Étude de la phosphosérine phosphatase de Mycobacterium marinum : Production, purification et détermination de paramètres enzymatiques. / Adrien Lesne

Public ISBD Titre : Étude de la phosphosérine phosphatase de Mycobacterium marinum : Production, purification et détermination de paramètres enzymatiques. Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Adrien Lesne, Auteur ; Jenny Pouyez, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : 1 INTRODUCTION 7 1.1 LA SÉRINE 7 1.1.1 Fonctions de la sérine 7 1.1.2 Voie phosphorylée de la sérine 7 1.2 LES PHOSPHOSÉRINE PHOSPHATASES 8 1.2.1 Structure 9 1.2.1.1 Domaine PSP 9 1.2.1.2 Domaine ACT 10 1.2.2 Fonctions 10 1.2.2.1 Mécanisme catalytique du domaine des PSP 10 1.2.3 Études de PSP de différents organismes 11 1.2.3.1 Alignement de séquences des PSP 12 1.3 CARACTÉRISATION DES ENZYMES 13 1.3.1 La cinétique enzymatique 13 1.3.2 Paramètres étudiés influençant l’activité des enzymes 15 1.3.2.1 La température 15 1.3.2.2 Le pH 16 1.3.2.3 Cofacteurs métalliques 17 2 OBJECTIFS ET STRATÉGIES 18 2.1 OBJECTIFS ET STRATÉGIES 18 3 MATÉRIELS ET MÉTHODES 19 3.1 PRINCIPES 19 3.1.1 Expressions des PSP 19 3.1.1.1 Les bactéries Escherichia coli Bl21 DE3 19 3.1.1.2 Le plasmide pAVA0421 19 3.1.1.3 La transformation bactérienne 20 3.1.1.4 Culture 21 3.1.1.5 L’induction 22 3.1.2 Purification de la PSP de M.marinum 23 3.1.2.1 La Lyse bactérienne 23 3.1.2.2 La chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC) 24 3.1.3 Le gel SDS-PAGE 26 3.1.4 Détermination de la concentration en enzyme. 27 3.1.4.1 Le Nanodrop 27 3.1.5 Détermination d’activité enzymatique 28 3.1.5.1 Méthode de dosage 28 3.1.5.2 Détermination de paramètres cinétiques 29 3.1.5.3 Détermination de la température optimale 29 3.1.5.4 Détermination du pH optimum 29 3.1.5.5 Détermination du cofacteur métallique optimal 30 3.2 PROTOCOLES 30 4 RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 30 4.1 TEST DE PARAMÈTRES D’INDUCTIONS DE LA PSP DE M.MARINUM 30 4.2 SUIVI DE LA PRODUCTION DE LA PSP DE M.MARINUM 31 4.3 DÉTERMINATION DES PARAMÈTRES CINÉTIQUES DE LA PSP DE M.MARINUM 34 4.4 RÉSULTATS DE LA DÉTERMINATION DE LA TEMPÉRATURE OPTIMALE DE LA PSP DE M.MARINUM 35 4.5 DÉTERMINATION DU PH OPTIMUM DE LA PSP DE M.MARINUM 36 4.6 DÉTERMINATION DU COFACTEUR OPTIMUM DE LA PSP DE M.MARINUM 37 5 CONCLUSION ET PERSPECTIVES 38 6 BIBLIOGRAPHIE 40 7 ANNEXES 43 7.1 PROTOCOLES 43 7.1.1 Préparation de milieux nutritifs bactériens 43 7.1.1.1 Milieu Lysogeny Broth base liquide (LBLiq) 43 7.1.1.2 Milieu LB agar (LBagar) 43 7.1.2 Transformation bactérienne 43 7.1.3 Préculture 43 7.1.4 Culture 44 7.1.5 Induction 44 7.1.6 Optimisation d’induction 44 7.1.7 Lyse bactérienne 44 7.1.8 Purification IMAC 45 7.1.9 Dialyse 45 7.1.10 Préparation d’un gel SDS-PAGE 12% 45 7.1.11 Migration d’échantillons dans le gel SDS-PAGE 12% 46 7.1.11.1 Préparation du tampon échantillon 46 7.1.11.2 Préparation des échantillons 46 7.1.11.3 Migration des échantillons 47 7.1.12 Coloration et décoloration du gel SDS-PAGE 47 7.1.13 Test d’activité 47 7.1.13.1 Préparation du réactif phosphate 47 7.1.13.2 Réalisation de la droite d’étalonnage 48 7.1.13.3 Préparation des échantillons et du blanc réactif 48 7.1.13.4 Détermination de l’activité de l’enzyme 48 7.1.14 Détermination du pH optimum 49 7.1.15 Détermination de la température optimale 49 7.1.16 Détermination du cofacteur optimum 49 7.1.17 