Identification d’ARN circulaires encodés par le virus de la maladie de Marek / Céline Istasse

Public ISBD Titre : Identification d’ARN circulaires encodés par le virus de la maladie de Marek Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Céline Istasse, Auteur ; Gaël Gilbert, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  NARILI  NAmur Research Institute for LIfe Sciences Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Au début des années 90, des chercheurs ont mis en évidence une nouvelle forme d’ARN. L’ARN en question était caractérisé par une suite d’exons dont l’ordre ne correspondait pas à celui des exons de l’ADN à partir duquel la transcription a été réalisée. L’hypothèse qui en est ressortie est qu’il s’agissait de produits aberrants issus du mécanisme d’épissage (Nigro et al. 1991). Plus tard, il s’avèrera que ces aberrations de l’épissage sont en réalité des ARN circulaires. L’idée qu’il s’agisse d’une forme d’ARN à part entière s’est renforcée par la mise en évidence d’une expression qui leur est propre, différente de celle de leur homologue linéaire. Depuis, de nombreuses études se sont articulées autour du sujet afin de comprendre leur implication au niveau de la régulation transcriptionnelle, post-transcriptionnelle et traductionnelle. Il a été montré qu’un désordre de ces derniers étaient liés à de nombreuses pathologies connues. C’est pourquoi, un grand nombre de projets concernant les ARN circulaires des cellules eucaryotes ont récemment vu le jour en vue de trouver de potentiels biomarqueurs propres à certaines situations pathologiques. Depuis peu, il semblerait que ces transcrits circulaires soient aussi présent chez les virus. Ainsi, les virus semblent capables d’interférer avec les ARNcirc de la cellule hôte et également d’en produire. A ce jour, cinq virus font l’objet de multiples études concernant les ARN circulaires. Ce travail tente de mettre en évidence la production de ces derniers par l’herpès virus de la maladie de Marek. Pour ce faire, un protocole est mis au point dans le but de concentrer les ARN circulaires au sein de l’échantillon, de les amplifier et finalement de les caractériser. Au terme de ce travail, plusieurs transcrits circulaires ont été mis en évidence. Les ARN circulaires semblent concentrés autour de l’origine de réplication lytique. Ce qui suggère qu’ils pourraient jouer un rôle à ce niveau. De plus, un transcrit apparaît plus exprimé que les autres et pourrait être impliqué de manière non-négligeable dans l’oncogenèse du virus de la maladie de Marek. La base de ce projet étant établie, de nombreuses perspectives de recherche peuvent être envisagées. Note de contenu : Remerciements : ............................................................................................................................................. 3 Table des matières : ........................................................................................................................................ 4 Description du lieu de stage : .......................................................................................................................... 6 Introduction :................................................................................................................................................... 7 Première partie : concepts théoriques ............................................................................................................ 9 1 Les ARN circulaires : ............................................................................................................................ 9 1.1 Qu’est-ce qu’un ARN circulaire ? ................................................................................................ 9 1.2 Les ARNcirc dans les domaines du vivant : ............................................................................... 10 1.2.1 Cellules eucaryotes animales : ............................................................................................. 12 1.3 Biogenèse des ARN circulaires :................................................................................................ 12 1.3.1 Transcription : ...................................................................................................................... 13 1.3.2 L’épissage (ou splicing) : ....................................................................................................... 13 1.4 Régulation de la synthèse des ARN circulaires : ....................................................................... 23 1.4.1 Séquences répétées inversées (inverted repeats) (IRs) : ..................................................... 23 1.4.2 Séquences cis et facteurs trans : .......................................................................................... 24 1.4.3 Facteurs splicéosomaux centraux : ...................................................................................... 24 1.5 Fonctions des ARN circulaires :................................................................................................. 25 1.5.1 Rôle des ARNcirc dans la régulation transcriptionnelle : ..................................................... 26 1.5.2 Eponge à microARN : ............................................................................................................ 26 1.5.3 Interaction des ARN circulaires avec les protéines : ............................................................ 26 1.5.4 Les ARN circulaires traduits : ................................................................................................ 27 2 ARN circulaires et virus : .................................................................................................................... 27 3 Le virus de la maladie de Marek : ...................................................................................................... 29 3.1 Cycle infectieux du virus de la maladie de Marek : .................................................................. 29 3.2 Carte génétique de GaHV-2 : .................................................................................................... 30 Deuxième partie : Objectifs et stratégie ....................................................................................................... 33 Troisième partie : matériels et méthodes ..................................................................................................... 