Etude des voies de sénescence induites lors de la sous-expression de UGT72A2 chez le peuplier / Rémy Demer

Public ISBD Titre : Etude des voies de sénescence induites lors de la sous-expression de UGT72A2 chez le peuplier Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Rémy Demer, Auteur ; Jenny Pouyez, Directeur de publication, rédacteur en chef Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Agronomie  AIBT Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Note de contenu : Table des matières REMERCIEMENTS ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 2 INTRODUCTION ........................................................................................................................................................ 9 1.INTRODUCTION THEORIQUE ............................................................................................................................... 11 1.1. LE PEUPLIER ........................................................................................................................................... 11 1.2. LES GLYCOSYLTRANSFERASES ..................................................................................................................... 11 1.3. LES UGT DE LA FAMILLE UGT72 ............................................................................................................... 12 1.4. IMPORTANCE DE LA SENESCENCE POUR LES ARBRES ........................................................................................ 13 1.5. SENESCENCE EN GENERAL ; PROCESSUS GENETIQUES, BIOCHIMIQUES ET DEVELOPPEMENTAUX ................................ 13 1.6. GENES ASSOCIES A LA SENESCENCE ............................................................................................................. 15 2.OBJECTIF DU TRAVAIL DE FIN D’ETUDE ............................................................................................................... 16 3.MATERIEL ET METHODES .................................................................................................................................... 17 3.1. MATERIEL BIOLOGIQUE ............................................................................................................................ 17 3.2. CULTURE IN VITRO ................................................................................................................................... 17 3.3. MATERIEL PRELEVE POUR LA CARACTERISATION DU PHENOTYPE DE SENESCENCE DANS LES LIGNEES RNAI500 ET WT . 18 3.4. EXTRACTION D’ARN DE FEUILLES DE PEUPLIER .............................................................................................. 19 3.5. LA TRANSCRIPTION INVERSE (RT) ............................................................................................................... 19 3.6. QPCR ................................................................................................................................................... 20 3.7. DOSAGE DE LA CHLOROPHYLLE ET DES CAROTENOIDES .................................................................................... 20 3.8. ACTIVITE PAL (PHENYLALANINE AMMONIA-LYASE) ........................................................................................ 20 3.9. ACTIVITE PEROXYDASE .............................................................................................................................. 21 3.10. PEROXYDATION DES LIPIDES....................................................................................................................... 22 3.11. ACTIVITE DU PROTEASOME 20S ................................................................................................................. 22 3.12. MESURE DU POUVOIR OXYDANT ................................................................................................................. 23 3.13. MESURE DE LA TENEUR EN POLYPHENOLS TOTAUX ......................................................................................... 23 3.14. TEST HISTOCHIMIQUE GUS ....................................................................................................................... 24 4.ANALYSE DES RESULTATS .................................................................................................................................... 25 4.1. CARACTERISATION DE L’EXPRESSION DU GENE UGT72A2 ............................................................................... 25 4.2. ANALYSE DES LIGNEES DE PEUPLIERS TRANSGENIQUES SOUS-EXPRIMANT UGT72A2 ............................................ 25 4.2.1. Phénotype global d’une lignée sous-exprimant UGT72A2 comparé au WT .................................. 25 4.2.2. Phénotype de sénescence précoce des feuilles de peupliers sous-exprimant RNAi500-04............ 26 4.2.3. Activité de la phénylalanine ammonia-lyase (PAL) ....................................................................... 27 4.2.4. Mesure de la concentration en anthocyanes ................................................................................ 28 4.3. ETUDE DES PROCESSUS ASSOCIÉS À UNE SÉNESCENCE DÉVELOPPEMENTALE ......................................................... 29 4.3.1. Mesure de la concentration relative en chlorophylle .................................................................... 29 4.3.2. Détermination de la concentration absolue en chlorophylle ......................................................... 30 4.3.3. Analyse du niveau d’expression des différents gènes marqueurs de la sénescence ...................... 31 4.3.3.1. SAG12 .................................................................................................................................................. 31 4.3.3.2. SAG 13 ................................................................................................................................................. 32 4.3.3.3. EIN3 ..................................................................................................................................................... 32 4.3.3.4. REV ...................................................................................................................................................... 33 4.3.4. Analyse de l’activité du protéasome 20S ....................................................................................... 34 4.4. STRESS OXYDATIF .................................................................................................................................... 35 4.4.1. Détermination du pouvoir antioxydant par la méthode DPPH ...................................................... 35 4.4.2. Dosage des polyphénols totaux ..................................................................................................... 37 4.4.3. Activité des peroxydases solubles .................................................................................................. 38 4.4.4. Peroxydation des lipides ................................................................................................................ 38 4.5. SELECTION DE LIGNEES SUR-EXPRIMANT UGT72A2....................................................................................... 