Recherche de la fonction de la maspardine, une protéine déficiente dans la paraplégie spastique 21 / Anaïs Dupuis

Public ISBD Titre : Recherche de la fonction de la maspardine, une protéine déficiente dans la paraplégie spastique 21 Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Anaïs Dupuis, Auteur ; Louise-Marie Vincent, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La paraplégie spastique héréditaire de type 21 est une maladie autosomale récessive causée par des mutations dans le gène SPG21. Celui-ci code pour la maspardine, une protéine de fonction inconnue associée au feuillet cytosolique de la membrane lysosomale. Sur base d’une recherche bibliographique, il a été postulé que la maspardine pourrait jouer un rôle dans le transport de matériel dans la cellule. Ce transport aurait lieu dans de petites vésicules qui voyageraient vers ou à partir du système endolysosomal. Une analyse préliminaire a en effet suggéré que la maspardine pourrait interagir avec plusieurs protéines de la famille COPI qui sont impliquées dans des mécanismes de transport vésiculaire. Dans le cadre de ce travail, nous avons validé l’une de ces interactions protéiques. Grâce à la technique d’immunoprécipitation, nous avons mis en évidence une interaction entre la maspardine et la protéine COP E dans un modèle cellulaire humain. Dans la seconde partie du travail, nous avons participé à la caractérisation du phénotype de cellules HeLa déficientes pour la maspardine. Par des techniques de qRT-PCR et de microscopie à fluorescence, nous avons mis en avant que ces cellules présentent un taux d’ARNm du facteur de transcription EB (TFEB) diminué et que celui-ci est plus fréquemment détecté dans le noyau, alors qu’une localisation cytosolique est prédominante dans les cellules contrôles. De plus, nous avons observé que la localisation nucléaire de TFEB se traduit par une augmentation de la transcription et ensuite traduction de CTSD, un gène qui fait partie du réseau de gènes régulés par TFEB. Sachant que l’activation de TFEB dépend d’une plateforme de signalisation lysosomale qui est sensible à des changements au niveau du contenu de ces organites, ces résultats sont compatibles avec l’hypothèse selon laquelle la maspardine pourrait intervenir dans le transport de matériel vers ou à partir des lysosomes. Nous n’excluons cependant pas une action plus directe de la maspardine sur la plateforme de signalisation elle-même. Des analyses supplémentaires seront nécessaires pour identifier le type de transport auquel la maspardine participe (organite de départ et d’arrivée, type de cargos transportés, autres partenaires d’interaction, …), et pour identifier précisément comment la maspardine régule l’activation de TFEB. Note de contenu : Remerciements Présentation du lieu de stage Introduction générale ....................................................................................................... 7 Partie théorique ................................................................................................................ 9 1. Paraplégie spastique ................................................................................................. 9 1.1. Généralités ...................................................................................................................................... 9 1.2. Paraplégie spastique de type 21 (SPG21) et maspardine ............................................................... 9 2. Le système endolysosomal ....................................................................................... 11 2.1. Généralités .................................................................................................................................... 11 2.2. Endosome précoce ........................................................................................................................ 11 2.3. Endosome tardif ............................................................................................................................ 12 2.4. Lysosome ....................................................................................................................................... 12 3. Envoi du matériel à dégrader vers les lysosomes ...................................................... 14 3.1. Endocytose .................................................................................................................................... 14 3.2. Autophagie .................................................................................................................................... 15 4. Mise en contexte de la partie pratique ..................................................................... 17 Partie Pratique ............................................................................................................... 21 1. Matériels et méthodes ............................................................................................. 21 1.1. Traitement des cellules ................................................................................................................. 21 1.1.1. Mise en culture ......................................................................................................................... 21 1.1.2. Transfection des cellules .......................................................................................................... 21 1.2. Préparation de lysats cellulaires.................................................................................................... 22 1.3. Co-immunoprécipitation ............................................................................................................... 22 1.4. Western blotting ........................................................................................................................... 23 1.5. Fractionnement subcellulaire........................................................................................................ 25 1.5.1. Préparation d’une fraction enrichie en noyaux ........................................................................ 25 1.5.2. Dosage des protéines par la méthode de Bradford ................................................................. 26 1.5.3. Dosage de la DPPIII ................................................................................................................... 26 1.6. Analyse de la viabilité cellulaire .................................................................................................... 27 1.7. Analyse de l’expression d’un ARNm par qRT-PCR ......................................................................... 27 1.8. Analyse par microscopie à fluorescence ....................................................................................... 28 2. Résultats ................................................................................................................. 31 2.1. Etude des partenaires d’interaction de la maspardine ................................................................. 31 2.1.1. Tests de surexpression des protéines maspardine, COP G et COP E dans les cellules HeLa .... 34 2.1.2. Etude d’une interaction potentielle entre la maspardine et les protéines COP G et COP E par la technique de co-immunoprécipitation (co-IP) .................................................................................... 37 2.1.3. Etude du niveau d’expression et observation de COPE par immunofluorescence dans des cellules HeLa déficientes pour la maspardine ........................................................................................ 39 2.2. Etude de la distribution intracellulaire de TFEB (noyau versus cytosol) dans les cellules déficientes en maspardine .......................................................................................................................... 43 2.2.1. Analyse de la localisation subcellulaire de TFEB en conditions de culture riches en nutriments ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..44 2.2.2. Analyse de la distribution subcellulaire de GFP-TFEB dans les cellules contrôles et déficientes en maspardine, après induction d’une surcharge lysosomale ............................................................... 51 Conclusions, discussion et perspectives ............................................................................ 59 Liste des abréviations...................................................................................................... 63 Bibliographie .................................................................................................................. 