Screening et caractérisation de virus de Fusarium spp. / Bryan Stiens

Public ISBD Titre : Screening et caractérisation de virus de Fusarium spp. Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Bryan Stiens, Auteur ; Jonathan Scauflaire, Directeur de publication, rédacteur en chef Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Agronomie  AIBT  UCLouvain  Faculté des bioingénieurs Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : De nombreuses espèces du genre Fusarium spp. sont pathogènes de plantes. Celles-ci peuvent mener à des ravages importants dans les cultures et par conséquent à de lourdes pertes économiques. Ces champignons sont omniprésents dans l’environnement par l’intermédiaire de spores : les micro- et macroconidies et les chlamydospores. Ces spores vont être propagées par divers moyen, vont pouvoir germer et ensuite inoculer d’autres plantes. Il a été découvert dans les souches de Fusarium présentes dans la collection du laboratoire FYMY la présence de mycovirus. Ces derniers parasitent les champignons afin de pouvoir répliquer leur matériel génétique. Ces mycovirus en question sont, en fait, des virus à ARN double brin. Ils représentent un potentiel de biocontrôle pour les champignons phytopathogènes qu’ils infectent. En effet, certains possèdent une capacité d’hypovirulence, c’est-à-dire de virulence réduite de leur hôte, qui peut être utilisée pour diminuer l’impact des champignons. L’objectif de ce stage est multiple. D’abord, il a été question d’arriver à séquencer les extrémités d’un virus de F. culmorum dont une partie du génome avait déjà été séquencée précédemment. En parallèle, il a fallu caractériser biologiquement un virus de F. redolens, c’est-à-dire, savoir comment celui-ci se comporte une fois inséré dans son hôte fongique. Et enfin, nous avons cherché la présence de mycovirus dans d’autres souches de la collection du laboratoire FYMY. En ce qui concerne les extrémités du virus de F. culmorum, il a pu être montré après une suite d’essais et de manipulations (RT-PCR, PCR, ligation à la T4 RNA Ligase, clonage, restriction et séquençage) que l’extrémité 5’ de son génome était très proche d’autres virus du même genre. Ensuite, il a été constaté qu’il y avait uniquement une différence de phénotype entre les souches de F. redolens infectées par le virus et celles non infectées. Aucune différence en terme de vitesse de croissance n’a pu être mise en évidence. Finalement, aucun virus de champignons n’a été trouvé dans les autres souches de Fusarium de la collection du laboratoire FYMY ayant été testées. Note de contenu : Table des matières Table des tableaux ........................................................... 6 Table des Figures ............................................................. 7 Présentation du laboratoire ............................................ 9 tIntroduction générale ................................................... 10 1) Le genre Fusarium .............................................................................................. 12 A. Introduction .................................................................................................... 12 B. Classification ................................................................................................... 13 a) Cycle de vie ................................................................................................ 14 b) Reproduction sexuée et asexuée ................................................................. 15 C. Symptômes ..................................................................................................... 16 D. Point de vue économique ............................................................................... 17 E. Moyens de lutte ............................................................................................. 17 a) Lutte chimique ............................................................................................ 17 b) Lutte biologique ......................................................................................... 17 2) Virus en général .................................................................................................. 18 a) Classification en fonction du génome ......................................................... 18 b) Capside ....................................................................................................... 19 c) Cycle viral .................................................................................................. 19 3) Virus de champignon .......................................................................................... 20 a) Familles et genres ....................................................................................... 20 a) Impact sur les champignons ....................................................................... 21 b) Transmission .............................................................................................. 22 c) Exemple d’utilisation : Cryphonectria parasitica ...................................... 22 Objectif ............................................................................ 24 Matériel et méthodes ...................................................... 25 1) Matériel .............................................................................................................. 25 A. Analyse bio-informatique ............................................................................... 25 B. Milieux utilisés ................................................................................................ 25 2) Matériel biologique ............................................................................................ 26 A. Fusarium spp. ................................................................................................. 26 B. E. coli .............................................................................................................. 27 3) Méthodes ........................................................................................................... 28 A. Extraction d’ADN par la méthode au CTAB .................................................... 