Evaluation de méthodes pour la détection d’organismes génétiquement modifiés / Nawal Agag

Public ISBD Titre : Evaluation de méthodes pour la détection d’organismes génétiquement modifiés Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Nawal Agag, Auteur ; Jonathan Scauflaire, Directeur de publication, rédacteur en chef Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Agronomie  AIBT  CRA-W Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : Résumé Ce travail de fin d’études, réalisé au sein du Centre Wallon de Recherches Agronomiques (CRA-W) à Gembloux, s’inscrit dans le cadre de validations de méthodes pour la détection des organismes génétiquement modifiés par PCR (polymerase chain reaction, amplification en chaine par polymérisation) en temps réel. Les événements transgéniques ciblés sont d’origine végétale (Brassica Napus, Glycine max, Gossypium hirsutum, Zea mays) et animale (saumon Aquadvantage®, Aquabounty, Canada). Pour l’étude menée sur le saumon transgénique, la jonction, entre l’ADN du saumon et l’insert transgénique du côté promoteur, a été insérée dans le vecteur plasmidique pUC57. La problématique liée à la détection des événements transgéniques d’origine végétale est celle du screening via la détection de gènes codant pour des marqueurs de sélection, comme nptII (néomycine phosphotransphérase) bla (β-Lactamase) et gus (β-glucuronidase), qu’ils contiennent, mais qui peuvent également être utilisés pour la l’élaboration des enzymes (Taq polymérase) utilisées pour la détection par PCR. Dès lors, il est nécessaire de pouvoir travailler avec du matériel de détection exempt de toute trace d’ADN étranger. Quant au saumon transgénique Aquadvantage®, commercialisé hors Union européenne, une mise en place de méthodes de détection est nécessaire. Parmi les tests PCR évalués, deux ont été établis au CRA-W (aqua_event_FD2 et aqua_event_FD3) et un troisième a été mis au point au Japon (aqua_event_JAP). Les performances des différentes méthodes décrites ont été évaluées dans ce travail. Les résultats ont montré que les méthodes nptII et gus ont atteint les critères de performance requis. Cela n’a pas pu être évalué pour la méthode bla car des traces d’ADN résiduel étaient chaque fois présentes dans les réactifs utilisés. Concernant les tests PCR pour le saumon transgénique Aquadvantage® sur l’ADN plasmidique, les deux tests établis au CRA-W répondent aux exigences minimales demandées, bien que le test PCR utilisant la sonde Taqman aqua_event_FD2-P soit considéré comme plus performant que celui utilisant la sonde de type MGB aqua_event_FD3-P. En revanche, le test PCR aqua_event_JAP établi par les Japonais ne répond pas aux exigences requises au vu des premiers paramètres testés, mais l’évaluation complète n’a pas pu être finalisée. Une évaluation plus poussée sur de l’ADN génomique de saumon transgénique ainsi qu’une étude de transférabilité (BVL, Allemagne) sont à réaliser prochainement. Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage ........................................................................................... 1 Introduction générale ....................................................................................................... 3 Introduction à la notion d’OGM ....................................................................................... 4 1. Description des OGM............................................................................................ 4 2. Méthodes d’obtention d’OGM ............................................................................. 4 3. Bref historique et quelques repères… .................................................................. 6 4. Principales applications ........................................................................................ 7 5. Risques potentiels liés aux OGM .......................................................................... 8 6. Législation ............................................................................................................. 9 6.1. Mise sur la marché et réglementations générales ....................................... 9 6.2. Traçabilité et étiquetage ............................................................................ 10 État de l’art ..................................................................................................................... 11 1. Intérêt des méthodes de détection des OGM dans le domaine alimentaire .... 11 2. Procédure du dosage d’OGM ............................................................................. 12 3. Les différentes techniques de détection d’OGM ............................................... 12 3.1. Méthode de détection par analyse d’ADN ................................................. 12 3.2. Méthode de détection par analyse de protéines ....................................... 15 3.3. Méthode de détection par chromatographie ............................................ 18 3.4. Méthode de détection par spectroscopie par proche infrarouge ............. 18 Objectifs de l’étude ........................................................................................................ 19 Matériel et méthode ...................................................................................................... 19 1. Travail de recherche et bio-informatique .......................................................... 19 1.1. Recherche de séquences d’intérêt ............................................................. 19 1.2. Alignements ................................................................................................ 20 2. Préparation des échantillons .............................................................................. 20 2.1. Matériel végétal.......................................................................................... 20 2.2. Utilisation et préparation d’ADN plasmidique ........................................... 23 3. Quantification et évaluation de la qualité de l’ADN extrait ............................... 29 4. Analyse d’ADN par PCR en temps réel ............................................................... 29 4.1. Principe général .......................................................................................... 29 4.2. Réactifs et conditions de la PCR ................................................................. 31 5. Évaluation des critères de performance ............................................................ 34 5.1. Évaluation de la spécificité et de l’efficience ............................................. 35 5.2. Dilutions effectuée sur le matériel d’origine végétale ............................... 35 5.3. Dilutions effectuées sur le plasmide « jonction AquAdvantage » ............. 36 6. Évaluation de la sensibilité ................................................................................. 36 6.1. LOD ............................................................................................................. 36 6.2. Robustesse .................................................................................................. 37 Résultats et discussions .................................................................................................. 39 1. Extractions d’ADN ............................................................................................... 39 1.1. Résultats obtenus ....................................................................................... 40 1.2. Interprétation ............................................................................................. 41 2. Électrophorèse sur gel d’agarose ....................................................................... 