64 5 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79988 Recherche de la fonction de la maspardine, une protéine déficiente dans la paraplégie spastique 21 [TFE / Mémoire] / Anaïs Dupuis, Auteur ; Louise-Marie Vincent, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La paraplégie spastique héréditaire de type 21 est une maladie autosomale récessive causée par des mutations dans le gène SPG21. Celui-ci code pour la maspardine, une protéine de fonction inconnue associée au feuillet cytosolique de la membrane lysosomale. Sur base d’une recherche bibliographique, il a été postulé que la maspardine pourrait jouer un rôle dans le transport de matériel dans la cellule. Ce transport aurait lieu dans de petites vésicules qui voyageraient vers ou à partir du système endolysosomal. Une analyse préliminaire a en effet suggéré que la maspardine pourrait interagir avec plusieurs protéines de la famille COPI qui sont impliquées dans des mécanismes de transport vésiculaire. Dans le cadre de ce travail, nous avons validé l’une de ces interactions protéiques. Grâce à la technique d’immunoprécipitation, nous avons mis en évidence une interaction entre la maspardine et la protéine COP E dans un modèle cellulaire humain. Dans la seconde partie du travail, nous avons participé à la caractérisation du phénotype de cellules HeLa déficientes pour la maspardine. Par des techniques de qRT-PCR et de microscopie à fluorescence, nous avons mis en avant que ces cellules présentent un taux d’ARNm du facteur de transcription EB (TFEB) diminué et que celui-ci est plus fréquemment détecté dans le noyau, alors qu’une localisation cytosolique est prédominante dans les cellules contrôles. De plus, nous avons observé que la localisation nucléaire de TFEB se traduit par une augmentation de la transcription et ensuite traduction de CTSD, un gène qui fait partie du réseau de gènes régulés par TFEB. Sachant que l’activation de TFEB dépend d’une plateforme de signalisation lysosomale qui est sensible à des changements au niveau du contenu de ces organites, ces résultats sont compatibles avec l’hypothèse selon laquelle la maspardine pourrait intervenir dans le transport de matériel vers ou à partir des lysosomes. Nous n’excluons cependant pas une action plus directe de la maspardine sur la plateforme de signalisation elle-même. Des analyses supplémentaires seront nécessaires pour identifier le type de transport auquel la maspardine participe (organite de départ et d’arrivée, type de cargos transportés, autres partenaires d’interaction, …), et pour identifier précisément comment la maspardine régule l’activation de TFEB. Note de contenu : Remerciements Présentation du lieu de stage Introduction générale ....................................................................................................... 7 Partie théorique ................................................................................................................ 9 1. Paraplégie spastique ................................................................................................. 9 1.1. Généralités ...................................................................................................................................... 9 1.2. Paraplégie spastique de type 21 (SPG21) et maspardine ............................................................... 9 2. Le système endolysosomal ....................................................................................... 11 2.1. Généralités .................................................................................................................................... 11 2.2. Endosome précoce ........................................................................................................................ 11 2.3. Endosome tardif ............................................................................................................................ 12 2.4. Lysosome ....................................................................................................................................... 12 3. Envoi du matériel à dégrader vers les lysosomes ...................................................... 14 3.1. Endocytose .................................................................................................................................... 14 3.2. Autophagie .................................................................................................................................... 15 4. Mise en contexte de la partie pratique ..................................................................... 17 Partie Pratique ............................................................................................................... 21 1. Matériels et méthodes ............................................................................................. 21 1.1. Traitement des cellules ................................................................................................................. 21 1.1.1. Mise en culture ......................................................................................................................... 21 1.1.2. Transfection des cellules .......................................................................................................... 21 1.2. Préparation de lysats cellulaires.................................................................................................... 22 1.3. Co-immunoprécipitation ............................................................................................................... 22 1.4. Western blotting ........................................................................................................................... 23 1.5. Fractionnement subcellulaire........................................................................................................ 25 1.5.1. Préparation d’une fraction enrichie en noyaux ........................................................................ 25 1.5.2. Dosage des protéines par la méthode de Bradford ................................................................. 26 1.5.3. Dosage de la DPPIII ................................................................................................................... 26 1.6. Analyse de la viabilité cellulaire .................................................................................................... 27 1.7. Analyse de l’expression d’un ARNm par qRT-PCR ......................................................................... 27 1.8. Analyse par microscopie à fluorescence ....................................................................................... 28 2. Résultats ................................................................................................................. 31 2.1. Etude des partenaires d’interaction de la maspardine ................................................................. 31 2.1.1. Tests de surexpression des protéines maspardine, COP G et COP E dans les cellules HeLa .... 34 2.1.2. Etude d’une interaction potentielle entre la maspardine et les protéines COP G et COP E par la technique de co-immunoprécipitation (co-IP) .................................................................................... 37 2.1.3. Etude du niveau d’expression et observation de COPE par immunofluorescence dans des cellules HeLa déficientes pour la maspardine ........................................................................................ 39 2.2. Etude de la distribution intracellulaire de TFEB (noyau versus cytosol) dans les cellules déficientes en maspardine .......................................................................................................................... 43 2.2.1. Analyse de la localisation subcellulaire de TFEB en conditions de culture riches en nutriments ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..44 2.2.2. Analyse de la distribution subcellulaire de GFP-TFEB dans les cellules contrôles et déficientes en maspardine, après induction d’une surcharge lysosomale ............................................................... 51 Conclusions, discussion et perspectives ............................................................................ 59 Liste des abréviations...................................................................................................... 63 Bibliographie .................................................................................................................. 64 5 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79988

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