28 B. Extraction d’ARN simple brin (ARNsb) par la méthode au Trizol .................... 28 C. Extraction de l’ARN double brin (ARNdb) ....................................................... 29 D. Electrophorèse sur gel d’agarose ................................................................... 29 E. Transformation bactérienne .......................................................................... 29 F. Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) ........................ 31 G. Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................. 31 H. Culture de Fusarium ....................................................................................... 31 I. Séquençage .................................................................................................... 32 J. Isolement de conidies .................................................................................... 32 5 K. Ligation T4 RNA ligase .................................................................................... 33 L. Purification à la RNase et à la DNase .............................................................. 33 M. Purification de l’ADN sur colonne .............................................................. 33 N. Purification sur gel .......................................................................................... 34 O. Extraction de plasmides ................................................................................. 34 Résultats et discussions .................................................. 35 1) Séquençage EF1⍺ de Fusarium redolens A63-1 .................................................. 35 2) Séquençage des extrémités du virus de Fusarium culmorum A104-1 ................ 37 3) Transmission verticale du virus de Fusarium redolens A63-1 ............................ 46 4) Comparaison de différentes souches de Fusarium culmorum A104-1 ............... 51 5) Screening autres souches de Fusarium .............................................................. 52 Conclusion générale ....................................................... 53 Bibliographie .................................................................. 54 ANNEXES ........................................................................ I Annexe A : Machines utilisées ....................................................................................... I Annexe B : Composition des milieu utilisés ................................................................ IV Annexe C : Protocoles utilisés ..................................................................................... V Annexe D : Amorces utilisées ...................................................................................... XI Annexe E : Résultats du séquençage des 8 produits de restrictions .......................... XII Annexe F : Croissance de différentes souches de Fusarium A63-1 ......................... XIV Annexe G : Cycle PCR Utilisés .................................................................................... XV Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79730 Screening et caractérisation de virus de Fusarium spp. [TFE / Mémoire] / Bryan Stiens, Auteur ; Jonathan Scauflaire, Directeur de publication, rédacteur en chef . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie, 2019. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Agronomie  AIBT  UCLouvain  Faculté des bioingénieurs Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : De nombreuses espèces du genre Fusarium spp. sont pathogènes de plantes. Celles-ci peuvent mener à des ravages importants dans les cultures et par conséquent à de lourdes pertes économiques. Ces champignons sont omniprésents dans l’environnement par l’intermédiaire de spores : les micro- et macroconidies et les chlamydospores. Ces spores vont être propagées par divers moyen, vont pouvoir germer et ensuite inoculer d’autres plantes. Il a été découvert dans les souches de Fusarium présentes dans la collection du laboratoire FYMY la présence de mycovirus. Ces derniers parasitent les champignons afin de pouvoir répliquer leur matériel génétique. Ces mycovirus en question sont, en fait, des virus à ARN double brin. Ils représentent un potentiel de biocontrôle pour les champignons phytopathogènes qu’ils infectent. En effet, certains possèdent une capacité d’hypovirulence, c’est-à-dire de virulence réduite de leur hôte, qui peut être utilisée pour diminuer l’impact des champignons. L’objectif de ce stage est multiple. D’abord, il a été question d’arriver à séquencer les extrémités d’un virus de F. culmorum dont une partie du génome avait déjà été séquencée précédemment. En parallèle, il a fallu caractériser biologiquement un virus de F. redolens, c’est-à-dire, savoir comment celui-ci se comporte une fois inséré dans son hôte fongique. Et enfin, nous avons cherché la présence de mycovirus dans d’autres souches de la collection du laboratoire FYMY. En ce qui concerne les extrémités du virus de F. culmorum, il a pu être montré après une suite d’essais et de manipulations (RT-PCR, PCR, ligation à la T4 RNA Ligase, clonage, restriction et séquençage) que l’extrémité 5’ de son génome était très proche d’autres virus du même genre. Ensuite, il a été constaté qu’il y avait uniquement une différence de phénotype entre les souches de F. redolens infectées par le virus et celles non infectées. Aucune différence en terme de vitesse de croissance n’a pu être mise en évidence. Finalement, aucun virus de champignons n’a été trouvé dans les autres souches de Fusarium de la collection du laboratoire FYMY ayant été testées. Note de contenu : Table des matières Table des tableaux ........................................................... 6 Table des Figures ............................................................. 7 Présentation du laboratoire ............................................ 9 tIntroduction générale ................................................... 10 1) Le genre Fusarium .............................................................................................. 12 A. Introduction .................................................................................................... 