35 1 Lignées cellulaires et souches virales : .............................................................................................. 35 2 Extraction d’ARN ............................................................................................................................... 35 3 Traitement DNase ............................................................................................................................. 36 4 Purification par phénol-chloroforme-alcool isoamylique : ............................................................... 36 5 Traitement RNase R ........................................................................................................................... 37 6 Rétrotranscription des ARNcirc : ....................................................................................................... 37 7 PCR avec amorces divergentes : ........................................................................................................ 38 Table des matières : 8 Electrophorèse sur gel d’agarose : .................................................................................................... 39 9 Purification ........................................................................................................................................ 39 10 Ligation .......................................................................................................................................... 40 11 Transformation de bactéries et mise en culture ........................................................................... 41 12 Criblage des colonies contenant le plasmide recombinant : ........................................................ 42 13 Séquençage et analyse des transcrits. .......................................................................................... 42 Quatrième partie : résultats et discussion .................................................................................................... 44 1 Analyse de la carte transcriptionnelle de la région IRL/TRL et choix des amorces aptes à identifier des ARNcirc :.............................................................................................................................................. 44 2 Amplification des potentiels ARN circulaires produits dans la région IRL/TRL de GaHV- 2 : ............. 46 3 Description des séquences des transcrits circulaires générés par la région IRL/TRL de GaHV-2 : ..... 49 4 Discussion générale : ......................................................................................................................... 54 Cinquième partie : conclusion et perspectives ............................................................................................. 57 Liste des figures : ........................................................................................................................................... 59 Liste des abréviations : .................................................................................................................................. 60 Bibliographie ................................................................................................................................................. 62 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79991 Identification d’ARN circulaires encodés par le virus de la maladie de Marek [TFE / Mémoire] / Céline Istasse, Auteur ; Gaël Gilbert, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  NARILI  NAmur Research Institute for LIfe Sciences Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Au début des années 90, des chercheurs ont mis en évidence une nouvelle forme d’ARN. L’ARN en question était caractérisé par une suite d’exons dont l’ordre ne correspondait pas à celui des exons de l’ADN à partir duquel la transcription a été réalisée. L’hypothèse qui en est ressortie est qu’il s’agissait de produits aberrants issus du mécanisme d’épissage (Nigro et al. 1991). Plus tard, il s’avèrera que ces aberrations de l’épissage sont en réalité des ARN circulaires. L’idée qu’il s’agisse d’une forme d’ARN à part entière s’est renforcée par la mise en évidence d’une expression qui leur est propre, différente de celle de leur homologue linéaire. Depuis, de nombreuses études se sont articulées autour du sujet afin de comprendre leur implication au niveau de la régulation transcriptionnelle, post-transcriptionnelle et traductionnelle. Il a été montré qu’un désordre de ces derniers étaient liés à de nombreuses pathologies connues. C’est pourquoi, un grand nombre de projets concernant les ARN circulaires des cellules eucaryotes ont récemment vu le jour en vue de trouver de potentiels biomarqueurs propres à certaines situations pathologiques. Depuis peu, il semblerait que ces transcrits circulaires soient aussi présent chez les virus. Ainsi, les virus semblent capables d’interférer avec les ARNcirc de la cellule hôte et également d’en produire. A ce jour, cinq virus font l’objet de multiples études concernant les ARN circulaires. Ce travail tente de mettre en évidence la production de ces derniers par l’herpès virus de la maladie de Marek. Pour ce faire, un protocole est mis au point dans le but de concentrer les ARN circulaires au sein de l’échantillon, de les amplifier et finalement de les caractériser. Au terme de ce travail, plusieurs transcrits circulaires ont été mis en évidence. Les ARN circulaires semblent concentrés autour de l’origine de réplication lytique. Ce qui suggère qu’ils pourraient jouer un rôle à ce niveau. De plus, un transcrit apparaît plus exprimé que les autres et pourrait être impliqué de manière non-négligeable dans l’oncogenèse du virus de la maladie de Marek. La base de ce projet étant établie, de nombreuses perspectives de recherche peuvent être envisagées. Note de contenu : Remerciements : ............................................................................................................................................. 3 Table des matières : ........................................................................................................................................ 4 Description du lieu de stage : .......................................................................................................................... 6 Introduction :................................................................................................................................................... 