39 5.DISCUSSION ........................................................................................................................................................ 41 5.1. LOCALISATION DE L’EXPRESSION DE UGT72A2 ............................................................................................. 41 5.2. LE PHENOTYPE FOLIAIRE OBSERVE CHEZ LES LIGNEES RNAI500-04 NE SEMBLE PAS LIE A UNE SENESCENCE DEVELOPPEMENTALE. ............................................................................................................................................. 41 5.3. LE PHENOTYPE FOLIAIRE OBSERVE PEUT ETRE ASSOCIE A UNE BAISSE DE PIGMENTS................................................ 42 5.4. L’AUGMENTATION DE L’ACTIVITE PAL DANS LA LIGNEE RNAI500-04 SUGGERE UN STRESS OXYDATIF. ..................... 42 5.5. PROTEASOME 20S .................................................................................................................................. 42 5.6. STRESS OXYDATIF .................................................................................................................................... 43 CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................................................................. 45 BIBLIOGRAPHIE ...................................................................................................................................................... 47 ANNEXES ................................................................................................................................................................ 49 ANNEXE N°1 : PROTOCOLE DE CULTURE IN VITRO ......................................................................................................... 49 ANNEXE N°2 : PROTOCOLE D’EXTRACTION D’ARN AVEC LE KIT AGILENT PLANT RNA ISOLATION MINI KIT ............................. 51 ANNEXE N°3 : PROTOCOLE REVERSE TRANSCRIPTASE AVEC LE KIT GOSCRIPT REVERSE TRANSCRIPTION MIX, OLIGO (DT) .......... 52 ANNEXE N°4 : PROTOCOLE QPCR AVEC LE KIT LUNA UNIVERSAL QPCR MASTER MIX ........................................................ 53 ANNEXE N°5 : AMORCE UTILISEE + REFERENCE GENE .................................................................................................... 54 ANNEXE N°6 : DOSAGE DE LA CHLOROPHYLLE ............................................................................................................. 54 ANNEXE N°7 : ACTIVITE PAL ................................................................................................................................... 55 ANNEXE N°8 : ACTIVITE PEROXYDASE ........................................................................................................................ 55 ANNEXE N°9 : PEROXYDATION DES LIPIDES ................................................................................................................. 56 ANNEXE N°10 : PROTOCOLE WESTERN BLOT SEMI-DRY ................................................................................................ 57 ANNEXE N°11 : PROTOCOLE DE DOSAGE DU POUVOIR ANTIOXYDANT PAR LA METHODE DPPH ............................................. 59 ANNEXE N°12 : DOSAGE DES POLYPHENOLS TOTAUX PAR LA METHODE DE FOLIN-CIOCALTEU............................................... 61 ANNEXE N°13 : COLORATION GUS .......................................................................................................................... 62 ANNEXE N°14 : PROTOCOLE BRADFORD .................................................................................................................... 63 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79722 Etude des voies de sénescence induites lors de la sous-expression de UGT72A2 chez le peuplier [TFE / Mémoire] / Rémy Demer, Auteur ; Jenny Pouyez, Directeur de publication, rédacteur en chef . - 2019. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : Agronomie  AIBT Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Note de contenu : Table des matières REMERCIEMENTS ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 2 INTRODUCTION ........................................................................................................................................................ 9 1.INTRODUCTION THEORIQUE ............................................................................................................................... 11 1.1. LE PEUPLIER ........................................................................................................................................... 11 1.2. LES GLYCOSYLTRANSFERASES ..................................................................................................................... 11 1.3. LES UGT DE LA FAMILLE UGT72 ............................................................................................................... 12 1.4. IMPORTANCE DE LA SENESCENCE POUR LES ARBRES ........................................................................................ 13 1.5. SENESCENCE EN GENERAL ; PROCESSUS GENETIQUES, BIOCHIMIQUES ET DEVELOPPEMENTAUX ................................ 13 1.6. GENES ASSOCIES A LA SENESCENCE ............................................................................................................. 15 2.OBJECTIF DU TRAVAIL DE FIN D’ETUDE ............................................................................................................... 16 3.MATERIEL ET METHODES .................................................................................................................................... 17 3.1. MATERIEL BIOLOGIQUE ............................................................................................................................ 17 3.2. CULTURE IN VITRO ................................................................................................................................... 17 3.3. MATERIEL PRELEVE POUR LA CARACTERISATION DU PHENOTYPE DE SENESCENCE DANS LES LIGNEES RNAI500 ET WT . 18 3.4. EXTRACTION D’ARN DE FEUILLES DE PEUPLIER .............................................................................................. 19 3.5. LA TRANSCRIPTION INVERSE (RT) ............................................................................................................... 19 3.6. QPCR ................................................................................................................................................... 20 3.7. DOSAGE DE LA CHLOROPHYLLE ET DES CAROTENOIDES .................................................................................... 20 3.8. ACTIVITE PAL (PHENYLALANINE AMMONIA-LYASE) ........................................................................................ 20 3.9. ACTIVITE PEROXYDASE .............................................................................................................................. 21 3.10. PEROXYDATION DES LIPIDES....................................................................................................................... 22 3.11. ACTIVITE DU PROTEASOME 20S ................................................................................................................. 