Etude des mécanismes moléculaires contrôlant la réponse chimiotactique de la bactérie Caulobacter crescentus face au cuivre / Vincent Paquet

Public ISBD Titre : Etude des mécanismes moléculaires contrôlant la réponse chimiotactique de la bactérie Caulobacter crescentus face au cuivre Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Vincent Paquet, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Notre environnement est constamment soumis à des variations de température, de concentration en CO2 dans l’air, ou encore à la présence de produits toxiques dans les mers ou les océans. L’augmentation de la concentration en cuivre (Cu) dans les eaux provoquant des stress oxydatifs pour les bactéries qui y sont exposées en est un exemple. Pour éviter des troubles métaboliques, les bactéries développent divers mécanismes de réponses adaptatifs. Caulobacter crescentus est un exemple de ces bactéries qui possède un mécanisme spécifique mis en oeuvre pour résister à ces variations extérieures. En effet, cet organisme aquatique possède un cycle cellulaire assez particulier. Son cycle cellulaire donne naissance à deux cellules filles totalement différentes que ce soit morphologiquement ou fonctionnellement. Ces deux cellules sont appelées stalked et swarmer. Ces deux cellules réagissent différemment dans un milieu ou la concentration en Cu est stressante. D’un côté, la cellule stalked possède un système appelé PcoAB qui lui permet de réguler sa concentration intracellulaire en Cu et de l’autre côté, la cellule swarmer peut à l’aide de son flagelle s’éloigner de cet environnement présentant le stress dû au Cu. Ce mécanisme est d’ailleurs appelé le chimiotactisme. En ce moment, une étude visant à caractériser le chimiotactisme de C. crescentus est menée dans le laboratoire de l’URBM. Ce travail de fin d’étude s’inscrit dans le cadre de cette recherche. L’objectif premier de ce travail est de mettre au point deux protocoles simples et rapides qui permettent une mise en évidence directe d’un mouvement dû à ce chimiotactisme. Ces deux expériences se basent sur des principes différents, l’une se base sur des gouttières de nage et l’autre se base sur une plaque 96 puits. Ces deux expérimentations seront adaptées depuis un protocole standard existant afin de trouver les conditions optimales pour visualiser significativement un mouvement chimiotactique. L’autre axe de ce travail vise à caractériser une protéine reconnue comme un acteur potentiellement important dans ce processus chimiotactique. Pour ce faire, un protocole de surexpression optimale de cette protéine sera mis au point sur base d’un procédé existant et utilisé pour la surexpression d’autres protéines. Pour caractériser cette protéine après surexpression, elle sera purifiée et cristallisée pour en étudier sa structure tridimensionnelle. Note de contenu : Présentation du lieu de stage ................................................................................................ 9 Introduction générale ............................................................................................................11 1. Contexte théorique ........................................................................................................13 1.1 Caulobacter crescentus ..........................................................................................13 1.2 Chimiotactisme .......................................................................................................15 1.3 Methyl-accepting Chemotaxis Protein (MCP) .........................................................17 2. Contexte de la recherche et objectifs .............................................................................19 3. Matériel et méthode .......................................................................................................21 3.1 Test gouttière : Protocole standard .........................................................................21 3.1.1 1ere mise au point.............................................................................................22 3.1.2 2e mise au point...............................................................................................22 3.1.3 3e mise au point...............................................................................................23 3.2 Test de chimiotactisme en plaque 96 puits : protocole standard .............................24 3.2.1 1ere mise au point.............................................................................................25 3.2.2 2e mise au point...............................................................................................26 3.2.3 3e mise au point...............................................................................................27 3.3 Production de souche BL21-pET28a-mcpP ............................................................28 3.3.1 Construction souche BL21-pET28a-mcpP .......................................................28 3.4 Surexpression de BL21-pET28A-mcpP ..................................................................32 3.4.1 Cultures LB-Kan en petit volume de BL21-pET28a-mcpP ...............................32 3.4.2 Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction à l’IPTG en petit volume ...........33 4. Résultats et discussion ..................................................................................................35 4.1 Gouttières ..............................................................................................................35 4.1.1 1ere mise au point .............................................................................................35 4.1.2 2e mise au point...............................................................................................36 4.1.3 3e mise au point...............................................................................................38 4.2 Test de chimiotactisme en Plaque 96 puits ............................................................40 4.2.1 1ere mise au point.............................................................................................40 4.2.2 2e mise au point...............................................................................................41 4.2.3 3e mise au point...............................................................................................42 4.3 Surexpression de McpP .........................................................................................43 4.3.1 Construction de la souche BL21-pET28a-mcpP ..............................................43 4.3.2 Vérification de la surexpression de BL21-pET28a-mcpP .................................45 Conclusion ...........................................................................................................................47 Bibliographie ........................................................................................................................49 Liste des figures ...................................................................................................................50 Liste des tableaux ................................................................................................................50 