Test cinétique 49 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79993 Étude de la phosphosérine phosphatase de Mycobacterium marinum : Production, purification et détermination de paramètres enzymatiques. [TFE / Mémoire] / Adrien Lesne, Auteur ; Jenny Pouyez, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : 1 INTRODUCTION 7 1.1 LA SÉRINE 7 1.1.1 Fonctions de la sérine 7 1.1.2 Voie phosphorylée de la sérine 7 1.2 LES PHOSPHOSÉRINE PHOSPHATASES 8 1.2.1 Structure 9 1.2.1.1 Domaine PSP 9 1.2.1.2 Domaine ACT 10 1.2.2 Fonctions 10 1.2.2.1 Mécanisme catalytique du domaine des PSP 10 1.2.3 Études de PSP de différents organismes 11 1.2.3.1 Alignement de séquences des PSP 12 1.3 CARACTÉRISATION DES ENZYMES 13 1.3.1 La cinétique enzymatique 13 1.3.2 Paramètres étudiés influençant l’activité des enzymes 15 1.3.2.1 La température 15 1.3.2.2 Le pH 16 1.3.2.3 Cofacteurs métalliques 17 2 OBJECTIFS ET STRATÉGIES 18 2.1 OBJECTIFS ET STRATÉGIES 18 3 MATÉRIELS ET MÉTHODES 19 3.1 PRINCIPES 19 3.1.1 Expressions des PSP 19 3.1.1.1 Les bactéries Escherichia coli Bl21 DE3 19 3.1.1.2 Le plasmide pAVA0421 19 3.1.1.3 La transformation bactérienne 20 3.1.1.4 Culture 21 3.1.1.5 L’induction 22 3.1.2 Purification de la PSP de M.marinum 23 3.1.2.1 La Lyse bactérienne 23 3.1.2.2 La chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC) 24 3.1.3 Le gel SDS-PAGE 26 3.1.4 Détermination de la concentration en enzyme. 27 3.1.4.1 Le Nanodrop 27 3.1.5 Détermination d’activité enzymatique 28 3.1.5.1 Méthode de dosage 28 3.1.5.2 Détermination de paramètres cinétiques 29 3.1.5.3 Détermination de la température optimale 29 3.1.5.4 Détermination du pH optimum 29 3.1.5.5 Détermination du cofacteur métallique optimal 30 3.2 PROTOCOLES 30 4 RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 30 4.1 TEST DE PARAMÈTRES D’INDUCTIONS DE LA PSP DE M.MARINUM 30 4.2 SUIVI DE LA PRODUCTION DE LA PSP DE M.MARINUM 31 4.3 DÉTERMINATION DES PARAMÈTRES CINÉTIQUES DE LA PSP DE M.MARINUM 34 4.4 RÉSULTATS DE LA DÉTERMINATION DE LA TEMPÉRATURE OPTIMALE DE LA PSP DE M.MARINUM 35 4.5 DÉTERMINATION DU PH OPTIMUM DE LA PSP DE M.MARINUM 36 4.6 DÉTERMINATION DU COFACTEUR OPTIMUM DE LA PSP DE M.MARINUM 37 5 CONCLUSION ET PERSPECTIVES 38 6 BIBLIOGRAPHIE 40 7 ANNEXES 43 7.1 PROTOCOLES 43 7.1.1 Préparation de milieux nutritifs bactériens 43 7.1.1.1 Milieu Lysogeny Broth base liquide (LBLiq) 43 7.1.1.2 Milieu LB agar (LBagar) 43 7.1.2 Transformation bactérienne 43 7.1.3 Préculture 43 7.1.4 Culture 44 7.1.5 Induction 44 7.1.6 Optimisation d’induction 44 7.1.7 Lyse bactérienne 44 7.1.8 Purification IMAC 45 7.1.9 Dialyse 45 7.1.10 Préparation d’un gel SDS-PAGE 12% 45 7.1.11 Migration d’échantillons dans le gel SDS-PAGE 12% 46 7.1.11.1 Préparation du tampon échantillon 46 7.1.11.2 Préparation des échantillons 46 7.1.11.3 Migration des échantillons 47 7.1.12 Coloration et décoloration du gel SDS-PAGE 47 7.1.13 Test d’activité 47 7.1.13.1 Préparation du réactif phosphate 47 7.1.13.2 Réalisation de la droite d’étalonnage 48 7.1.13.3 Préparation des échantillons et du blanc réactif 48 7.1.13.4 Détermination de l’activité de l’enzyme 48 7.1.14 Détermination du pH optimum 49 7.1.15 Détermination de la température optimale 49 7.1.16 Détermination du cofacteur optimum 49 7.1.17 Test cinétique 49 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79993

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