22 3.12. MESURE DU POUVOIR OXYDANT ................................................................................................................. 23 3.13. MESURE DE LA TENEUR EN POLYPHENOLS TOTAUX ......................................................................................... 23 3.14. TEST HISTOCHIMIQUE GUS ....................................................................................................................... 24 4.ANALYSE DES RESULTATS .................................................................................................................................... 25 4.1. CARACTERISATION DE L’EXPRESSION DU GENE UGT72A2 ............................................................................... 25 4.2. ANALYSE DES LIGNEES DE PEUPLIERS TRANSGENIQUES SOUS-EXPRIMANT UGT72A2 ............................................ 25 4.2.1. Phénotype global d’une lignée sous-exprimant UGT72A2 comparé au WT .................................. 25 4.2.2. Phénotype de sénescence précoce des feuilles de peupliers sous-exprimant RNAi500-04............ 26 4.2.3. Activité de la phénylalanine ammonia-lyase (PAL) ....................................................................... 27 4.2.4. Mesure de la concentration en anthocyanes ................................................................................ 28 4.3. ETUDE DES PROCESSUS ASSOCIÉS À UNE SÉNESCENCE DÉVELOPPEMENTALE ......................................................... 29 4.3.1. Mesure de la concentration relative en chlorophylle .................................................................... 29 4.3.2. Détermination de la concentration absolue en chlorophylle ......................................................... 30 4.3.3. Analyse du niveau d’expression des différents gènes marqueurs de la sénescence ...................... 31 4.3.3.1. SAG12 .................................................................................................................................................. 31 4.3.3.2. SAG 13 ................................................................................................................................................. 32 4.3.3.3. EIN3 ..................................................................................................................................................... 32 4.3.3.4. REV ...................................................................................................................................................... 33 4.3.4. Analyse de l’activité du protéasome 20S ....................................................................................... 34 4.4. STRESS OXYDATIF .................................................................................................................................... 35 4.4.1. Détermination du pouvoir antioxydant par la méthode DPPH ...................................................... 35 4.4.2. Dosage des polyphénols totaux ..................................................................................................... 37 4.4.3. Activité des peroxydases solubles .................................................................................................. 38 4.4.4. Peroxydation des lipides ................................................................................................................ 38 4.5. SELECTION DE LIGNEES SUR-EXPRIMANT UGT72A2....................................................................................... 39 5.DISCUSSION ........................................................................................................................................................ 41 5.1. LOCALISATION DE L’EXPRESSION DE UGT72A2 ............................................................................................. 41 5.2. LE PHENOTYPE FOLIAIRE OBSERVE CHEZ LES LIGNEES RNAI500-04 NE SEMBLE PAS LIE A UNE SENESCENCE DEVELOPPEMENTALE. ............................................................................................................................................. 41 5.3. LE PHENOTYPE FOLIAIRE OBSERVE PEUT ETRE ASSOCIE A UNE BAISSE DE PIGMENTS................................................ 42 5.4. L’AUGMENTATION DE L’ACTIVITE PAL DANS LA LIGNEE RNAI500-04 SUGGERE UN STRESS OXYDATIF. ..................... 42 5.5. PROTEASOME 20S .................................................................................................................................. 42 5.6. STRESS OXYDATIF .................................................................................................................................... 43 CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................................................................. 45 BIBLIOGRAPHIE ...................................................................................................................................................... 47 ANNEXES ................................................................................................................................................................ 49 ANNEXE N°1 : PROTOCOLE DE CULTURE IN VITRO ......................................................................................................... 49 ANNEXE N°2 : PROTOCOLE D’EXTRACTION D’ARN AVEC LE KIT AGILENT PLANT RNA ISOLATION MINI KIT ............................. 51 ANNEXE N°3 : PROTOCOLE REVERSE TRANSCRIPTASE AVEC LE KIT GOSCRIPT REVERSE TRANSCRIPTION MIX, OLIGO (DT) .......... 52 ANNEXE N°4 : PROTOCOLE QPCR AVEC LE KIT LUNA UNIVERSAL QPCR MASTER MIX ........................................................ 53 ANNEXE N°5 : AMORCE UTILISEE + REFERENCE GENE .................................................................................................... 54 ANNEXE N°6 : DOSAGE DE LA CHLOROPHYLLE ............................................................................................................. 54 ANNEXE N°7 : ACTIVITE PAL ................................................................................................................................... 55 ANNEXE N°8 : ACTIVITE PEROXYDASE ........................................................................................................................ 55 ANNEXE N°9 : PEROXYDATION DES LIPIDES ................................................................................................................. 56 ANNEXE N°10 : PROTOCOLE WESTERN BLOT SEMI-DRY ................................................................................................ 57 ANNEXE N°11 : PROTOCOLE DE DOSAGE DU POUVOIR ANTIOXYDANT PAR LA METHODE DPPH ............................................. 59 ANNEXE N°12 : DOSAGE DES POLYPHENOLS TOTAUX PAR LA METHODE DE FOLIN-CIOCALTEU............................................... 61 ANNEXE N°13 : COLORATION GUS .......................................................................................................................... 62 ANNEXE N°14 : PROTOCOLE BRADFORD .................................................................................................................... 63 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79722

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