Annexes Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79997 Etude des mécanismes moléculaires contrôlant la réponse chimiotactique de la bactérie Caulobacter crescentus face au cuivre [TFE / Mémoire] / Vincent Paquet, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Notre environnement est constamment soumis à des variations de température, de concentration en CO2 dans l’air, ou encore à la présence de produits toxiques dans les mers ou les océans. L’augmentation de la concentration en cuivre (Cu) dans les eaux provoquant des stress oxydatifs pour les bactéries qui y sont exposées en est un exemple. Pour éviter des troubles métaboliques, les bactéries développent divers mécanismes de réponses adaptatifs. Caulobacter crescentus est un exemple de ces bactéries qui possède un mécanisme spécifique mis en oeuvre pour résister à ces variations extérieures. En effet, cet organisme aquatique possède un cycle cellulaire assez particulier. Son cycle cellulaire donne naissance à deux cellules filles totalement différentes que ce soit morphologiquement ou fonctionnellement. Ces deux cellules sont appelées stalked et swarmer. Ces deux cellules réagissent différemment dans un milieu ou la concentration en Cu est stressante. D’un côté, la cellule stalked possède un système appelé PcoAB qui lui permet de réguler sa concentration intracellulaire en Cu et de l’autre côté, la cellule swarmer peut à l’aide de son flagelle s’éloigner de cet environnement présentant le stress dû au Cu. Ce mécanisme est d’ailleurs appelé le chimiotactisme. En ce moment, une étude visant à caractériser le chimiotactisme de C. crescentus est menée dans le laboratoire de l’URBM. Ce travail de fin d’étude s’inscrit dans le cadre de cette recherche. L’objectif premier de ce travail est de mettre au point deux protocoles simples et rapides qui permettent une mise en évidence directe d’un mouvement dû à ce chimiotactisme. Ces deux expériences se basent sur des principes différents, l’une se base sur des gouttières de nage et l’autre se base sur une plaque 96 puits. Ces deux expérimentations seront adaptées depuis un protocole standard existant afin de trouver les conditions optimales pour visualiser significativement un mouvement chimiotactique. L’autre axe de ce travail vise à caractériser une protéine reconnue comme un acteur potentiellement important dans ce processus chimiotactique. Pour ce faire, un protocole de surexpression optimale de cette protéine sera mis au point sur base d’un procédé existant et utilisé pour la surexpression d’autres protéines. Pour caractériser cette protéine après surexpression, elle sera purifiée et cristallisée pour en étudier sa structure tridimensionnelle. Note de contenu : Présentation du lieu de stage ................................................................................................ 9 Introduction générale ............................................................................................................11 1. Contexte théorique ........................................................................................................13 1.1 Caulobacter crescentus ..........................................................................................13 1.2 Chimiotactisme .......................................................................................................15 1.3 Methyl-accepting Chemotaxis Protein (MCP) .........................................................17 2. Contexte de la recherche et objectifs .............................................................................19 3. Matériel et méthode .......................................................................................................21 3.1 Test gouttière : Protocole standard .........................................................................21 3.1.1 1ere mise au point.............................................................................................22 3.1.2 2e mise au point...............................................................................................22 3.1.3 3e mise au point...............................................................................................23 3.2 Test de chimiotactisme en plaque 96 puits : protocole standard .............................24 3.2.1 1ere mise au point.............................................................................................25 3.2.2 2e mise au point...............................................................................................26 3.2.3 3e mise au point...............................................................................................27 3.3 Production de souche BL21-pET28a-mcpP ............................................................28 3.3.1 Construction souche BL21-pET28a-mcpP .......................................................28 3.4 Surexpression de BL21-pET28A-mcpP ..................................................................32 3.4.1 Cultures LB-Kan en petit volume de BL21-pET28a-mcpP ...............................32 3.4.2 Vérification sur gel SDS-PAGE de l’induction à l’IPTG en petit volume ...........33 4. Résultats et discussion ..................................................................................................35 4.1 Gouttières ..............................................................................................................35 4.1.1 1ere mise au point .............................................................................................35 4.1.2 2e mise au point...............................................................................................36 4.1.3 3e mise au point...............................................................................................38 4.2 Test de chimiotactisme en Plaque 96 puits ............................................................40 4.2.1 1ere mise au point.............................................................................................40 4.2.2 2e mise au point...............................................................................................41 4.2.3 3e mise au point...............................................................................................42 4.3 Surexpression de McpP .........................................................................................43 4.3.1 Construction de la souche BL21-pET28a-mcpP ..............................................43 4.3.2 Vérification de la surexpression de BL21-pET28a-mcpP .................................45 Conclusion ...........................................................................................................................47 Bibliographie ........................................................................................................................49 Liste des figures ...................................................................................................................50 Liste des tableaux ................................................................................................................50 Annexes Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79997

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