7 Première partie : concepts théoriques ............................................................................................................ 9 1 Les ARN circulaires : ............................................................................................................................ 9 1.1 Qu’est-ce qu’un ARN circulaire ? ................................................................................................ 9 1.2 Les ARNcirc dans les domaines du vivant : ............................................................................... 10 1.2.1 Cellules eucaryotes animales : ............................................................................................. 12 1.3 Biogenèse des ARN circulaires :................................................................................................ 12 1.3.1 Transcription : ...................................................................................................................... 13 1.3.2 L’épissage (ou splicing) : ....................................................................................................... 13 1.4 Régulation de la synthèse des ARN circulaires : ....................................................................... 23 1.4.1 Séquences répétées inversées (inverted repeats) (IRs) : ..................................................... 23 1.4.2 Séquences cis et facteurs trans : .......................................................................................... 24 1.4.3 Facteurs splicéosomaux centraux : ...................................................................................... 24 1.5 Fonctions des ARN circulaires :................................................................................................. 25 1.5.1 Rôle des ARNcirc dans la régulation transcriptionnelle : ..................................................... 26 1.5.2 Eponge à microARN : ............................................................................................................ 26 1.5.3 Interaction des ARN circulaires avec les protéines : ............................................................ 26 1.5.4 Les ARN circulaires traduits : ................................................................................................ 27 2 ARN circulaires et virus : .................................................................................................................... 27 3 Le virus de la maladie de Marek : ...................................................................................................... 29 3.1 Cycle infectieux du virus de la maladie de Marek : .................................................................. 29 3.2 Carte génétique de GaHV-2 : .................................................................................................... 30 Deuxième partie : Objectifs et stratégie ....................................................................................................... 33 Troisième partie : matériels et méthodes ..................................................................................................... 35 1 Lignées cellulaires et souches virales : .............................................................................................. 35 2 Extraction d’ARN ............................................................................................................................... 35 3 Traitement DNase ............................................................................................................................. 36 4 Purification par phénol-chloroforme-alcool isoamylique : ............................................................... 36 5 Traitement RNase R ........................................................................................................................... 37 6 Rétrotranscription des ARNcirc : ....................................................................................................... 37 7 PCR avec amorces divergentes : ........................................................................................................ 38 Table des matières : 8 Electrophorèse sur gel d’agarose : .................................................................................................... 39 9 Purification ........................................................................................................................................ 39 10 Ligation .......................................................................................................................................... 40 11 Transformation de bactéries et mise en culture ........................................................................... 41 12 Criblage des colonies contenant le plasmide recombinant : ........................................................ 42 13 Séquençage et analyse des transcrits. .......................................................................................... 42 Quatrième partie : résultats et discussion .................................................................................................... 44 1 Analyse de la carte transcriptionnelle de la région IRL/TRL et choix des amorces aptes à identifier des ARNcirc :.............................................................................................................................................. 44 2 Amplification des potentiels ARN circulaires produits dans la région IRL/TRL de GaHV- 2 : ............. 46 3 Description des séquences des transcrits circulaires générés par la région IRL/TRL de GaHV-2 : ..... 49 4 Discussion générale : ......................................................................................................................... 54 Cinquième partie : conclusion et perspectives ............................................................................................. 57 Liste des figures : ........................................................................................................................................... 59 Liste des abréviations : .................................................................................................................................. 60 Bibliographie ................................................................................................................................................. 62 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79991

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