12 B. Classification ................................................................................................... 13 a) Cycle de vie ................................................................................................ 14 b) Reproduction sexuée et asexuée ................................................................. 15 C. Symptômes ..................................................................................................... 16 D. Point de vue économique ............................................................................... 17 E. Moyens de lutte ............................................................................................. 17 a) Lutte chimique ............................................................................................ 17 b) Lutte biologique ......................................................................................... 17 2) Virus en général .................................................................................................. 18 a) Classification en fonction du génome ......................................................... 18 b) Capside ....................................................................................................... 19 c) Cycle viral .................................................................................................. 19 3) Virus de champignon .......................................................................................... 20 a) Familles et genres ....................................................................................... 20 a) Impact sur les champignons ....................................................................... 21 b) Transmission .............................................................................................. 22 c) Exemple d’utilisation : Cryphonectria parasitica ...................................... 22 Objectif ............................................................................ 24 Matériel et méthodes ...................................................... 25 1) Matériel .............................................................................................................. 25 A. Analyse bio-informatique ............................................................................... 25 B. Milieux utilisés ................................................................................................ 25 2) Matériel biologique ............................................................................................ 26 A. Fusarium spp. ................................................................................................. 26 B. E. coli .............................................................................................................. 27 3) Méthodes ........................................................................................................... 28 A. Extraction d’ADN par la méthode au CTAB .................................................... 28 B. Extraction d’ARN simple brin (ARNsb) par la méthode au Trizol .................... 28 C. Extraction de l’ARN double brin (ARNdb) ....................................................... 29 D. Electrophorèse sur gel d’agarose ................................................................... 29 E. Transformation bactérienne .......................................................................... 29 F. Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) ........................ 31 G. Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................. 31 H. Culture de Fusarium ....................................................................................... 31 I. Séquençage .................................................................................................... 32 J. Isolement de conidies .................................................................................... 32 5 K. Ligation T4 RNA ligase .................................................................................... 33 L. Purification à la RNase et à la DNase .............................................................. 33 M. Purification de l’ADN sur colonne .............................................................. 33 N. Purification sur gel .......................................................................................... 34 O. Extraction de plasmides ................................................................................. 34 Résultats et discussions .................................................. 35 1) Séquençage EF1⍺ de Fusarium redolens A63-1 .................................................. 35 2) Séquençage des extrémités du virus de Fusarium culmorum A104-1 ................ 37 3) Transmission verticale du virus de Fusarium redolens A63-1 ............................ 46 4) Comparaison de différentes souches de Fusarium culmorum A104-1 ............... 51 5) Screening autres souches de Fusarium .............................................................. 52 Conclusion générale ....................................................... 53 Bibliographie .................................................................. 54 ANNEXES ........................................................................ I Annexe A : Machines utilisées ....................................................................................... I Annexe B : Composition des milieu utilisés ................................................................ IV Annexe C : Protocoles utilisés ..................................................................................... V Annexe D : Amorces utilisées ...................................................................................... XI Annexe E : Résultats du séquençage des 8 produits de restrictions .......................... XII Annexe F : Croissance de différentes souches de Fusarium A63-1 ......................... XIV Annexe G : Cycle PCR Utilisés .................................................................................... XV Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79730

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