................................................................... 19 2.2.2 CellTox Green ........................................................................................................... 19 2.2.3 Annexin .................................................................................................................... 19 3. Matériel et méthode ......................................................................................................... 20 3.1. Lignées cellulaires ...................................................................................................... 20 3.2. Procédure de congélation ......................................................................................... 20 3.3. Procédure de décongélation ..................................................................................... 21 3.4. Entretien des cultures ................................................................................................ 21 3.4.1 MOLM 14 ................................................................................................................. 21 3.4.2 RES259 ...................................................................................................................... 22 3.5. Dilutions des drogues et traitement des cellules ...................................................... 22 3.6. CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay ........................................................ 24 3.6.1 Principe du kit .......................................................................................................... 24 3.6.2 Calcul de l’EC50 par logiciel GraphPad Prism .......................................................... 25 3.7. Temps de doublement RES259 .................................................................................. 26 3.8. MycoAlert .................................................................................................................. 27 3.9. Chemogramme RES259 ............................................................................................. 30 3.10 LDH-GloTM Cytotoxicity Assay .................................................................................... 33 3.11 CellTox Green Cytotoxicity Assay .............................................................................. 35 3.12 RealTime-Glo Annexin-V Apoptosis and Necrosis Assay ........................................... 36 4. Résultats et discussion ...................................................................................................... 38 4.1. Recherche de cibles thérapeutiques du DIPG ........................................................... 38 4.1.1 Evaluation du nombre de cellules à ensemencer pour chaque lignée de RES259 en vue d’un chemogramme ................................................................................................... 39 4.1.2 Chemogramme RES259 WT, RES259 H3, RES259 H3K27M et évaluation des EC50 pour les 81 drogues testées .............................................................................................. 40 4.2. Mise à l’essai de kits évaluant la cytotoxicité d’une drogue sur les MOLM14 ......... 45 4.2.1 LDH-Glo Cytotoxicity Assay : détection de la cytotoxicité par luminescence ......... 46 4.2.2 CellTox Green Cytotoxicity Assay : mesure de la nécrose par détection en fluorescence ...................................................................................................................... 48 4.2.3 RealTime-Glo Cytotoxicity Assay : détection de l’apoptose par mesure de la luminescence et détection de la nécrose par mesure de la fluorescence ....................... 51 4.2.4 Perspectives de ces différents kits ........................................................................... 54 Conclusions ............................................................................................................................... 56 Recherche de candidats médicaments en vue du traitement du DIPG ............................... 56 Mise à l’essai de tests évaluant la cytotoxicité et le processus de mort cellulaire d’une drogue sur une culture cellulaire ......................................................................................... 56 Bibliographie ............................................................................................................................ 57 Annexes .................................................................................................................................... 61 Résumé ..................................................................................................................................... 64 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=89143

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