41 2.1. Résultats obtenus ....................................................................................... 42 2.2. Interprétation ............................................................................................. 42 3. Évaluation des critères de performance ............................................................ 43 3.1. Spécificité .................................................................................................... 43 3.2. Efficience .................................................................................................... 45 4. Évaluation des mastermixes ............................................................................... 47 5. Critères de sensibilité ......................................................................................... 49 5.1. LOD ............................................................................................................. 49 5.2. Robustesse .................................................................................................. 50 6. Conclusion et perspectives ................................................................................. 52 Glossaire ......................................................................................................................... 55 Illustrations ..................................................................................................................... 57 Tableaux.......................................................................................................................... 58 Bibliographie ................................................................................................................... 59 1. Revues scientifiques ........................................................................................... 59 5. Sites web et fichiers pdf ..................................................................................... 73 6. Liens des réglementations et directives ............................................................. 75 Annexes ..............................................................................................................................I 1. Procédure interne CRA-W prise d’essai ................................................................ I 2. Méthode d’extraction d’ADN utilisant le CTAB .................................................... II 3. Méthode d’extraction d’ADN à l’aide du kit DNeay for plant ............................ VII 4. Clonage ................................................................................................................ IX 5. Electrophorèse.................................................................................................. XXII 5.1. Cuves d’électrophorèse ............................................................................ XXII 5.2. Générateur ............................................................................................ XXVIII 5.3. Transilluminateur et appareil Kodak ....................................................... XXXI 6. Protocoles en ligne ...................................................................................... XXXVIII 6.1. Utilisation du NanoDrop one ............................................................... XXXVIII 6.2. Extraction du plasmide par le kit NucleoSpin Plasmid EasyPure ........ XXXVIII 6.3. Digestion du plasmide ........................................................................... XXXIX 6.4. Extraction du plasmide par le kit GeneJet ............................................. XXXIX 7. Feuille de calcul du nombre de copies d’ADN plasmidique .......................... XXXIX Résumé ............................................................................................................................ XL Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79726 Evaluation de méthodes pour la détection d’organismes génétiquement modifiés [TFE / Mémoire] / Nawal Agag, Auteur ; Jonathan Scauflaire, Directeur de publication, rédacteur en chef . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie, 2019. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Agronomie  AIBT  CRA-W Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : Résumé Ce travail de fin d’études, réalisé au sein du Centre Wallon de Recherches Agronomiques (CRA-W) à Gembloux, s’inscrit dans le cadre de validations de méthodes pour la détection des organismes génétiquement modifiés par PCR (polymerase chain reaction, amplification en chaine par polymérisation) en temps réel. Les événements transgéniques ciblés sont d’origine végétale (Brassica Napus, Glycine max, Gossypium hirsutum, Zea mays) et animale (saumon Aquadvantage®, Aquabounty, Canada). Pour l’étude menée sur le saumon transgénique, la jonction, entre l’ADN du saumon et l’insert transgénique du côté promoteur, a été insérée dans le vecteur plasmidique pUC57. La problématique liée à la détection des événements transgéniques d’origine végétale est celle du screening via la détection de gènes codant pour des marqueurs de sélection, comme nptII (néomycine phosphotransphérase) bla (β-Lactamase) et gus (β-glucuronidase), qu’ils contiennent, mais qui peuvent également être utilisés pour la l’élaboration des enzymes (Taq polymérase) utilisées pour la détection par PCR. Dès lors, il est nécessaire de pouvoir travailler avec du matériel de détection exempt de toute trace d’ADN étranger. Quant au saumon transgénique Aquadvantage®, commercialisé hors Union européenne, une mise en place de méthodes de détection est nécessaire. Parmi les tests PCR évalués, deux ont été établis au CRA-W (aqua_event_FD2 et aqua_event_FD3) et un troisième a été mis au point au Japon (aqua_event_JAP). Les performances des différentes méthodes décrites ont été évaluées dans ce travail. Les résultats ont montré que les méthodes nptII et gus ont atteint les critères de performance requis. Cela n’a pas pu être évalué pour la méthode bla car des traces d’ADN résiduel étaient chaque fois présentes dans les réactifs utilisés. Concernant les tests PCR pour le saumon transgénique Aquadvantage® sur l’ADN plasmidique, les deux tests établis au CRA-W répondent aux exigences minimales demandées, bien que le test PCR utilisant la sonde Taqman aqua_event_FD2-P soit considéré comme plus performant que celui utilisant la sonde de type MGB aqua_event_FD3-P. En revanche, le test PCR aqua_event_JAP établi par les Japonais ne répond pas aux exigences requises au vu des premiers paramètres testés, mais l’évaluation complète n’a pas pu être finalisée. Une évaluation plus poussée sur de l’ADN génomique de saumon transgénique ainsi qu’une étude de transférabilité (BVL, Allemagne) sont à réaliser prochainement. Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage ........................................................................................... 1 Introduction générale ....................................................................................................... 3 Introduction à la notion d’OGM ....................................................................................... 4 1. Description des OGM............................................................................................ 4 2. Méthodes d’obtention d’OGM ............................................................................. 4 3. Bref historique et quelques repères… .................................................................. 6 4. Principales applications ........................................................................................ 7 5. Risques potentiels liés aux OGM .......................................................................... 8 6. Législation ............................................................................................................. 9 6.1. Mise sur la marché et réglementations générales ....................................... 9 6.2. Traçabilité et étiquetage ............................................................................ 10 État de l’art ..................................................................................................................... 11 1. Intérêt des méthodes de détection des OGM dans le domaine alimentaire .... 11 2. Procédure du dosage d’OGM ............................................................................. 12 3. Les différentes techniques de détection d’OGM ............................................... 12 3.1. Méthode de détection par analyse d’ADN ................................................. 12 3.2. Méthode de détection par analyse de protéines ....................................... 15 3.3. Méthode de détection par chromatographie ............................................ 18 3.4. Méthode de détection par spectroscopie par proche infrarouge ............. 18 Objectifs de l’étude ........................................................................................................ 19 Matériel et méthode ...................................................................................................... 19 1. Travail de recherche et bio-informatique .......................................................... 19 1.1. Recherche de séquences d’intérêt ............................................................. 19 1.2. Alignements ................................................................................................ 20 2. Préparation des échantillons .............................................................................. 20 2.1. Matériel végétal.......................................................................................... 20 2.2. Utilisation et préparation d’ADN plasmidique ........................................... 23 3. Quantification et évaluation de la qualité de l’ADN extrait ............................... 29 4. Analyse d’ADN par PCR en temps réel ............................................................... 29 4.1. Principe général .......................................................................................... 29 4.2. Réactifs et conditions de la PCR ................................................................. 31 5. Évaluation des critères de performance ............................................................ 34 5.1. Évaluation de la spécificité et de l’efficience ............................................. 35 5.2. Dilutions effectuée sur le matériel d’origine végétale ............................... 35 5.3. Dilutions effectuées sur le plasmide « jonction AquAdvantage » ............. 36 6. Évaluation de la sensibilité ................................................................................. 36 6.1. LOD ............................................................................................................. 36 6.2. Robustesse .................................................................................................. 37 Résultats et discussions .................................................................................................. 39 1. Extractions d’ADN ............................................................................................... 39 1.1. Résultats obtenus ....................................................................................... 40 1.2. Interprétation ............................................................................................. 41 2. Électrophorèse sur gel d’agarose ....................................................................... 41 2.1. Résultats obtenus ....................................................................................... 42 2.2. Interprétation ............................................................................................. 42 3. Évaluation des critères de performance ............................................................ 43 3.1. Spécificité .................................................................................................... 43 3.2. Efficience .................................................................................................... 45 4. Évaluation des mastermixes ............................................................................... 47 5. Critères de sensibilité ......................................................................................... 49 5.1. LOD ............................................................................................................. 49 5.2. Robustesse .................................................................................................. 50 6. Conclusion et perspectives ................................................................................. 52 Glossaire ......................................................................................................................... 55 Illustrations ..................................................................................................................... 57 Tableaux.......................................................................................................................... 58 Bibliographie ................................................................................................................... 59 1. Revues scientifiques ........................................................................................... 59 5. Sites web et fichiers pdf ..................................................................................... 73 6. Liens des réglementations et directives ............................................................. 75 Annexes ..............................................................................................................................I 1. Procédure interne CRA-W prise d’essai ................................................................ I 2. Méthode d’extraction d’ADN utilisant le CTAB .................................................... II 3. Méthode d’extraction d’ADN à l’aide du kit DNeay for plant ............................ VII 4. Clonage ................................................................................................................ IX 5. Electrophorèse.................................................................................................. XXII 5.1. Cuves d’électrophorèse ............................................................................ XXII 5.2. Générateur ............................................................................................ XXVIII 5.3. Transilluminateur et appareil Kodak ....................................................... XXXI 6. Protocoles en ligne ...................................................................................... XXXVIII 6.1. Utilisation du NanoDrop one ............................................................... XXXVIII 6.2. Extraction du plasmide par le kit NucleoSpin Plasmid EasyPure ........ XXXVIII 6.3. Digestion du plasmide ........................................................................... XXXIX 6.4. Extraction du plasmide par le kit GeneJet ............................................. XXXIX 7. Feuille de calcul du nombre de copies d’ADN plasmidique .......................... XXXIX Résumé ............................................................................................................................ XL Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79726

Exemplaires

Cote	Support	Localisation	Section	Disponibilité
aucun exemplaire

---

1 (1 - 1 / 1)